技术摘要：
本发明公开了一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法，该RNA标准物质利用噬菌体MS2衣壳蛋白能够抵抗外界环境中核糖核酸酶的降解，对其内部RNA片段起保护作的特性。采用原核表达技术表达MS2噬菌体衣壳蛋白包装汉城病毒部分片段基因，制备成稳定、基于汉城 全部
背景技术：
近年来，由汉城病毒引发的人感染肾综合征出血热常有报道，已经成为重要的公 共卫生问题；汉城病毒(Seoul virus)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属 (Hantaan virus)。汉城病毒的主要宿主是褐家鼠，在我国，黑家鼠、黄胸鼠以及小家鼠均能 携带汉城病毒。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家，肾综合征出血热发病人数占世界 报道病例的90％以上。1981年中国河南和山西交界地区爆发汉城病毒引起的出血热疫情。 而且汉城病毒是唯一呈世界性分布的汉坦病毒，在亚洲、欧洲、非洲以及南北美洲均发现汉 城病毒的存在。宿主动物鼠类所携带的汉城病毒会通过粪便、尿、唾液或者血液进人破损的 皮肤和粘膜、呼吸道以及消化道将病毒传播给人，或者通过蚤、螨等叮咬人导致感染。以PCR 技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，同时利用PCR检测技术对检 测结果进行分子流行病学分析可以得到汉城病毒的宿主流行情况，有助于对肾综合征出血 热的流行进行防控。 核酸检测必须使用质控品进行质量控制，目前RNA病毒的质控品主要是病毒颗粒、 裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗。目前，汉坦病毒有减毒活 疫苗Z37株。但由于病毒制备需在高规格生物安全实验室内进行，同时由于运输保存的限 制，使其作为质控标准物质。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成 RNA或DNA，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解，DNA模板无法参与核酸提取过程和反转 录过程，不能对检测的全过程进行监控。目前，以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因 其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点。大肠杆菌MS2噬菌体包膜蛋白 与操纵子RNA序列有特异性的相互作用，在噬菌体外壳组装的同时将噬菌体基因RNA包装到 包膜内，而噬菌体的外壳可以耐受RNase，因此将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达 载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒，具备RNase抗 性便于存储和运输。 因此，一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法亟待提出。
技术实现要素：
为解决现有质控样品或标准物质的不足，本发明提供一种内含汉城病毒G2蛋白基 因装甲RNA标准物质及制备方法，具有稳定、安全、耐核糖核酸等特点，可用于汉城病毒检测 的质量控制。 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案： 本发明的第一目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，其特征 在于，该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2CP蛋白序列片段以 4 CN 111575307 A 说 明 书 2/5 页 及汉城病毒G2蛋白序列片段；汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核 表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。 本发明的第二目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，所述装 甲RNA标准物质由以下方法制备而成： S1、噬菌体MS2 CP蛋白基因扩增：根据噬菌体MS2 CP基因序列设计一对特异性引 物CP P1和CP P2，所述引物序列如下所示： 引物CP P1：5’-GCGGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG-3’； 引物CP P2：5’-TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC-3’； 以MS2噬菌体序列片段质粒为载体，使用引物CP P1和引物CP P2通过PCR扩增出 MS2噬菌体基因序列MS2 CP，其序列如SEQ ID NO:3所示； S2、表达载体pET32a-CP的获得：将PCR扩增产物和原核表达载体pET-32a用BamHI 和Not I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，连接后 转化DH5α菌株，获得表达载体pET32a-CP； S3、汉城病毒G2蛋白片段基因序列的获得：人工合成汉城病毒G2基因组序列，其序 列如SEQ ID NO:4所示，并在序列的5’端和3’端分别插入BamHI、Not I酶切位点，酶切后连 着至pBluescript II SK 质粒载体中，获得目的序列片段pBSK-G2； S4、表达质粒pBSK-G2的获得：将pET32a-CP和pBSK-G2均使用BamHI、Not I双酶切， 1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得汉城 病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2。 S5、汉城病毒装甲RNA获得：将汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠 杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中MS2噬菌体基因序列MS2 CP包括MS2噬 菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因 部分序列并对部分序列进行优化调整；在引物CP P1序列的5’端和引物CP P2序列的3’端分 别插入Kpn I、BamHI酶切位点。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中PCR反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X PCR Buffer 2μL、2.5mM each的dNTP 1 .6μL、5U/μL的rTaq0.4μL、Mgcl2 1 .2μL、 20pmol/L的引物CP P1合伙引物CP P2 1μL、DDW 11.8μL、质粒pUC18-MS2 1μL；反应条件依 次为94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，72℃7min。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中酶切反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Kpn I 1μL、PCR产物和 pET32a质粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h； 步骤S2中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、CP 8μL、 pET32a 2μ，4℃过夜反应。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4具体包括以下方法：将汉城病毒装甲RNA 表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，阳性克隆转接种2mL含Amp 100 μg/mL的LB液体培养基37℃过夜培养，1:100比例转接种2mL 2×YT液体培养基，37℃200rpm 摇4h后，加1mM IPTG，诱导5h后，终止培养；离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，得到 粗制的病毒样颗粒。 5 CN 111575307 A 说 明 书 3/5 页 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4中酶切反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Not I 1μL、0.1％BSA 1μL， 质粒10μL，DDW 6μL，37℃酶切3h； 步骤S4中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、pET32a-CP 2μ L、G2 8μL，4℃过夜反应。 本发明的有益效果是：与现有的RNA质控品相比较，本发明的优点在于该装甲RNA 的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋 白序列片段。噬菌体MS2包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，可以在噬菌体外壳 组装室将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此将特定RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包裹蛋 白基因序列cDNA下游，噬菌体包膜蛋白组装外壳时将插入的RNA序列的部分噬菌体基因组 包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。与现有的RNA质控品相比较，本发明制备的汉城病 毒装甲RNA标准物质，具备稳定、无生物安全危害、耐RNase酶降解等特点，便于储存、运输和 使用，可对汉城病毒检测的病毒提取、RT-PCR全过程进行质量控制，操作简单、安全有效。
本发明公开了一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法，该RNA标准物质利用噬菌体MS2衣壳蛋白能够抵抗外界环境中核糖核酸酶的降解，对其内部RNA片段起保护作的特性。采用原核表达技术表达MS2噬菌体衣壳蛋白包装汉城病毒部分片段基因，制备成稳定、基于汉城 全部
背景技术：
近年来，由汉城病毒引发的人感染肾综合征出血热常有报道，已经成为重要的公 共卫生问题；汉城病毒(Seoul virus)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属 (Hantaan virus)。汉城病毒的主要宿主是褐家鼠，在我国，黑家鼠、黄胸鼠以及小家鼠均能 携带汉城病毒。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家，肾综合征出血热发病人数占世界 报道病例的90％以上。1981年中国河南和山西交界地区爆发汉城病毒引起的出血热疫情。 而且汉城病毒是唯一呈世界性分布的汉坦病毒，在亚洲、欧洲、非洲以及南北美洲均发现汉 城病毒的存在。宿主动物鼠类所携带的汉城病毒会通过粪便、尿、唾液或者血液进人破损的 皮肤和粘膜、呼吸道以及消化道将病毒传播给人，或者通过蚤、螨等叮咬人导致感染。以PCR 技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，同时利用PCR检测技术对检 测结果进行分子流行病学分析可以得到汉城病毒的宿主流行情况，有助于对肾综合征出血 热的流行进行防控。 核酸检测必须使用质控品进行质量控制，目前RNA病毒的质控品主要是病毒颗粒、 裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗。目前，汉坦病毒有减毒活 疫苗Z37株。但由于病毒制备需在高规格生物安全实验室内进行，同时由于运输保存的限 制，使其作为质控标准物质。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成 RNA或DNA，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解，DNA模板无法参与核酸提取过程和反转 录过程，不能对检测的全过程进行监控。目前，以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因 其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点。大肠杆菌MS2噬菌体包膜蛋白 与操纵子RNA序列有特异性的相互作用，在噬菌体外壳组装的同时将噬菌体基因RNA包装到 包膜内，而噬菌体的外壳可以耐受RNase，因此将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达 载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒，具备RNase抗 性便于存储和运输。 因此，一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法亟待提出。
技术实现要素：
为解决现有质控样品或标准物质的不足，本发明提供一种内含汉城病毒G2蛋白基 因装甲RNA标准物质及制备方法，具有稳定、安全、耐核糖核酸等特点，可用于汉城病毒检测 的质量控制。 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案： 本发明的第一目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，其特征 在于，该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2CP蛋白序列片段以 4 CN 111575307 A 说 明 书 2/5 页 及汉城病毒G2蛋白序列片段；汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核 表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。 本发明的第二目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，所述装 甲RNA标准物质由以下方法制备而成： S1、噬菌体MS2 CP蛋白基因扩增：根据噬菌体MS2 CP基因序列设计一对特异性引 物CP P1和CP P2，所述引物序列如下所示： 引物CP P1：5’-GCGGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG-3’； 引物CP P2：5’-TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC-3’； 以MS2噬菌体序列片段质粒为载体，使用引物CP P1和引物CP P2通过PCR扩增出 MS2噬菌体基因序列MS2 CP，其序列如SEQ ID NO:3所示； S2、表达载体pET32a-CP的获得：将PCR扩增产物和原核表达载体pET-32a用BamHI 和Not I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，连接后 转化DH5α菌株，获得表达载体pET32a-CP； S3、汉城病毒G2蛋白片段基因序列的获得：人工合成汉城病毒G2基因组序列，其序 列如SEQ ID NO:4所示，并在序列的5’端和3’端分别插入BamHI、Not I酶切位点，酶切后连 着至pBluescript II SK 质粒载体中，获得目的序列片段pBSK-G2； S4、表达质粒pBSK-G2的获得：将pET32a-CP和pBSK-G2均使用BamHI、Not I双酶切， 1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得汉城 病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2。 S5、汉城病毒装甲RNA获得：将汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠 杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中MS2噬菌体基因序列MS2 CP包括MS2噬 菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因 部分序列并对部分序列进行优化调整；在引物CP P1序列的5’端和引物CP P2序列的3’端分 别插入Kpn I、BamHI酶切位点。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中PCR反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X PCR Buffer 2μL、2.5mM each的dNTP 1 .6μL、5U/μL的rTaq0.4μL、Mgcl2 1 .2μL、 20pmol/L的引物CP P1合伙引物CP P2 1μL、DDW 11.8μL、质粒pUC18-MS2 1μL；反应条件依 次为94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，72℃7min。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中酶切反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Kpn I 1μL、PCR产物和 pET32a质粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h； 步骤S2中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、CP 8μL、 pET32a 2μ，4℃过夜反应。 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4具体包括以下方法：将汉城病毒装甲RNA 表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，阳性克隆转接种2mL含Amp 100 μg/mL的LB液体培养基37℃过夜培养，1:100比例转接种2mL 2×YT液体培养基，37℃200rpm 摇4h后，加1mM IPTG，诱导5h后，终止培养；离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，得到 粗制的病毒样颗粒。 5 CN 111575307 A 说 明 书 3/5 页 作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4中酶切反应体系包含以下浓度的以下组 分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Not I 1μL、0.1％BSA 1μL， 质粒10μL，DDW 6μL，37℃酶切3h； 步骤S4中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、pET32a-CP 2μ L、G2 8μL，4℃过夜反应。 本发明的有益效果是：与现有的RNA质控品相比较，本发明的优点在于该装甲RNA 的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋 白序列片段。噬菌体MS2包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，可以在噬菌体外壳 组装室将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此将特定RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包裹蛋 白基因序列cDNA下游，噬菌体包膜蛋白组装外壳时将插入的RNA序列的部分噬菌体基因组 包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。与现有的RNA质控品相比较，本发明制备的汉城病 毒装甲RNA标准物质，具备稳定、无生物安全危害、耐RNase酶降解等特点，便于储存、运输和 使用，可对汉城病毒检测的病毒提取、RT-PCR全过程进行质量控制，操作简单、安全有效。
