技术摘要：
本发明公开了一种锌转运体8胰岛自身抗体（ZnT8A）的电化学发光检测试剂盒，属于生物医学检测技术领域。该试剂盒的检测原理是将经过标记的重组ZnT8抗原蛋白分子置于非放射性液相环境进行结合，血清中的ZnT8自身抗体在液相环境中与硫代钌衍生物活性酯标记的重组ZnT8胰岛  全部
背景技术：
1型糖尿病(type  1diabetes  mellitus ,T1DM)是遗传易感个体在某些环境因素 (病毒感染、营养等)触发下，由自身免疫介导的以胰岛β细胞损害为主要特征的器官特异性 自身免疫性疾病。胰岛自身抗体是目前T1DM胰岛β细胞自身免疫破坏的最可靠生物学标志， 对胰岛自身抗体的检测有助于了解T1DM的自身免疫病程，并对T1DM患者的诊断、鉴别诊断， 以及一般人群和患者一级亲属的风险预测有极大的价值。目前公认的胰岛自身抗体包括谷 氨酸脱酸酶抗体(glutamic  acid  decarboxylase-65autoantibodies,GADA)、蛋白酪氨酸 磷酸酶自身抗体(insulinoma  antigen  2autoantibodies ,IA-2A)、胰岛素自身抗体 (insulin  autoantibodies ,IAA)和锌转运体-8自身抗体(zinc  transporter- 8autoantibodies,ZnT8A)。 ZnT8特异性的表达在胰岛β细胞分泌囊泡膜上，通过将Zn2 从细胞质向富含胰岛素 的囊泡内聚集，参与胰岛素的成熟和储存。其自身抗体ZnT8A在T1DM患者中较早出现，2岁以 上患者中的阳性率随着年龄增长而增加，且稳定性高。在其他胰岛自身抗体均为阴性的以 T1DM临床特征起病的初诊糖尿病患者中有26％的患者ZnT8A呈阳性。因此，ZnT8A被认为是 独立于经典抗体、年龄、人类白细胞抗原(human  leukocyte  antigen,HLA)以外的T1DM标志 物，对GADA，IA2A和IAA有重要的补充作用，在传统抗体的基础上联合检测ZnT8A将大大提高 T1DM发病初期阳性抗体的检出率。 目前，ZnT8A的检测方法主要有酶联免疫吸附试验法(enzy m e - l i n k ed  immunosorbent  assay,ELISA)、化学发光法(chemiluminescent  immunoassay,CLIA)、荧光 素酶免疫沉淀法(luciferase  immunoprecipitation  system，LIPS)和放射免疫沉淀法 (radio-binding  assay,RBA)。从国际胰岛自身抗体标准化检测小组(islet  autoantibody  standardization  program,IASP)的随机盲测认证结果来看，不论是检测的敏感性还是特 异性，RBA-ZnT8A检测法均显著优于其他抗体检测法，是目前国际上唯一公认的ZnT8A检测 金标准。然而，RBA抗体检测方法由于放射性核素的使用，对临床推广工作带来了限制。CLIA 和LIPS法的检测灵敏度与RBA法接近，但可能存在非特异性荧光干扰等问题，影响了其检测 结果的特异性。
技术实现要素：
本发明针对现有RBA-ZnT8A检测法存在的由于使用放射性核素而限制临床推广这 一技术问题，提供了一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒，通过建立高敏 电化学法(ECL)用于ZnT8A检测，该方法具有较高的灵敏度和特异性，操作简便无放射污染， 具有很好的临床应用价值。 3 CN 111579791 A 说　明　书 2/9 页 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案： 一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒，包括：标记有生物素聚乙 二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白、标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋 白、链霉亲和素石墨烯平板和信号激发液； 所述重组ZnT8胰岛抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 进一步地，所述试剂盒还包括：pH  7.2～7.4的磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白。 进一步地，所述标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白是将重组 ZnT8胰岛抗原蛋白与生物素聚乙二醇活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。 进一步地，所述标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白是将重组 ZnT8胰岛抗原蛋白分别与硫代钌衍生物活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。 利用上述试剂盒检测样本中锌转运体8胰岛自身抗体的方法，包括以下步骤： 步骤1，将抗原缓冲液加至待测血清样本中，孵育，得到抗原-抗体复合物； 步骤2，用封闭液对链霉亲和素石墨烯平板进行封闭处理； 步骤3，将抗原-抗体复合物加至封闭后的链霉亲和素平板上，然后加入信号激发 液，通过MSD电化学发光仪检测硫代钌衍生物活性酯的发光信号，判断待测血清样本中是否 存在目标抗体以及目标抗体的含量； 所述抗原缓冲液是将标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白和 标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白加至抗原稀释液中得到，所述抗原稀 释液为5％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液。 进一步地，所述抗原缓冲液中标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原 蛋白和标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白的浓度比为：25～6400ng/mL: 25～6400ng/mL。 有益效果： 1、本发明中使用的重组ZnT8胰岛抗原蛋白由重组人ZnT8质粒经昆虫细胞系统表 达，在给予生物素聚乙二醇活性酯和硫代钌衍生物活性酯修饰和结合位点的同时，不改变 蛋白本身的自然结构域，因此极大的保持了ZnT8胰岛抗原蛋白与血清自身抗体结合反应的 关键生物基团活性。 2、与其他检测方法相比，本发明的ECL-ZnT8A基于电化学发光技术，信号分子硫代 钌衍生物活性酯需在电激发的情况下才能产生信号，因此整个实验流程无需避光，不受实 验操作人员技术水平差异的影响。 3、在实验完成加入所有液体后，并不会被激发出任何信号。只有送入仪器，通过电 极电激发后方才产生信号，每孔激发与信号采集时长统一，避免了像ELISA底物与终止液加 入顺序先后所导致的数据差异，数据稳定度极高。 4、与常规抗体检测法不同，进行第二抗体标记的抗人IgG抗体不用于胰岛特异性 抗体检测，从而避免了血清自身抗体测定中的高背景。 5、由于在ECL-ZnT8A测定中，标记的胰岛抗原蛋白能够捕获血清中所有类别的免 疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)，故相较于传统ZnT8A抗体检测法，ECL-ZnT8A具有更高的检 查灵敏度。 6、ECL-ZnT8A能有效检出更高亲和力、更高风险的疾病特异性胰岛自身抗体，降低 4 CN 111579791 A 说　明　书 3/9 页 由于交叉分子免疫反应引起的非疾病特异性低亲和力一过性抗体的假阳性率。 附图说明 图1为实施例1中标记前后ZnT8抗原蛋白的可有效的吸收阳性血清中的ZnT8A。 图2为实施例1中依据158例健康对照者血清ECL-ZnT8A指数的99％百分位数确定 阳性界值。 图3为实施例1中ECL-ZnT8A和RBA-ZnT8A检测ZnT8A指数的相关性(n＝120)。