技术摘要：
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种用于稳定表达NFAT的细胞株、合成方法及其应用，所述用于稳定表达NFAT的细胞株的合成方法包括：细胞传代培养、转染试剂制备、转染、继续培养、扩增、筛选和鉴定。通过本发明提供的用于稳定表达NFAT的细胞株的合成方法能够得到用  全部
背景技术：
目前，活化T细胞核因子(nuclear  factor  of  activated  T  cells，NFAT)是一类 转录因子家族，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。除T细胞外，这类蛋白质还可以 在许多免疫细胞上进行表达，如B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等。其活性受到钙离子 依赖性的钙调蛋白磷酸酯酶C的调节。 NFAT是具有多向调节功能的转录因子，如调节T细胞的活化，分化及自身耐受性 等。NFAT在多种免疫细胞均有表达，如T细胞，B细胞，NK细胞，肥大细胞，单核细胞和嗜酸性 粒细胞等，在机体免疫应答中诱导细胞因子及其他基因的转录。多项研究表明，支气管哮 喘，阿尔茨海默病，炎症性肠病，糖尿病，骨质疏松，骨关节炎，心肌炎等多种急慢性疾病的 发生都与NFAT的活化相关，因而日益受到重视。但现有技术中有关用于稳定表达NFAT的细 胞株及其合成方法尚未见报道；同时，现有的根据荧光染色技术进行细胞鉴定的方法准确 性不高。 通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中有关用于稳定表达 NFAT的细胞株及其合成方法尚未见报道；同时，现有的根据荧光染色技术进行细胞鉴定的 方法准确性不高。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于稳定表达NFAT的细胞株、合成 方法及其应用。 本发明是这样实现的，一种用于稳定表达NFAT的细胞株的合成方法，所述用于稳 定表达NFAT的细胞株的合成方法包括以下步骤： 步骤一，细胞传代培养：向35mm培养皿中加入2mL含1～2×105个细胞的细胞培养 液，置于CO2培养箱内并于37℃条件下培养至40％～60％细胞汇合； 步骤二，转染试剂制备：将400ul去核酸酶水加入聚苯乙稀管中，震荡10～15s溶解 脂状物后添加细胞活性保护剂，再次震荡5～10s，室温下静置10-15min； 步骤三，转染：在转染管中分别加入转染试剂、含待转染细胞的培养液和细胞活性 保护剂，摇匀，通过脂质体转染shRNA-NFAT和pLXSN-NFAT； 步骤四，继续培养：将步骤三得到的混合液置于37℃温箱中培养12～24h后，吸除 剩余转染试剂，换入正常细胞培养液继续培养6～8h； 步骤五，扩增：利用选择压力富集整合转染后的细胞，并通过PCR技术进行扩增，得 到待筛选鉴定稳定表达NFAT的细胞株； 步骤六，筛选：通过GS筛选系统利用细胞中的谷氨酰胺合成酶进行扩增后细胞的 4 CN 111575318 A 说　明　书 2/4 页 筛选，得到基因高度扩增的细胞株； 步骤七，鉴定：通过细胞株鉴定系统在步骤六得到的基因高度扩增的细胞株中鉴 定并得到稳定表达NFAT的细胞株。 进一步，步骤一中，所述所述细胞培养液包含层粘连蛋白、胶原、明胶、纤维连接蛋 白、玻连蛋白、钙粘着蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、合成生物聚合物或它们的片 段中的一种或多种。 进一步，步骤二中，所述转染试剂制备完成后置于-20℃条件下保存；使用前需震 荡。 进一步，步骤三中，所述脂质体转染过程中的细胞活性保护剂含有以下组分：终浓 度为5～15mmol/L的维生素A，终浓度为10～20g/L的甘油，终浓度为20～40g/L的葡萄糖，终 浓度为10～25g/L的人血白蛋白。 进一步，所述细胞保护剂的pH值为7.0～7.5。 进一步，步骤七中，所述在基因高度扩增的细胞株中鉴定稳定表达NFAT的细胞株 的方法，包括： (1)获取多个待鉴定细胞株的细胞图层图像，每一张细胞图层图像相关于所述细 胞的细胞膜、细胞质，及细胞核其中至少一者； (2)将所述细胞图层图像合成为包括所述细胞图像的细胞合成图像，并根据筛选 条件从所述待鉴定细胞中筛选出多个候选细胞； (3)利用所述候选细胞数据对该细胞图层图像进行特征撷取而获得多个分别相关 于所述候选细胞的细胞膜及细胞核的特征值； (4)根据多个所述细胞图层图像的所述细胞膜特征值及所述细胞图层图像的所述 细胞核特征值，决定出每一个候选细胞为目标细胞或是非目标细胞。 进一步，所述筛选条件为：所述候选细胞的图像的像素数目大于默认值。 进一步，所述从所述待鉴定细胞中筛选出多个候选细胞的方法，包括： 根据所述细胞合成图像的背景的多个像素二值化所述细胞合成图像； 根据二值化的所述细胞合成图像及默认值获得所述候选细胞与所述候选细胞数 据，其中每一个候选细胞的像素数目大于所述默认值。 本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于稳定表达NFAT的细胞株的合成 方法合成的用于稳定表达NFAT的细胞株。 本发明的另一目的在于提供一种所述的用于稳定表达NFAT的细胞株在表达NFAT 中的应用。 结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：通过本发明提供 的用于稳定表达NFAT的细胞株的合成方法能够得到用于稳定表达NFAT的细胞株，且该合成 方法简单、普适性强。同时，借由所述系统利用所述候选细胞数据对该细胞图层图像进行特 征撷取，以获得所述细胞膜特征值及所述细胞核特征值，并根据所述细胞膜特征值，及所述 细胞核特征值，将所述候选细胞分类成目标细胞及非目标细胞，针对细胞特有的型态进行 分类以提高细胞鉴定的准确性。 5 CN 111575318 A 说　明　书 3/4 页 附图说明 图1是本发明实施例提供的用于稳定表达NFAT的细胞株的合成方法流程图。 图2是本发明实施例提供的基因高度扩增的细胞株中鉴定稳定表达NFAT的细胞株 的方法流程图。 图3是本发明实施例提供的从所述待鉴定细胞中筛选出多个候选细胞的方法流程 图。