技术摘要：
本发明涉及一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法，属于化学发光体外诊断技术领域。本发明的试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液；R3试剂为HAV抗原 全部
背景技术：
甲型病毒性肝炎简称甲肝，是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)感染引 起的以肝脏炎症病变为主的传染病。1974年feinstone SM等报告通过免疫电镜技术在甲型 肝炎病人粪便中发现甲型肝炎病毒。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有 VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。甲肝病毒感染多为自限性，严 重的可形成爆发性肝炎并导致死亡，甲肝的临床症状与感染者的年龄有关，6岁以下的儿 童，70％的感染都是无症状的，在年龄稍大的儿童和成人中，感染者多显示临床症状，其中 大部分病人都会出现黄疸。甲肝病毒的平均潜伏期是28天(从15到50天的范围)，典型的临 床症状包括发热、不舒服、厌食、呕吐、腹部不适等，这些症状通常不会超过2个月，其中最明 显的临床症状表现为黄疸，黄疸出现率为70％。在甲肝急性期病人的血清中可以查出抗- HAV IgM及IgG，临床病人于病后2周抗-HAV IgM阳性率为100％，持续2～3周，然后迅速下 降。在症状出现的前期，HAV抗体就能够被检测出来。感染甲型肝炎一旦发病，HAV总抗体即 为阳性，在自然感染之后，通常一生都会检测到HAV IgG抗体，且可以再次感染时起到二次 免疫效果。现今可以通过接种甲肝疫苗进行预防，在接种甲肝疫苗两周后就可以检测到HAV IgG抗体。HAV总抗体检测用于诊断过去或目前存在的甲型肝炎病毒感染，也可以观察接种 HAV疫苗之后的免疫效果。因此开发新型的、准确、快速、灵敏度高的甲型肝炎病毒总抗体测 定试剂盒对诊断甲型肝炎病毒感染意义重大。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法。本发明 的试剂盒使用磁珠包被抗原与化学发光物质体系，中和法检测血清、血浆中甲型肝炎病毒 总抗体的含量，具有较高的检测灵敏度，操作简单、检测准确、快速。 为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下： 本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、 校准品和质控品； 所述R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液； 所述R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，其中化学发光物质为 吖啶酯或吖啶酯衍生物； 所述R3试剂为HAV抗原溶液。 在上述技术方案中，优选的是：所述R1试剂包括0.01％～0.1％磁微粒包被的甲型 肝炎病毒抗体，粒径为1～3μm磁微粒，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0 .01％～0 .2％ 150mmol/L NaCl、和0.01％～0.2％proclin-300，pH6.0。 4 CN 111596061 A 说 明 书 2/15 页 在上述技术方案中，优选的是：所述R2试剂包括0.3μg/mL～2μg/mL化学发光物质 标记的甲型肝炎病毒抗体，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、 0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、及0.1％～2％BSA，pH6.0。 在上述技术方案中，优选的是：化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体中化学发 光物质与抗体标记的摩尔比例为1：1～20：1。 在上述技术方案中，优选的是：所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL HAV抗原，试剂 缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、 2mmol/L EDTA*2Na、0.1％～2％BSA、及0.1％～1％的浓度为10％的酪蛋白，pH6.0。 在上述技术方案中，优选的是：所述校准品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/ L；所述质控品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L。 本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤： 步骤1、R1试剂的制备 步骤1.1磁颗粒溶液的洗涤 取磁颗粒溶液，加入包被缓冲液稀释，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊， 弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入包被缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行 分离并重悬； 步骤1.2磁颗粒的活化过程 取洗涤好的磁颗粒，分次加入含EDC的活化缓冲液中，边加边混匀，加完后，置于血 液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；在活化 好的磁颗粒沉淀中加入包被缓冲液； 步骤1.3甲型肝炎病毒抗体的包被 取活化好的磁颗粒，加入甲型肝炎病毒抗体，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行 包被； 步骤1.4封闭 向上述包被物中，加入封闭缓冲液，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行封闭；将 封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀；再加入 包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑 浊，弃上清，留取磁颗粒，再加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放； 步骤1.5 R1试剂的制备 取上述步骤1.4制备的固相中间品和试剂缓冲液，配制成磁微粒包被的甲型肝炎 病毒抗体溶液，即为R1试剂； 步骤2、R2试剂的制备 步骤2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体的制备： 取甲型肝炎病毒抗体，超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心，然后 加入化学发光物质原液，混匀后进行标记；标记反应结束后，加入封闭缓冲液，进行封闭；封 闭后超滤离心，除去未偶联的化学发光物质，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存， 用于试剂配制； 步骤2.2、R2试剂的制备 取上述步骤2.1中制备的中间品和试剂缓冲液，配制成化学发光物质标记的甲型 5 CN 111596061 A 说 明 书 3/15 页 肝炎病毒抗体溶液，即为R2试剂； 步骤3、R3试剂的制备 取HAV抗原母液，使用缓冲液配置配制成R3试剂； 步骤4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备 配制高、低浓度的校准品，及高、低浓度的质控品。 在上述技术方案中，R1试剂的制备中：采用pH 6.5的20mM磷酸缓冲液为活化缓冲 液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；pH 7.0的磷酸缓冲液为包被缓 冲液，包被温度25℃，包被时间12h；pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液，封闭温度25℃， 封闭时间2h。 在上述技术方案中，R2试剂的制备中：标记的温度为37℃，时间为4h；封闭的时间 为1h。 本发明的有益效果是： 本发明的试剂盒采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。 本发明的试剂盒采用顺磁性的微粒作为固相载体，其比表面积大，提高了检测的 灵敏度。 本发明的试剂盒通过采用过量的HAV抗原中和HAV IgG和IgM，可以同时检测HAV IgG和IgM，检测结果完全可以代表HAV总抗体结果。 本发明的制备方法制备的试剂盒可直接用于全自动化学法光免疫分析仪上，无需 大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。
本发明涉及一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法，属于化学发光体外诊断技术领域。本发明的试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品和质控品；R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液；R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液；R3试剂为HAV抗原 全部
背景技术：
甲型病毒性肝炎简称甲肝，是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)感染引 起的以肝脏炎症病变为主的传染病。1974年feinstone SM等报告通过免疫电镜技术在甲型 肝炎病人粪便中发现甲型肝炎病毒。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有 VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。甲肝病毒感染多为自限性，严 重的可形成爆发性肝炎并导致死亡，甲肝的临床症状与感染者的年龄有关，6岁以下的儿 童，70％的感染都是无症状的，在年龄稍大的儿童和成人中，感染者多显示临床症状，其中 大部分病人都会出现黄疸。甲肝病毒的平均潜伏期是28天(从15到50天的范围)，典型的临 床症状包括发热、不舒服、厌食、呕吐、腹部不适等，这些症状通常不会超过2个月，其中最明 显的临床症状表现为黄疸，黄疸出现率为70％。在甲肝急性期病人的血清中可以查出抗- HAV IgM及IgG，临床病人于病后2周抗-HAV IgM阳性率为100％，持续2～3周，然后迅速下 降。在症状出现的前期，HAV抗体就能够被检测出来。感染甲型肝炎一旦发病，HAV总抗体即 为阳性，在自然感染之后，通常一生都会检测到HAV IgG抗体，且可以再次感染时起到二次 免疫效果。现今可以通过接种甲肝疫苗进行预防，在接种甲肝疫苗两周后就可以检测到HAV IgG抗体。HAV总抗体检测用于诊断过去或目前存在的甲型肝炎病毒感染，也可以观察接种 HAV疫苗之后的免疫效果。因此开发新型的、准确、快速、灵敏度高的甲型肝炎病毒总抗体测 定试剂盒对诊断甲型肝炎病毒感染意义重大。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒及其制备方法。本发明 的试剂盒使用磁珠包被抗原与化学发光物质体系，中和法检测血清、血浆中甲型肝炎病毒 总抗体的含量，具有较高的检测灵敏度，操作简单、检测准确、快速。 为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下： 本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂、 校准品和质控品； 所述R1试剂为磁微粒包被的甲型肝炎病毒抗体溶液； 所述R2试剂为化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体溶液，其中化学发光物质为 吖啶酯或吖啶酯衍生物； 所述R3试剂为HAV抗原溶液。 在上述技术方案中，优选的是：所述R1试剂包括0.01％～0.1％磁微粒包被的甲型 肝炎病毒抗体，粒径为1～3μm磁微粒，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0 .01％～0 .2％ 150mmol/L NaCl、和0.01％～0.2％proclin-300，pH6.0。 4 CN 111596061 A 说 明 书 2/15 页 在上述技术方案中，优选的是：所述R2试剂包括0.3μg/mL～2μg/mL化学发光物质 标记的甲型肝炎病毒抗体，试剂缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、 0.01％～0.2％proclin-300、2mmol/L EDTA*2Na、及0.1％～2％BSA，pH6.0。 在上述技术方案中，优选的是：化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体中化学发 光物质与抗体标记的摩尔比例为1：1～20：1。 在上述技术方案中，优选的是：所述R3试剂包括0.1μg/mL～2μg/mL HAV抗原，试剂 缓冲液为100mmol/L PB、0.01％～0.2％150mmol/L NaCl、0.01％～0.2％proclin-300、 2mmol/L EDTA*2Na、0.1％～2％BSA、及0.1％～1％的浓度为10％的酪蛋白，pH6.0。 在上述技术方案中，优选的是：所述校准品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/ L；所述质控品的高、低浓度分别为25.0IU/L、5.00IU/L。 本发明提供一种甲型肝炎病毒总抗体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤： 步骤1、R1试剂的制备 步骤1.1磁颗粒溶液的洗涤 取磁颗粒溶液，加入包被缓冲液稀释，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊， 弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入包被缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行 分离并重悬； 步骤1.2磁颗粒的活化过程 取洗涤好的磁颗粒，分次加入含EDC的活化缓冲液中，边加边混匀，加完后，置于血 液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；在活化 好的磁颗粒沉淀中加入包被缓冲液； 步骤1.3甲型肝炎病毒抗体的包被 取活化好的磁颗粒，加入甲型肝炎病毒抗体，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行 包被； 步骤1.4封闭 向上述包被物中，加入封闭缓冲液，置于血液混匀仪上，中速混匀后进行封闭；将 封闭后磁颗粒溶液放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒沉淀；再加入 包被缓冲液，充分悬起，置于血液混匀仪上，中速混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑 浊，弃上清，留取磁颗粒，再加入包被缓冲液，充分涡旋混匀作为固相中间品存放； 步骤1.5 R1试剂的制备 取上述步骤1.4制备的固相中间品和试剂缓冲液，配制成磁微粒包被的甲型肝炎 病毒抗体溶液，即为R1试剂； 步骤2、R2试剂的制备 步骤2.1化学发光物质标记的甲型肝炎病毒抗体的制备： 取甲型肝炎病毒抗体，超滤离心，将原材料缓冲液置换为标记缓冲液，离心，然后 加入化学发光物质原液，混匀后进行标记；标记反应结束后，加入封闭缓冲液，进行封闭；封 闭后超滤离心，除去未偶联的化学发光物质，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存， 用于试剂配制； 步骤2.2、R2试剂的制备 取上述步骤2.1中制备的中间品和试剂缓冲液，配制成化学发光物质标记的甲型 5 CN 111596061 A 说 明 书 3/15 页 肝炎病毒抗体溶液，即为R2试剂； 步骤3、R3试剂的制备 取HAV抗原母液，使用缓冲液配置配制成R3试剂； 步骤4、甲型肝炎病毒总抗体校准品、质控品的制备 配制高、低浓度的校准品，及高、低浓度的质控品。 在上述技术方案中，R1试剂的制备中：采用pH 6.5的20mM磷酸缓冲液为活化缓冲 液，10mg/mL EDC为活化剂，活化温度25℃，活化时间60min；pH 7.0的磷酸缓冲液为包被缓 冲液，包被温度25℃，包被时间12h；pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液，封闭温度25℃， 封闭时间2h。 在上述技术方案中，R2试剂的制备中：标记的温度为37℃，时间为4h；封闭的时间 为1h。 本发明的有益效果是： 本发明的试剂盒采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。 本发明的试剂盒采用顺磁性的微粒作为固相载体，其比表面积大，提高了检测的 灵敏度。 本发明的试剂盒通过采用过量的HAV抗原中和HAV IgG和IgM，可以同时检测HAV IgG和IgM，检测结果完全可以代表HAV总抗体结果。 本发明的制备方法制备的试剂盒可直接用于全自动化学法光免疫分析仪上，无需 大型仪器设备配合，成本较低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。
