技术摘要：
本发明公开了一种抗VSIG4单克隆抗体，根据VSIG4抗原表位特异性分析，合成VSIG4特异性多肽，将VSIG4特异性多肽与KLH偶连后作为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫后BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得分泌抗VSIG4单克隆抗体的杂交瘤细胞，抗VSIG4单克隆抗  全部
背景技术：
甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，也是近20年来发病率增长最快的人类 恶性肿瘤之一。2018年世界范围甲状腺癌新发病例近56.7万例，其中中国约19.4万例，已成 为我国多个地区女性第一高发恶性肿瘤，严重威胁我国居民的健康[1]。甲状腺癌分多种类 型，其中，绝大多数是乳头状甲状腺癌，占了80%-90%，剩下10%-20%里包括滤泡癌、髓样癌、 低分化癌、未分化癌等。除了甲状腺乳头状癌，其它几种类型的甲状腺癌预后差，尤其是甲 状腺未分化癌（Anaplastic  Thyroid  Carcinoma ,  ATC），堪称人类最恶性的肿瘤之一。ATC 患者的中位生存期不足6个月，1年生存率约17%，而5年生存率仅8%。2018年全国ATC新发病 例近4000例，新增死亡病例约3440例，占甲状腺癌死亡总数的40%。ATC进展迅速，手术、外放 射、碘131  、药物治疗疗效均极其有限，患者常死于局部肿瘤扩张引起的窒息或肿瘤远处转 移[2-3]。因此，目前亟需寻找有效的治疗新靶点，以期突破该类患者的治疗瓶颈。 肿瘤相关巨噬细胞（Tumor  Associated  Macrophage,  TAM）是肿瘤间质中数量最 多的炎症细胞群，可促进肿瘤增殖、侵袭、转移及血管新生，尤其是肿瘤免疫逃逸[4]。研究 表明，甲状腺癌中TAM的数量与生存期负相关，是甲状腺癌预后不利因素[5]。Caillou等发 现在ATC组织中，TAM数量约占肿瘤组织细胞总量57%，且相互联系形成网状结构[6]，这种病 理结构为ATC细胞提供极佳的“免疫豁免区”。生理免疫状态下，巨噬细胞识别抗原后首先将 表面抗原肽-MHC分子复合物呈递给T细胞识别，并通过表达协同刺激信号B7分子与T细胞表 面CD28结合活化T细胞，进而介导免疫应答。然而在肿瘤微环境中，TAM表型及功能受肿瘤细 胞严密调控，TAM大量表达负性共刺激分子与PD-1、CTLA-4等免疫检查点蛋白，抑制T细胞抗 肿瘤免疫应答，促使肿瘤发生免疫逃逸[7]。与正常细胞相比，ATC细胞作为一种截然不同的 “非己”成分，理论上会被宿主免疫系统识别并清除，然而，ATC细胞的生长却无法被免疫系 统限制，因此，寻找肿瘤免疫逃逸机制并解除免疫抑制是治疗ATC的潜在策略。 随着近几年免疫检查点抑制剂在实体瘤治疗中的成功，免疫疗法为恶性肿瘤的治 疗带来新思路。已有个案报道对存在BRAF突变及PD-L1高表达的ATC患者通过维罗非尼联合 纳武单抗进行治疗，可使患者肿瘤明显消退，且可持续20个月[8]。该研究提示免疫疗法在 ATC治疗中的潜力，但值得注意的是，Ahn等通过407例甲状腺癌组织进行PD-L1免疫组化染 色，发现ATC组织中肿瘤细胞和免疫细胞PD-L1表达阳性率仅为22.2%和11.1%  [9]，提示该 方案并不适合于多数ATC患者的治疗。 VSIG4与PD-L1，PD-L2同属于B7家族，可抑制T细胞功能或补体旁路途径的活化，从 而调节自身免疫疾病及炎症疾病的发展[10-11]。Hepatology的研究表明，枯否细胞表达 VSIG4可对抗T细胞及NK细胞引起的自身免疫肝损伤[12]。最新的研究发现，VSIG4可抑制杀 伤型巨噬细胞（M1）极化，改善爆发性肝炎及高脂饮食引起的肥胖[13]。流行病学结果显示， VSIG4强表达是恶性胶质瘤、非小细胞肺癌等肿瘤的预后不利因素[14-15]。然而，VSIG4如 3 CN 111574627 A 说　明　书 2/7 页 何促进肿瘤的发生发展研究甚少，目前仅有研究指出VSIG4阳性TAM可促进肺癌的发展 [15]。 1 .  Bray  F,  Ferlay  J ,  Soerjomataram  I,  Siegel  RL,  Torre  LA,  Jemal  A.  Global  cancer  statistics  2018:  GLOBOCAN  estimates  of  incidence  and  mortality  worldwide  for  36  cancers  in  185  countries.  CA  Cancer  J  Clin.  2018;68(6):394- 424. 2 .  Fahiminiya  S ,  de  Kock  L ,  Foulkes  WD .  Biologic  and  Clinical  Perspectives  on  Thyroid  Cancer.  N.  Engl.  J.  Med.  2016;  375(23) . 3.  Wiseman  SM,  Masoudi  H,  Niblock  P,  Turbin  D,  Rajput  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技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抗VSIG4单克隆抗体及其用途，可为ATC患者提供安 全、有效的治疗策略，进而改变该类患者无有效治疗手段的困境。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种抗VSIG4单克隆抗体，根据VSIG4抗原表位特异性分析，合成VSIG4特异性多肽，将 VSIG4特异性多肽与KLH偶连后作为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫后BALB/c小鼠的脾细胞与 小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得分泌抗VSIG4单克隆抗体的杂交瘤细胞，抗VSIG4单克 隆抗体的杂交瘤细胞采用动物体内生产法或体外培养法生产获得抗VSIG4单克隆抗体。 申请人发现，与正常甲状腺组织及乳头状甲状腺癌（Papillary  Thyroid  Carcinoma ,  PTC）相比，PD-L1及CTLA4的平均表达水平在ATC患者组织中上调并不显著，提 示除PD-L1/PD1外，还存在其他肿瘤免疫逃逸机制。因此筛选ATC特异免疫检查点并设计相 应靶向抗体有望成为其治疗的重要策略。申请人前期通过基因芯片筛选发现免疫抑制蛋白 VSIG4在ATC中表达较PTC及正常组织显著上调，且VSIG4阳性TAM大量聚集于ATC组织，提示 其可能是促ATC免疫逃逸的关键细胞亚群。VSIG4  (V-set  and  Ig  domain-containing  4) 又称为免疫球蛋白超家族-39  (Ig  superfamily  protein  39,  Z39Ig)，主要表达于巨噬细 胞，具有很强的免疫抑制作用。 申请人通过杂交瘤技术筛选制备了靶向VSIG4的单克隆抗体，用以阻断VSIG4与T 细胞的结合。动物实验结果显示，抗VSIG4单克隆抗体可显著抑制ATC肿瘤生长，并且其抗肿 瘤效果优于Atezolizumab（靶向阻断PD-L1）。此外，研究发现抗VSIG4单克隆抗体亦可显著 抑制胰腺癌细胞株Panc02小鼠皮下荷瘤后的肿瘤生长，提示不仅在ATC中靶向VSIG4具有很 强的抗肿瘤活性，抗VSIG4单克隆抗体还具有抑制其他肿瘤的生长的潜力。 本发明筛选ATC特异表达免疫抑制蛋白VSIG4，并针对该靶点设计了靶向阻断单克 隆抗体，确定了其抗肿瘤活性。 所述VSIG4特异性多肽的序列为：VRKYNPPRINTEAP。 VSIG4特异性肽段与KLH偶连的具体操作为：将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反 应，使KLH充分活化，将VSIG4特异性多肽加入已活化的KLH中室温旋转反应，然后将偶连产 物加入到PBS中形成抗原。优选的，将1mg  KLH与500  ul浓度1mg/mL交联剂SMCC混合，室温旋 5 CN 111574627 A 说　明　书 4/7 页 转反应30  min，使KLH充分活化，将1mg多肽加入1ml已活化的KLH中室温旋转反应2  h，然后 将偶连产物加入到10mM  pH7.4的PBS中，形成最终的偶连产物浓度为1mg/ml的抗原。 抗原免疫BALB/c小鼠进行三次免疫，且在BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0融合前3天对BALB/c小鼠进行一次加强免疫。 一种抗VSIG4单克隆抗体作为制备治疗甲状腺癌药物的应用。 所述甲状腺癌为甲状腺未分化癌。 一种抗VSIG4单克隆抗体作为制备治疗胰腺癌药物的应用。 本发明的有益效果是：获取了VSIG4特异结合且具有抗肿瘤活性的单克隆抗体，适 用于甲状腺未分化癌及胰腺癌等癌症的治疗。 附图说明 图1是本发明抗VSIG4单克隆抗体的制备流程图。 图2是抗VSIG4单克隆抗体的效价及亲和力分析。  (A)抗VSIG4单克隆抗体的效价 分析；(B)表面等离子体共振实验考察VSIG4单克隆抗体与VSIG4的亲和力。 图3是抗VSIG4单克隆抗体生物学功能分析。(A)抗VSIG4单克隆抗体可逆转VSIG4 重组蛋白对T细胞增殖抑制作用。（B）抗VSIG4单克隆抗体可逆转VSIG4重组蛋白对T细胞IL2 分泌的抑制作用。（C）抗VSIG4单克隆抗体可逆转VSIG4重组蛋白对T细胞IFNγ分泌的抑制 作用。**P<0.01，***P<0.001。 图4是抗VSIG4单克隆抗体具有显著体外抗肿瘤活性。LDH检测试剂盒考察T细胞的 肿瘤杀伤作用。抗VSIG4单克隆抗体可恢复CD8阳性T细胞的细胞杀伤作用，效应T细胞与 8505C比例为3：1。***P<0.001。 图5是抗VSIG4单克隆抗体体内抗肿瘤效应研究。(A)  肿瘤免疫双人源化小鼠模型 考察抗VSIG4单克隆抗体（10  mg/kg）及Atezolizumab(抗PD-L1单克隆抗体)（10  mg/kg）对 ATC细胞株8505C肿瘤生长的影响，anti-VSIG4  vs  IgG1  *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； anti-VSIG4  vs  anti-PD-L1  #  P<0.05，##  P<0.01，###  P<0.001；(B)  C57BL/6小鼠皮下荷 瘤模型考察抗VSIG4单克隆抗体（10  mg/kg）对胰腺癌细胞株Panc02肿瘤生长的影响，anti- VSIG4  vs  PBS  *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 图6甲状腺未分化癌免疫调节相关蛋白的表达谱差异。(A-B)基因芯片GSE33630及 GSE29265中28个免疫调节相关蛋白在ATC、PTC及正常甲状腺组织中的表达水平。 图7  VSIG4阳性TAM可能介导ATC免疫逃逸。(A) 蛋白质组学分析VSIG4在不同病理 组织中的离子信号强度；(B)  RT-PCR检测VSIG4在不同病理组织中的表达；(C) 免疫组化染 色检测VSIG4在不同甲状腺癌组织中的表达；(D-E)  基于GEO数据库基因芯片分析VSIG4在 PTC、ATC及正常组织中的表达水平；(F)  免疫荧光染色检测VSIG4(绿)/CD68(红)在不同甲 状腺癌组织中的表达。