技术摘要：
为了解决现有技术中DMTs采用酶反应进行甲基化修饰的技术空白，本发明提供了一种SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2‑1（来源于海洋链霉菌Streptomyces sp.NRRL F‑5123）在制备甲基化的pre‑DMTs和DMTs中的应用。同时，还提供了该甲基转移酶的氨基酸序列及其核苷酸序列；并且提  全部
背景技术：
SAM依赖型甲基转移酶是催化以SAM (S-腺苷甲硫氨酸，S-adenosyl-L- methionine)为甲基的直接供体，来进行甲基转移反应的酶。研究表明，通过SAM依赖型甲基 转移酶催化实现的甲基化可以极大地改善天然产物的性质。因此，在天然产物生物合成中， SAM依赖型甲基转移酶扮演着重要角色。发明专利申请201310552458.3公开了“L11  MT蛋白 作为甲基转移酶的应用”。该申请所述的甲基转移酶能对如下底物蛋白中的至少一种进行 甲基化修饰：Sul7d蛋白、Cren7蛋白、RPL11蛋白Rrp4蛋白、Csl4蛋白和Rrp42蛋白。该申请中 的甲基转移酶实现了甲基从S-腺苷甲硫氨酸到底物蛋白的转移。由此可知，该申请中的甲 基转移酶针对的底物是大分子蛋白。 Drimentines(DMTs)是一类异戊烯化二酮哌嗪类化合物，表现出了显著的抗细菌、 抗肿瘤、杀昆虫及寄生虫等多种生物学活性。最早由Lacey  Ernest等人从放线菌MST-8651 中分离出，随后由Novartis  Animal  Health  Australasia与Microbial  Screening  Technologies公司对DMT  A-E提交了专利申请(WO98/09968)。2012年，车茜等人从广东红树 林保护区芦苇根际土壤中分离鉴定链霉菌CHQ64(Genbank  No:JQ405211)，对其发酵产物进 行分离鉴定出IndotertineA、B和DMT  F、G、H和C，并提交了专利申请(CN102276613A)。目前， DMTs骨架的生物合成已经被阐明。以DMT  G为例：首先，环二肽合酶合成cyclo(L-Trp-L- Val)(cWV)；然后，异戊烯基转移酶将法尼西基加载至cWV得到pre-DMT  G(结构如式(2)所 示)；最后，在萜类环化酶的作用下得到DMT  G。 此外，根据文献报道，现有技术中DMTs采用菌株直接发酵和化学全合成得到，但尚 未见通过酶反应制备DMTs。其中，DMTs中N15位的甲基化修饰具普遍性，以DMT  F为例，其结 构如式(1)所示。与N15位的甲基化修饰相比，N4位的只有甲酰化修饰，未见N4位甲基化修饰 的报道。但总而言之，DMTs的甲基化机制一直未得到阐明。如上所述，甲基化修饰可以极大 地改善天然产物的性质；且该类化合物在发酵液中的含量较低，产量受限，大大制约了其在 产业上的应用前景。因此，通过酶法阐明DMTs的甲基化修饰，将为二酮哌嗪类化合物的药物 研制提供新的路径，具有重要的应用价值和社会意义。 3 CN 111575260 A 说　明　书 2/6 页
技术实现要素：
为了解决现有技术中DMTs采用酶反应进行甲基化修饰的技术空白，本发明提供了 SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1(来源于海洋链霉菌Streptomyces  sp.NRRL  F-5123)在甲 基化修饰pre-DMTs/DMTs中的应用。所述的甲基转移酶DmtMT2-1具有底物广谱性，能分别以 多种pre-DMTs/DMTs为底物，得到N4位甲基化pre-DMTs/DMTs，为酶法甲基化修饰DMTs扫清 了关键障碍。 本发明的技术方案：SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用，是指所述甲基转移酶 DmtMT2-1在制备甲基化的pre-DMTs/DMTs中的应用；所述甲基转移酶DmtMT2-1的氨基酸序 列选自如下(1)、(2)或(3)： (1)如SEQ  ID  NO:1所示的氨基酸序列； (2)如SEQ  ID  NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基 酸且具有催化甲基供体结合到环二肽α-N活性的氨基酸序列； (3)与SEQ  ID  NO:1所示的氨基酸序列同源性≥90％，且所表达蛋白具有催化甲基 供体结合到环二肽α-N活性的氨基酸序列。 编码所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3) 或(4)： (1)如SEQ  ID  NO:2所示的核苷酸序列； (2)与SEQ  ID  NO:2所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQ  ID  NO:1所示的氨基 酸序列的核苷酸序列； (3)与SEQ  ID  NO:2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达蛋白具有催化甲 基供体结合到环二肽α-N活性的核苷酸序列； (4)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。 所述的应用为，所述甲基转移酶DmtMT2-1将甲基供体结合到pre-DMTs/DMTs的N4 位上；所述的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸。其中，所述pre-DMTs/DMTs为pre-DMT/DMT  A， pre-DMT/DMT  C，pre-DMT/DMT  G或pre-DMT/DMT  F。 含有编码所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列的表达载体。 所述的表达载体在表达SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1中的应用。 所述甲基转移酶DmtMT2-1的克隆表达方法，其特征在于：包括如下步骤：将编码所 述的甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列克隆入表达载体中构建表达载体；再将所述的表达 载体转入表达系统中进行蛋白表达；最后经纯化得到所述的甲基转移酶DmtMT2-1。 本发明的有益效果： (1)本发明提供的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，公开了其催化甲基从S-腺苷甲 硫氨酸到pre-DMTs/DMTs转移的功能，填补了酶法对pre-DMTs进行N4位甲基化修饰的技术 空白，对于酶法合成DMTs技术发展具有里程碑式的意义。 (2)本发明所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，能以pre-DMTs/DMTs为底物，具 有底物广谱性，因此在DMTs的N4位甲基化修饰中具有重要的地位。 (3)本发明所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，对DMTs在N4位甲基化，为二酮 哌嗪类化合物的药物研制提供新的路径，具有重要的应用价值和社会意义。 4 CN 111575260 A 说　明　书 3/6 页 附图说明 图1是本发明中纯化的甲基转移酶DmtMT2-1的SDS-PAGE分析电泳图； 图2是本发明中DmtMT2-1与pre-DMT  G/DMT  G酶学反应的高效液相色谱(HPLC)图。