技术摘要：
本发明公开一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，属于微流控技术领域。本发明的整合型微流控芯片包括从上至下依次连接的上层芯片、中层芯片和底层芯片，上层芯片内的第一微柱阵列实现对循环肿瘤细胞的一次捕获，中层芯片内设置的引流通道用于将血样从上  全部
背景技术：
癌症是威胁人类健康的第一大疾病。2018年全球新增1810万癌症病例，死亡人数 达960万，2018年全球几乎一半的新发癌症病例及超过一半的癌症死亡病例都发生在亚洲， 这是因为该地区有着全球几乎60％的人口。全球癌症病例迅猛增长之势使得如何缓解和治 疗肿瘤已成为我国乃至世界人口生命与健康领域急待解决的重大问题。传统的治疗方法诸 如手术切除、化疗、放射线治疗、免疫治疗、单克隆抗体治疗或其他方法成本高，给病人带来 较大痛苦。而90％以上的肿瘤患者死于肿瘤的转移。循环肿瘤细胞(CTCs)是从实体瘤或转 移灶脱落，进入外周血液循环的恶性肿瘤细胞，是肿瘤发生转移的必要前提。并且CTCs的数 目与癌症的严重程度有着密切的联系。数量多，则意味着病情的加重，数量少，则意味着病 情的减缓与好转。CTCs检测在新的肿瘤生物标志物的发现，肿瘤预后判断及个体化治疗方 面存在很大的应用潜力。百万数以十亿的血细胞中仅有1～10个CTCs，CTCs的分离必须满足 高捕获率，高纯度、高通量和高活性，进而满足临床的需求。 CellSearch是目前唯一应用于临床的通过美国食品和药品监督管理局(FDA)认证 的CTCs检测技术。CellSearch系统通过连接了抗上皮细胞粘附分子抗体的磁珠和CTCs表面 标志物的特异结合，达到捕获CTCs的目的。但该系统存在半自动化、成本高、效率不高的缺 陷。微流控芯片是集样品制备、反应、分离、检测等在一块微米尺度的芯片上，自动完成分析 全过程，具有体积小，消耗试样和试剂少，分析速度高的特点，是一种非侵入性的新型诊断 工具。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法可分为两类：一类利用抗原抗体的 特异性相结合的亲和性(Affinicity  reaction)原理进行细胞的捕获与分离，在芯片的微 通道或微结构上修饰能够与靶细胞表面抗原结合的特异性抗体或适配体如上皮粘附分子 (EpCAM)。2007年来自美国的MassGeneral  Hospital和Harvard  Medical  School的Sunitha  Nagrath在Nature中报道了使用微柱的微流控芯片捕获CTCs。在载玻片尺寸的硅片上，排列 了包被上皮粘附分子抗体的78000个微圆柱，病人的血样通入后，与表面密致支持物接触， 碰撞。被EpCAM抗体高效捕获的细胞被确认为CTCs。 人类在45岁之前，超过90％的肿瘤均源于上皮细胞。但在不同的肿瘤细胞中， EpCAM的表达各有不同。而且当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表 达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细 胞。另一类是依赖于物理特性比如大小尺寸形变性进行捕获的，利用CTCs比血细胞大且不 易形变的特征，滤过血细胞。例如Abnova公司的ClearCell  CXSystem就是基于大小形变的 原理设计制造而成。三个间距为5微米的圆柱构成一个“爪形”结构，重复排列。捕获住肿瘤 细胞，白细胞与红细胞则通过形变滤过。 为了提高循环肿瘤细胞的捕获率，发明人此前基于微流控技术设计一种双层微流 3 CN 111548912 A 说　明　书 2/7 页 控芯片，专利申请号：2019111984647，申请日：2019年11月29日，发明创造名称为：一种用于 捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，该方案的双层微流控芯片包括上下对应设置且相互 连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片和下层芯片内均设有微柱阵列以实现对肿瘤细胞的 多次捕获；且下层芯片内还设有碗形结构以聚集肿瘤细胞，当利用激光检测富集CTCs的特 征光谱时信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征，可以根据需 求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被 遗漏。 虽然该双层芯片能够结合多种捕获方法，并具有较高的循环肿瘤细胞捕获率，但 是富集于碗形结构处的循环肿瘤细胞数量有限，且由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部 分，所以一部分CTCs可能会通过微柱间隙。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性程 度更高，且容易破裂和纯度不高。而且该方案中的微流控芯片通量低，一旦通量提高，就可 能漏掉一部分CTCs挤压通过微柱间隙。 1ml的血液中仅有1～10个肿瘤细胞却有107个白细胞和109个红细胞，如何检测到 病人血样中的每一个肿瘤细胞有着重要的意义。这就要求近100％的捕获率，即高敏感性； 高纯度，即分离到的CTCs没有血细胞，便于将捕获住的肿瘤细胞从微流控芯片上洗释下来 作进一步的孵育与生物基因分析；高通量，临床使用的血样是7.5ml，而目前绝大多数芯片 的流速是1ml/hr，远不能满足临床的需求。 综上所述，如何针对现有技术中微流控芯片通量较低、富集肿瘤细胞数量及纯度 不够导致检测过程不够准确的不足，是现有技术亟需解决的技术难题。
技术实现要素：
1.发明要解决的技术问题 本发明克服现有技术中微流控芯片通量较低、富集肿瘤细胞数量及纯度不够导致 检测过程不够准确的不足，提供一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，上 层芯片内实现对循环肿瘤细胞的一次捕获，中层芯片内将血样从上层芯片引入底层芯片的 中心，使血样呈放射状涌入U型微柱单元进行二次捕获，流体通量非常大，血样流速快，循环 肿瘤细胞捕获率高。 2.技术方案 为达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 本发明的一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，包括从上至下 依次连接的上层芯片、中层芯片和底层芯片，上层芯片上由内向外分别设有上层入口、第一 通道和上层出口，第一通道内设有用于捕获循环肿瘤细胞的第一微柱阵列，相邻两个微柱 之间的最小间距不大于8微米；中层芯片上设有引流通道，引流通道用于将第一通道中的血 样引入底层芯片；底层芯片上由内向外分别设有连通引流通道的底层入口、用于孵育循环 肿瘤细胞的第二通道、以及底层出口，第二通道内设有由内向外呈放射状分布的U型微柱单 元，相邻两个U型微柱单元之间形成用于捕获循环肿瘤细胞的微流通道，该微流通道的宽度 不大于5微米。 作为本发明更进一步的改进，在底层芯片上开设圆形凹槽形成第二通道，U型微柱 单元沿圆形凹槽的周向等间距阵列分布，相邻两个U型微柱单元之间形成的微流通道宽度 4 CN 111548912 A 说　明　书 3/7 页 为5微米。 作为本发明更进一步的改进，U型微柱单元包括至少两个相对设置的椭圆形微柱， 以及弧形微柱，椭圆形微柱相对底层入口设置，弧形微柱相对底层出口设置，椭圆形微柱与 弧形微柱之间形成的间隙不大于5微米。 作为本发明更进一步的改进，U型微柱单元沿圆形凹槽的径向等间距阵列分布。 作为本发明更进一步的改进，第二通道与底层出口之间还设有第三通道。 作为本发明更进一步的改进，第一通道以上层入口为中心向外延伸形成螺旋形通 道，上层出口与该螺旋形的第一通道末端连通。 作为本发明更进一步的改进，中层芯片上由外向内分别设置用于连通引流通道的 中层入口和中层出口，中层入口与上层出口连通，中层出口与底层入口连通。 作为本发明更进一步的改进，引流通道为圆柱形通道，且该引流通道的宽度不小 于100微米。 作为本发明更进一步的改进，第一微柱阵列位于上层入口的一端与第一通道外侧 相贴合，第一微柱阵列位于上层出口的一端与第一通道内侧相贴合，第一微柱阵列与第一 通道基本平行。 作为本发明更进一步的改进，第一微柱阵列包括内侧微柱和外侧微柱，内侧微柱 和/或外侧微柱的横截面为多边形或弧形。 3.有益效果 采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果： (1)本发明的一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，包括从上至 下依次连接的上层芯片、中层芯片和底层芯片，上层芯片内的第一微柱阵列实现对循环肿 瘤细胞的一次捕获，中层芯片内设置的引流通道用于将血样从上层芯片引入底层芯片的中 心，使血样呈放射状涌入U型微柱单元进行二次捕获，放射状分布的U型微柱单元使得流体 通量非常大，血样流速快，循环肿瘤细胞捕获率高。 (2)本发明的一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，在底层芯片 上开设圆形凹槽形成第二通道，U型微柱单元沿圆形凹槽的周向和径向分别等间距阵列分 布，圆形凹槽形成的第二通道与放射状的U型微柱单元确保血样流动时的较小阻力，血样在 芯片内快速高效地实现分离，同时圆形凹槽的设计也提高了血样检测通量，结合上层芯片 的螺旋形第一通道，大大提高微流控芯片的测试通量，利用本发明的整合型微流控芯片，可 快速完成7.5ml的临床血样检测。 (3)本发明的一种用于捕获、孵育循环肿瘤细胞的整合型微流控芯片，U型微柱单 元用于捕获孵育循环肿瘤细胞，得到的循环肿瘤细胞活性大，检测结果准确；本发明的微流 控芯片在捕获循环肿瘤细胞的基础上，亦可实现循环肿瘤细胞捕获后的培养，从而使整合 型微流控芯片集捕获功能和孵育功能于一体化。 附图说明 图1为本发明中上层芯片的结构示意图； 图2为本发明中第一微柱阵列(三角形微柱)的结构示意图； 图3为本发明中第一微柱阵列(正方形微柱与梯形微柱)的结构示意图； 5 CN 111548912 A 说　明　书 4/7 页 图4为本发明中第一微柱阵列(半圆正方形微柱与正方形微柱)的结构示意图； 图5为本发明中中层芯片的结构示意图； 图6为本发明中底层芯片的结构示意图。 附图标记： 100、上层芯片；110、第一通道；111、上层入口；112、上层出口；113、第一通道内侧； 114、第一通道外侧；120、第一微柱阵列；121、内侧微柱；122、外侧微柱； 200、中层芯片；210、引流通道；211、中层入口；212、中层出口； 300、底层芯片；310、第二通道；311、底层入口；312、底层出口；313、第三通道；320、 U型微柱单元；321、弧形微柱；322、椭圆形微柱。