技术摘要：
本发明提供了一种利用胁迫驱动型启动子和抗胁迫基因在酿酒酵母中构建基因线路以提高酿酒酵母鲁棒性的方法，属于生物工程领域。本发明通过对处在无胁迫和有胁迫下生长的酿酒酵母分别进行转录组学测序，按转录水平挖掘胁迫驱动型启动子。用荧光蛋白基因对胁迫驱动型启动  全部
背景技术：
酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)是常用的模式单细胞真菌，经常用于乙醇 和其它化学品的发酵生产。但酿酒酵母在实际发酵过程中，细胞活力、代谢速率及乙醇产率 都远低于在最优培养条件，这是因为实际发酵生产中存在多种抑制菌株的胁迫(stress)。 实际发酵生产中要求发酵在尽可能高的温度下进行，这样有利于提高底物酶解速率、提高 传质效率、降低冷却成本以及降低染菌风险。并且，发酵液中含有较多的对细胞有毒性的物 质，如乙酸等。发酵液中初始糖浓度过高同样对细胞造成生长抑制。这些胁迫都可以造成细 胞内活性氧水平的升高，导致脂质过氧化、蛋白质变性、染色体损伤以及细胞自噬等损伤。 因此，酿酒酵母的鲁棒性还亟待提高。鲁棒性(Robustness)是指在异常条件下菌株的生存 和生产能力。鲁棒性强的菌株更够更好的在各种环境下生长和生产，对提高工业发酵效率 和产值具有重要意义。 通过一些方法可以提高菌株对一些胁迫的耐受性。例如基因组重排、原生质体融 合、适应性进化等。一些合成生物学方法可以更具针对性的提高酿酒酵母的耐受性，例如， 过表达酿酒酵母内源的或外源的过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、热激蛋白等可 以提高菌株在高温下的生长性能。 使微生物在环境变化中更加智能(根据环境变化调节自身生长和代谢)也是工业 发酵的一项重要诉求。在酿酒酵母的合成生物学改造中，一般用常用的组成型启动子对目 标基因进行表达，忽视了基因表达的时序性。并且，采用组成型强启动子对多基因共同表达 往往造成细胞代谢负担，导致生长水平的下降，这也成为一种普遍现象。因此，想通过过表 达多个基因实现酿酒酵母耐受性和鲁棒性的提高是非常困难的。 于是，我们想找到胁迫驱动的启动子来调节目标基因，使其在无胁迫下少表达，在 有胁迫下高表达，通过表达抗胁迫基因消除胁迫，形成一个反馈过程，这样可以降低细胞的 代谢负担，最大化的提高细胞鲁棒性和耐受性。目前已报导的胁迫驱动型启动子有HSP12p、 HSP26p和TPS1p。但这远不能满足我们对多基因调控的需求。
技术实现要素：
本发明的目的是为解决理性系统调节酿酒酵母鲁棒性难的问题，提供一种动态增 强酿酒酵母鲁棒性的方法。 为达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种利用胁迫驱动型启动子和抗胁迫 基因在酿酒酵母中构建基因线路的方法。首先，对处在无胁迫和有胁迫下生长的酿酒酵母 分别进行转录组学测序，用统计方法对两组数据进行比较，按基因的转录水平高低进行排 序，将转录水平在有胁迫下高于无胁迫下的基因归纳为胁迫驱动型基因，胁迫驱动型基因 3 CN 111733089 A 说　明　书 2/4 页 所具有的启动子则为胁迫驱动型启动子。然后，选择强度适合的胁迫驱动型启动子将其与 荧光蛋白基因和终止子组装为基因表达盒，整合到酿酒酵母染色体中表达，在无胁迫和有 胁迫的生长条件下分别测量荧光强度，检验荧光强度的结果是否与转录组的结果相一致。 最后，将验证过的胁迫驱动型启动子与抗胁迫基因、终止子组装为表达盒，整合到酿酒酵母 染色体中表达，将得到的工程菌株在胁迫条件下测试生长量。 本发明中所述表达盒均指能够在酿酒酵母中有效表达目的基因的DNA序列，表达 盒的结构包括启动目的基因转录的启动子，目的基因以及终止目的基因转录的终止子。 本发明的酿酒酵母工程菌具有以下优点： 1、胁迫驱动型启动子的使用可以使菌株能够响应环境的胁迫，根据环境胁迫强度 调节细胞自身的抗胁迫水平，达到菌株的智能、动态调节，实现酿酒酵母鲁棒性的提升。 2、胁迫驱动型启动子调控的表达能够实现多个基因的同时强化表达，极大降低因 过表达多个基因导致细胞代谢和生长受抑制的情况出现，使细胞在无胁迫时能量和代谢损 失最低。 附图说明 图1是胁迫驱动型启动子与抗胁迫基因组装成的表达盒与胁迫的互作关系图。 图2是通过转录组筛选到的胁迫驱动型启动子(基因)。