技术摘要：
本发明涉及化学检测技术领域，提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法。本发明针对不同的结合雌激素成分，通过预处理和选择特征光谱波段，采用偏最小二乘法建立了各结合雌激素的定量分析校正模型。与HPLC法相比较，本发明提供的近红外光谱法  全部
背景技术：
结合雌激素是从孕马尿中提取的一种天然混合雌激素。临床上主要用于激素代替 疗法，缓解因雌激素不足引起的临床症状。每升孕马尿中富含雌激素的平均含量为70～ 130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素5～100g。 但在孕马尿的实际生产过程中，由于收集尿液的过程受到诸多方面的约束，其检 测多是采用离线操作、事后分析，因此，该检测过程存在很多缺陷。例如孕马尿中质控指标 成分的降解，无法及时反馈待测样品的含量参数等质量问题。费时费力，操作繁琐，分析结 果滞后等等情况均不利于孕马尿的质量控制。为了提高生产效率，迫切需要研究一种快速、 高效、准确、便利的分析检测方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法， 本发明提供的方法能够快速、高效、准确、便利地检测出孕马尿中结合雌激素的含量。 本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法， 包括以下步骤： (1)将孕马尿进行样品前处理，得到供试品溶液； (2)将所述供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据； (3)对步骤(2)采集的光谱数据进行预处理，然后进行波段选择，得到特征波段；采 用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归 拟合计算，建立校正模型； (4)按照步骤(2)的方法对未知的待测孕马尿供试品溶液进行近红外光谱扫描，将 得到的光谱数据导入步骤(3)建立的校正模型，得到孕马尿中结合雌激素的含量； 所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠中 的一种或多种。 优选的，所述步骤(1)中样品前处理包括以下步骤： (a)将孕马尿进行离心处理，得到上清液； (b)将所述上清液用水稀释后，与盐酸混合，得到盐酸溶液； (c)采用氢氧化钠水溶液调节所述盐酸溶液的pH值为7.0～8.0，然后依次经定容 和过滤，取滤液作为供试品溶液。 优选的，所述步骤(b)中上清液和水的体积比为1:5～15；所述盐酸的浓度为0.3～ 3mol/L，所述步骤(b)中上清液和盐酸的体积比为1～5:1。 5 CN 111579523 A 说　明　书 2/22 页 优选的，所述步骤(2)中近红外光谱扫描的参数包括： 采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000 ～4000cm-1，扫描次数为32～64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个供试品溶液重复扫描3 ～5次，取平均值作为光谱数据； 或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器： InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。 优选的，所述步骤(3)中预处理的方法包括：卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求 导、多元散射校正、标准正态变量变换、多元散射校正和归一化法中的一种或几种相结合的 方法。 优选的，所述预处理方法为二阶卷积求导的方法，窗口数为7～11，拟合次数为3 次。 优选的，所述步骤(3)中结合雌激素的真实含量值由高效液相色谱法对供试品溶 液进行测试得到，所述高效液相色谱法的测试参数为： 色谱柱：C18色谱柱； 色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm； 流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所 述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、 乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷 酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体 积比为3:7； 流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，A 相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～ 35min，A相体积分数稳定在70％； 流速：1.0mL/min； 柱温：40℃； 检测波长：205nm； 进样量：20μL； 不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。 优选的，所述步骤(3)中波段选择的方法包括全波长、相关系数法选择波长区间、 相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1、迭代优化波长选择方法2或迭代优化 波长选择方法3。 优选的，所述步骤(3)中波段选择的方法为相关系数法选择波长区间，阈值为0.2 ～0.3。 优选的，所述步骤(3)中不同结合雌激素的校正模型如表1所示。 有益效果： 本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法。 本发明针对不同的结合雌激素成分，通过预处理和选择特征光谱波段，采用偏最小二乘法 建立了各结合雌激素的定量分析校正模型。与HPLC法相比较，本发明提供的近红外光谱法 操作更为简便、快速，且适合大批量样本的含量测定，能够满足工业化生产中对大规模样本 6 CN 111579523 A 说　明　书 3/22 页 信息采集的需求，对药物生产过程及终端产品的稳定性可控都具有重要意义。实施例结果 表明，本发明提供的方法检测准确度较高，采用本发明提供的方法得到的预测值与真实值 的相对偏差小于15％，准确度较高。 附图说明 图1为本发明实施例1中孕马尿中结合雌激素的近红外光谱图(A：原始光谱，B：无 预处理；C：卷积平滑；D：一阶卷积求导；E：二阶卷积求导；F：标准正态变量变换；G：多元散射 校正；H：归一化法；I：一阶卷积求导 多元散射校正)； 图2为本发明实施例1中雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图； 图3为本发明实施例1中马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图； 图4为本发明实施例1中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图； 图5为本发明实施例1中总含量校正模型下的各参数图； 图6为本发明实施例1中雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图； 图7为本发明实施例1中马烯雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图； 图8为本发明实施例1中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图； 图9为本发明实施例1中总含量的真实值与预测值的关系图； 图10为本发明实施例2中雌酮硫酸钠的SEC/SECV与主因子数的变化趋势关系图； 图11为本发明实施例2中雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图。