技术摘要：
本发明公开了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因表达的蛋白；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴 全部
背景技术：
牛呼吸系统疾病是是由多种病原所引起牛呼吸系统疾病的总称，该病已在全世界 发生和流行，给畜牧养殖业造成了严重经济损失在我国，牛呼吸系统疾病始于2008年，此后 在我国多地相继报道，其平均病死率为10%，最高可达40%以上，给我国的养牛业带来了巨大 危害。 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是引起牛呼吸系统疾病 （Bovine respiratorydisease）的主要病原。牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的巴氏杆菌 病是一种能感染多种动物及人类的传染性疾病，对畜牧养殖业带来了巨大的危害。其引发 的疾病多发生于经长途运输的育肥架子牛，给我国畜牧养殖业造成了较严重的经济损失。 目前对于巴氏杆菌感染的诊断方法主要是通过病原学、分子生物学、血清学三个方面。病原 学诊断主要利用实验室微生物诊断，通过对病原菌的分离鉴定来确定病原菌。而利用分子 生物学技术对巴氏杆菌的诊断主要是通过PCR、基因芯片和DNA指纹技术等方式进行确定， 就目前的诊断技术来说，PCR技术是检测巴氏杆菌的主要方法，通过对巴氏杆菌的16SrRNA 和KMT1基因进行扩增来判定[61]。黄海燕等根据plpE基因所建立的PCR方法经过临床的实验 说明，其具有一定的可靠性和实用性[62]，Townend则利用基因消减的方法建立了一种PCR方 法[63]，Hricinova等建立一种多重PCR的方法[64]，除了单纯的利用PCR 技术进行诊断之外， 肖国生等所建立的基因芯片检测方法可以检测出猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和巴氏 杆菌[65]，同时程亚楼所建立的基因芯片检测方法也能够检测巴氏杆菌[66]。除了病原学和分 子生物学方法来诊断的巴氏杆菌外，还可以利用血清学来进行诊断。血清学诊断的主要方 法就是酶联免疫吸附法（ELISA）。 目前治疗由牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的呼吸系统疾病主要采用抗微生物 药物，但近年来相关研究表明，牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌已对兽医临床常用药物产生了不 同程度的耐药性，因其耐药性产生而造成的抗感染失败已屡见不鲜。为此，对牛荚膜A型多 杀性巴氏杆菌引发疾病的治疗需依赖药物敏感性检测筛选敏感药物，但牛荚膜A型多杀性 巴氏杆菌为苛养菌，分离周期非常长，为此，急需构建牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集 分离方法，以加快其分离、鉴定及药物敏感性检测时间，具有重要意义。 免疫磁珠富集技术通过抗原抗体的特异性结合和纳米磁珠的在磁场的作用下能 发生磁响应性对目标物质进行富集和分离的原理，具有灵敏度高、特异性强、分离速度快的 优点，为快速富集和分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌提供了可能。
技术实现要素：
本发明目的是为解决牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌检测周期长的问题，而提供一种 3 CN 111575299 A 说 明 书 2/8 页 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠及其制备方法。 一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。 一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴 氏杆菌基因表达的蛋白。 一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀 性巴氏杆菌抗原蛋白制备的。 一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法，它包括： 1）蛋白溶液的配制:取上述的抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，MES缓冲液溶 解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用； 2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中； 3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液； 4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠 混合均匀； 5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液； 6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀； 7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔 15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h； 8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液； 9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集 磁珠，弃上清液； 10）重复“步骤 9”操作四次； 11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混 合1~2h； 12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液； 13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液； 14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重 复该操作2次； 15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用。 本发明提供了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO .1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多 杀性巴氏杆菌抗原蛋白制备的；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法；本 发明在筛选选牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的特异性抗原的基础上，通过其制备的多克 隆抗体与磁性微球进行偶联制备免疫磁珠，对免疫磁珠的特异性和敏感性等方面进行检 测，以构建一种能快速富集分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的方法，提高兽医临床诊治效 率。 4 CN 111575299 A 说 明 书 3/8 页 附图说明 图1 Pm1基因扩增结果；M：DL1000 DNA MARKER；1：牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1 基因（150bp）； 图2 重组质粒pET32a-Pm1的双酶切鉴定；B：重组质粒pET-32a-Pm1双酶切结果。M1：DLλ Hindd III DNA MARKER；M2：DL2000 DNA MARKER；1：未酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果； 2：双酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果； 图3 重组Pm1蛋白表达产物SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1：未诱导的BL21 （pET32a-Pm1）菌液；2:诱导的BL21（pET32a-Pm1）菌液；3：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的上清； 4：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的沉淀； 图4 重组Pm1蛋白纯化SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1-2：穿出产物；3:20mmol 洗脱产物；4：50mmol洗脱产物；5：100mmol洗脱产物；6：200mmol洗脱产物； 图5 多克隆抗体纯化SDS-PAG凝胶电泳分析；M：低分子量蛋白Maker；1：纯化后抗体； 图6 不同偶联缓冲液条件下偶联抗体的浓度； 图7 抗体的偶联率随抗体浓度的变化示意图； 图8 免疫磁珠富集牛巴氏杆菌的PCR扩增结果；M：Trans2K Plus DNA MARKER；1-2：免 疫磁珠分别富集15min的PCR扩增结果；3-4：免疫磁珠分别富集30min的PCR扩增结果；5-6： 免疫磁珠分别富集45min的PCR扩增结果；7-8：免疫磁珠分别富集60min的PCR扩增结果； 图9 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的PCR结果。M：Trans2K Plus DNA MARKER；1：Pm 菌液的扩增结果；2-3：Pm和E.coli混合菌液的扩增结果；4-5：Pm和salmonella混合菌液的 扩增结果；5-6Pm和S.aureus混合菌液的扩增结果；7-8：Pm和T.pyogenes混合菌液的扩增结 果； 图10 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的敏感性的PCR扩增结果。M：Trans2K Plus DNA MARKER；1-10；各个稀释倍数下的PCR扩增结果，依次分别为稀释100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109。
本发明公开了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因表达的蛋白；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴 全部
背景技术：
牛呼吸系统疾病是是由多种病原所引起牛呼吸系统疾病的总称，该病已在全世界 发生和流行，给畜牧养殖业造成了严重经济损失在我国，牛呼吸系统疾病始于2008年，此后 在我国多地相继报道，其平均病死率为10%，最高可达40%以上，给我国的养牛业带来了巨大 危害。 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是引起牛呼吸系统疾病 （Bovine respiratorydisease）的主要病原。牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的巴氏杆菌 病是一种能感染多种动物及人类的传染性疾病，对畜牧养殖业带来了巨大的危害。其引发 的疾病多发生于经长途运输的育肥架子牛，给我国畜牧养殖业造成了较严重的经济损失。 目前对于巴氏杆菌感染的诊断方法主要是通过病原学、分子生物学、血清学三个方面。病原 学诊断主要利用实验室微生物诊断，通过对病原菌的分离鉴定来确定病原菌。而利用分子 生物学技术对巴氏杆菌的诊断主要是通过PCR、基因芯片和DNA指纹技术等方式进行确定， 就目前的诊断技术来说，PCR技术是检测巴氏杆菌的主要方法，通过对巴氏杆菌的16SrRNA 和KMT1基因进行扩增来判定[61]。黄海燕等根据plpE基因所建立的PCR方法经过临床的实验 说明，其具有一定的可靠性和实用性[62]，Townend则利用基因消减的方法建立了一种PCR方 法[63]，Hricinova等建立一种多重PCR的方法[64]，除了单纯的利用PCR 技术进行诊断之外， 肖国生等所建立的基因芯片检测方法可以检测出猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和巴氏 杆菌[65]，同时程亚楼所建立的基因芯片检测方法也能够检测巴氏杆菌[66]。除了病原学和分 子生物学方法来诊断的巴氏杆菌外，还可以利用血清学来进行诊断。血清学诊断的主要方 法就是酶联免疫吸附法（ELISA）。 目前治疗由牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的呼吸系统疾病主要采用抗微生物 药物，但近年来相关研究表明，牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌已对兽医临床常用药物产生了不 同程度的耐药性，因其耐药性产生而造成的抗感染失败已屡见不鲜。为此，对牛荚膜A型多 杀性巴氏杆菌引发疾病的治疗需依赖药物敏感性检测筛选敏感药物，但牛荚膜A型多杀性 巴氏杆菌为苛养菌，分离周期非常长，为此，急需构建牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集 分离方法，以加快其分离、鉴定及药物敏感性检测时间，具有重要意义。 免疫磁珠富集技术通过抗原抗体的特异性结合和纳米磁珠的在磁场的作用下能 发生磁响应性对目标物质进行富集和分离的原理，具有灵敏度高、特异性强、分离速度快的 优点，为快速富集和分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌提供了可能。
技术实现要素：
本发明目的是为解决牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌检测周期长的问题，而提供一种 3 CN 111575299 A 说 明 书 2/8 页 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠及其制备方法。 一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。 一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴 氏杆菌基因表达的蛋白。 一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀 性巴氏杆菌抗原蛋白制备的。 一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法，它包括： 1）蛋白溶液的配制:取上述的抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，MES缓冲液溶 解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用； 2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中； 3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液； 4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠 混合均匀； 5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液； 6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀； 7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔 15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h； 8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液； 9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集 磁珠，弃上清液； 10）重复“步骤 9”操作四次； 11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混 合1~2h； 12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液； 13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液； 14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重 复该操作2次； 15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用。 本发明提供了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO .1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多 杀性巴氏杆菌抗原蛋白制备的；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法；本 发明在筛选选牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的特异性抗原的基础上，通过其制备的多克 隆抗体与磁性微球进行偶联制备免疫磁珠，对免疫磁珠的特异性和敏感性等方面进行检 测，以构建一种能快速富集分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的方法，提高兽医临床诊治效 率。 4 CN 111575299 A 说 明 书 3/8 页 附图说明 图1 Pm1基因扩增结果；M：DL1000 DNA MARKER；1：牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1 基因（150bp）； 图2 重组质粒pET32a-Pm1的双酶切鉴定；B：重组质粒pET-32a-Pm1双酶切结果。M1：DLλ Hindd III DNA MARKER；M2：DL2000 DNA MARKER；1：未酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果； 2：双酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果； 图3 重组Pm1蛋白表达产物SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1：未诱导的BL21 （pET32a-Pm1）菌液；2:诱导的BL21（pET32a-Pm1）菌液；3：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的上清； 4：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的沉淀； 图4 重组Pm1蛋白纯化SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1-2：穿出产物；3:20mmol 洗脱产物；4：50mmol洗脱产物；5：100mmol洗脱产物；6：200mmol洗脱产物； 图5 多克隆抗体纯化SDS-PAG凝胶电泳分析；M：低分子量蛋白Maker；1：纯化后抗体； 图6 不同偶联缓冲液条件下偶联抗体的浓度； 图7 抗体的偶联率随抗体浓度的变化示意图； 图8 免疫磁珠富集牛巴氏杆菌的PCR扩增结果；M：Trans2K Plus DNA MARKER；1-2：免 疫磁珠分别富集15min的PCR扩增结果；3-4：免疫磁珠分别富集30min的PCR扩增结果；5-6： 免疫磁珠分别富集45min的PCR扩增结果；7-8：免疫磁珠分别富集60min的PCR扩增结果； 图9 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的PCR结果。M：Trans2K Plus DNA MARKER；1：Pm 菌液的扩增结果；2-3：Pm和E.coli混合菌液的扩增结果；4-5：Pm和salmonella混合菌液的 扩增结果；5-6Pm和S.aureus混合菌液的扩增结果；7-8：Pm和T.pyogenes混合菌液的扩增结 果； 图10 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的敏感性的PCR扩增结果。M：Trans2K Plus DNA MARKER；1-10；各个稀释倍数下的PCR扩增结果，依次分别为稀释100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109。
