技术摘要：
本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以及专用的RPA引物对(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)、试剂盒。本发明根据鸭乙型肝炎病毒的基因序列设计特异性引物，进一步优化建立了用于快速准确进行鸭乙型肝炎病毒检测的重组酶聚合酶等温扩增方法。该  全部
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的一个主要公共卫生问题。由于HBV宿主范围狭 窄，有明显嗜肝性和种属特异性，人工培养HBV尚未成功，建立较理想的HBV感染细胞及动物 模型也很困难，已成为限制抗HBV药物开发和评价的主要障碍。而鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与 HBV同属嗜肝DNA病毒科，两者在形态结构、核酸组成、生物学特性、发病机理和相对嗜肝性 等方面有众多相似之处，同时鸭对DHBV易感，且来源丰富，价格低廉，易于饲养，常被用作抗 HBV药物筛选及HBV致病机理研究的理想动物模型。因此，及时掌握鸭群乙型肝炎的流行现 状及感染情况是十分必要的。 目前对DHBV  DNA进行检测的方法较多，其中Southern  blot杂交、斑点杂交等方法 灵敏性较低、稳定性差、操作复杂，已不常用。聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等技 术应用广泛，但这些技术需依赖于控温准确的热循环仪器，限制了其在临床现场检测中的 应用。而核酸恒温扩增技术不需反复热变性，无需特殊仪器，反应速度更快，适合现场快速 检测，在生命科学研究领域已被广泛应用。 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型恒温扩增技术，它具有操作简单、特异性 强、灵敏度高、检测时间短等优点，并且可以在非实验室的条件下完成核酸扩增。利用RPA技 术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列，目前在病原学检 测领域应用特别广泛。但迄今尚未见采用RPA技术检测鸭乙型肝炎病毒的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明提供了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测 方法，以及所用到的特异性引物、检测试剂盒。 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种检测鸭乙型肝炎病毒的RPA引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列 如下所示，如SEQ  ID  NO.1和SEQ  ID  NO.2所示；其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序 列如SEQ  ID  NO.3所示； 上游引物F：5’-GCCTTAGCCAATGTGTATGA-3’(SEQ  ID  NO.1)； 下游引物R：5’-GGTGGAACAGGAGTAGTAGT-3’(SEQ  ID  NO.2)。 上述RPA引物对在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用。 遗传标记物在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用，所述遗传标记物的核 苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所示。 一种检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒，包括上述RPA引物对，以及检测所必须的试 剂，如Rehydration  Buffer、ddH2O和MgAc。 3 CN 111593138 A 说　明　书 2/6 页 一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，包括以下步骤： (1)提取待测物的基因组DNA(参照EasyPure@ViralDNA/RNA  Kit试剂盒说明书)， 利用RPA引物对进行重组聚合酶等温扩增，所述RPA引物对包括上游引物和下游引物，其核 苷酸序列如如SEQ  ID  NO.1和SEQ  ID  NO.2所示，其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序 列如SEQ  ID  NO.3所示； (2)将上述扩增产物进行电泳，观察是否出现239bp条带；若出现239bp条带，则判 断为鸭乙型肝炎病毒阳性，若未出现239bp条带，则判断为鸭乙型肝炎病毒阴性。 进一步地，所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的反应体系包括：SEQ  ID  NO.1和 SEQ  ID  NO.2所示的RPA引物各1.2μL，Rehydration  Buffer  29.5μL，模板3μL，ddH2O  12.6μ L，MgAc  2.5μL。 进一步地，所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的条件为：40℃反应25min。 进一步地，所述步骤(2)中，进行电泳的具体方式为：取5μL重组聚合酶等温扩增的 产物，加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。 本发明的检测鸭乙型肝炎病毒的方法，不仅可以用于鸭乙型肝炎病毒的检测，还 可以用于流行病学的调查、鸭乙型肝炎病毒治疗药物的筛选等。 本发明提供了用于检测鸭乙型肝炎病毒的遗传标记物，并根据该遗传标记物设计 了RPA引物对，具有非常好的特异性。利用本发明的RPA引物对，本发明进一步优化建立了适 于快速准确进行鸭乙型肝炎病毒检测的等温扩增检测方法，最低检出模板量为146pg，灵敏 度与传统PCR相当。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。 本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语 和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。 附图说明 图1：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对 1)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭 甲肝病毒(DHAV-3)；4鸭瘟病毒(DPV)；5、鸭源大肠杆菌(E.coli)；6、鸭源新城疫病毒(NDV)； 7、鸭源H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)；8、鸭疫里默氏杆菌(RA)。 图2：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法灵敏度试验电泳结果；其中， M：标准DNA分子量2000；1：14.6ng；2：1.46ng；3：146pg；4：14.6pg；5：1.46pg。 图3：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对 2)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭 甲肝病毒(DHAV-3)。 图4：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对 3)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭 甲肝病毒(DHAV-3)。