技术摘要：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。本发明HER2与低表达的TSHR融合表达，在不影响TSHR的结构与功能下，可以提高TSHR的产量和稳定性，并使得TSH 全部
背景技术：
人源促甲状腺激素受体(TSHR)主要存在甲状腺滤泡细胞膜上，部分分布于肝细 胞、淋巴细胞、脂肪细胞、眼后成纤维细胞、神经元细胞和星形胶质细胞。hTSHR是一种七次 跨膜蛋白，隶属于G蛋白偶联受体家族中的亚家族即糖蛋白受体，该蛋白具有较大的胞外 区，跨膜区和胞内区。胞外区负责结合蛋白配体，包括糖蛋白激素和松弛素，其跨膜区负责 受体活化和传递G蛋白的信号转导，激活腺苷酸环化酶产生cAMP，启动细胞cAMP第二信号系 统的信号级联反应。 在正常生理状态下，促甲状腺激素(TSH)与TSHR特异性结合，启动细胞cAMP第二信 号系统，可以促进甲状腺激素分泌，提高甲状腺的摄碘能力，促进甲状腺激素的合成、释放， 进而调节甲状腺滤泡细胞生长、分化和功能。在病理状态下，自身反应性T、B细胞被激活，体 内产生抗TSHR的抗体，而TSHR与刺激性抗体(TSAb)结合，可以刺激甲状腺细胞增生和功能 亢进，过多的合成和分泌甲状腺激素从而引起甲亢；当TSHR与刺激阻断型抗体(TSBAb)结 合，阻断TSH的刺激功能，抑制甲状腺功能，从而引起甲状腺功能减低。例如如果TSH受体的 抗体以TSAb为主，临床上表现为格雷夫斯病(Graves’disease)病；如果以TSBAb为主，临床 上则表现为原发性甲状腺功能减退症。因此临床上以检测血浆中TSHR刺激性抗体(TSAb)来 诊断格雷夫斯病。将抗HER2抗体包被在包被板上，TSHR的融合蛋白被特异性的吸附在包被 抗HER2抗体的发光板上，捕获血清中抗TSHR的抗体，用HRP标记的相对应的TSHR抗体竞争法 定量血清中刺激性抗体(TSAb)的含量。 TSHR基因位于人的14号染色体长臂上，基因全长大约60kb，内有10个外显子和9个 内含子，开放阅读框含有2295个核苷酸编码，含有764位氨基酸。TSHR蛋白分为膜外区、跨膜 区和膜内区，其中膜外区有418个氨基酸，一个N端和5个糖基化位点；跨膜区有264个氨基 酸，呈疏水性，包含7个跨膜区，膜外和膜内各3个环区；膜内区有82个氨基酸，有一个C端和C 激酶磷酸化位点。TSHR的膜外区有两个分别为第38～45位和第317～366位氨基酸残基的独 特插入片段。第1插入区(第38～45位)与TSH和TRAb与hTSHR的结合有关。第2插入区，包含50 个氨基酸残基，位于第317～366位，可能是TSHR羧基端与氨基端相连接的部位，可称之为连 接肽，在连接肽的上下游各有一个裂解位点，在翻译后加工过程中，TSHR的膜外区可在这两 个位点裂解以切除第二个插入区，从而TSHR形成两个亚基：氨基端部分的A亚基和羧基端部 分的B亚基，亚基和亚基通过二硫键连接，然后二硫键在蛋白质二硫键异构酶的作用下被还 原破坏。B亚基保留在细胞膜上并释放A亚基，称为A亚基脱落。去除残基第317～366位并不 影响TSHR的功能，包括与TSH的结合和细胞内TSH介导的cAMP的聚集。由于单独的TSHR蛋白 表达量太低，需要研发一种提高TSHR蛋白表达量的方法。 3 CN 111548422 A 说 明 书 2/9 页
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应 用。该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题，使表达量高达100mg/L。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白，该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR 蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。 由于单独的TSHR蛋白表达量太低，本申请选择融合一个表达量相对较高的分泌型 蛋白HER2在融合蛋白的N端(选取TSHR胞外区的21-400的氨基酸为融合蛋白表达的片段)， HER2是具有185KD编码分子量的一种跨膜糖蛋白，定位于17号染色体长臂2区1带，它编码一 种具有酪氨酸激酶(PTK)活性的跨膜糖蛋白。本技术方案为：构建瞬时表达质粒--细胞培 养--细胞转染--收获融合蛋白；构建稳定表达质粒--细胞培养--构建稳定表达细胞株--持 续的收获融合蛋白。本发明中利用了本实验室中已经存在的HER2基因和TSHR全长基因序 列，将其克隆至瞬时表达质粒和稳定表达质粒中，将质粒转染至CHO细胞中，收获上清中的 蛋白。 作为优选，HER2蛋白位于融合蛋白的N端，TSHR蛋白位于融合蛋白的C端。 作为优选，TSHR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 作为优选，HER2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 作为优选，连接肽的氨基酸序列为GxSnGx，其中，n选自1、2、3，x选自3、4、5。 作为优选，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。 本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建瞬时表达质粒，细胞 培养，细胞转染，收获融合蛋白。 本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建稳定表达质粒，细胞 培养，构建稳定表达细胞株，收获融合蛋白。 本发明还提供了该融合蛋白在制备TSAb检测试剂盒中的应用。 本发明还提供了一种TSAb检测试剂盒，包括上述融合蛋白。 本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋 白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。本发明的优点在于： 将高表达的蛋白(HER2)与低表达的蛋白(TSHR)融合表达，在不影响TSHR的结构与 功能下，可以提高TSHR的产量和稳定性，并使得TSHR蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。 附图说明 图1为构建瞬转体系中PCMV3质粒图； 图2为构建瞬转体系中PCR扩增TSHR结果； 图3为瞬转体系中蛋白的表达和纯化；Western blot结果中，1是阴性细胞上清，2 是表达TSHR细胞上清；SDS-PAGE结果中，3是未纯化的细胞上清，4是纯化后的蛋白； 图4为稳转体系中蛋白的表达和纯化；Western blot结果中，1是阴性细胞上清，2 是表达TSHR细胞上清；SDS-PAGE结果中，3是未纯化的细胞上清，4是纯化后的蛋白； 图5为临床相关性。 4 CN 111548422 A 说 明 书 3/9 页
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。本发明HER2与低表达的TSHR融合表达，在不影响TSHR的结构与功能下，可以提高TSHR的产量和稳定性，并使得TSH 全部
背景技术：
人源促甲状腺激素受体(TSHR)主要存在甲状腺滤泡细胞膜上，部分分布于肝细 胞、淋巴细胞、脂肪细胞、眼后成纤维细胞、神经元细胞和星形胶质细胞。hTSHR是一种七次 跨膜蛋白，隶属于G蛋白偶联受体家族中的亚家族即糖蛋白受体，该蛋白具有较大的胞外 区，跨膜区和胞内区。胞外区负责结合蛋白配体，包括糖蛋白激素和松弛素，其跨膜区负责 受体活化和传递G蛋白的信号转导，激活腺苷酸环化酶产生cAMP，启动细胞cAMP第二信号系 统的信号级联反应。 在正常生理状态下，促甲状腺激素(TSH)与TSHR特异性结合，启动细胞cAMP第二信 号系统，可以促进甲状腺激素分泌，提高甲状腺的摄碘能力，促进甲状腺激素的合成、释放， 进而调节甲状腺滤泡细胞生长、分化和功能。在病理状态下，自身反应性T、B细胞被激活，体 内产生抗TSHR的抗体，而TSHR与刺激性抗体(TSAb)结合，可以刺激甲状腺细胞增生和功能 亢进，过多的合成和分泌甲状腺激素从而引起甲亢；当TSHR与刺激阻断型抗体(TSBAb)结 合，阻断TSH的刺激功能，抑制甲状腺功能，从而引起甲状腺功能减低。例如如果TSH受体的 抗体以TSAb为主，临床上表现为格雷夫斯病(Graves’disease)病；如果以TSBAb为主，临床 上则表现为原发性甲状腺功能减退症。因此临床上以检测血浆中TSHR刺激性抗体(TSAb)来 诊断格雷夫斯病。将抗HER2抗体包被在包被板上，TSHR的融合蛋白被特异性的吸附在包被 抗HER2抗体的发光板上，捕获血清中抗TSHR的抗体，用HRP标记的相对应的TSHR抗体竞争法 定量血清中刺激性抗体(TSAb)的含量。 TSHR基因位于人的14号染色体长臂上，基因全长大约60kb，内有10个外显子和9个 内含子，开放阅读框含有2295个核苷酸编码，含有764位氨基酸。TSHR蛋白分为膜外区、跨膜 区和膜内区，其中膜外区有418个氨基酸，一个N端和5个糖基化位点；跨膜区有264个氨基 酸，呈疏水性，包含7个跨膜区，膜外和膜内各3个环区；膜内区有82个氨基酸，有一个C端和C 激酶磷酸化位点。TSHR的膜外区有两个分别为第38～45位和第317～366位氨基酸残基的独 特插入片段。第1插入区(第38～45位)与TSH和TRAb与hTSHR的结合有关。第2插入区，包含50 个氨基酸残基，位于第317～366位，可能是TSHR羧基端与氨基端相连接的部位，可称之为连 接肽，在连接肽的上下游各有一个裂解位点，在翻译后加工过程中，TSHR的膜外区可在这两 个位点裂解以切除第二个插入区，从而TSHR形成两个亚基：氨基端部分的A亚基和羧基端部 分的B亚基，亚基和亚基通过二硫键连接，然后二硫键在蛋白质二硫键异构酶的作用下被还 原破坏。B亚基保留在细胞膜上并释放A亚基，称为A亚基脱落。去除残基第317～366位并不 影响TSHR的功能，包括与TSH的结合和细胞内TSH介导的cAMP的聚集。由于单独的TSHR蛋白 表达量太低，需要研发一种提高TSHR蛋白表达量的方法。 3 CN 111548422 A 说 明 书 2/9 页
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应 用。该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题，使表达量高达100mg/L。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白，该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR 蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。 由于单独的TSHR蛋白表达量太低，本申请选择融合一个表达量相对较高的分泌型 蛋白HER2在融合蛋白的N端(选取TSHR胞外区的21-400的氨基酸为融合蛋白表达的片段)， HER2是具有185KD编码分子量的一种跨膜糖蛋白，定位于17号染色体长臂2区1带，它编码一 种具有酪氨酸激酶(PTK)活性的跨膜糖蛋白。本技术方案为：构建瞬时表达质粒--细胞培 养--细胞转染--收获融合蛋白；构建稳定表达质粒--细胞培养--构建稳定表达细胞株--持 续的收获融合蛋白。本发明中利用了本实验室中已经存在的HER2基因和TSHR全长基因序 列，将其克隆至瞬时表达质粒和稳定表达质粒中，将质粒转染至CHO细胞中，收获上清中的 蛋白。 作为优选，HER2蛋白位于融合蛋白的N端，TSHR蛋白位于融合蛋白的C端。 作为优选，TSHR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 作为优选，HER2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 作为优选，连接肽的氨基酸序列为GxSnGx，其中，n选自1、2、3，x选自3、4、5。 作为优选，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。 本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建瞬时表达质粒，细胞 培养，细胞转染，收获融合蛋白。 本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建稳定表达质粒，细胞 培养，构建稳定表达细胞株，收获融合蛋白。 本发明还提供了该融合蛋白在制备TSAb检测试剂盒中的应用。 本发明还提供了一种TSAb检测试剂盒，包括上述融合蛋白。 本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋 白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。本发明的优点在于： 将高表达的蛋白(HER2)与低表达的蛋白(TSHR)融合表达，在不影响TSHR的结构与 功能下，可以提高TSHR的产量和稳定性，并使得TSHR蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。 附图说明 图1为构建瞬转体系中PCMV3质粒图； 图2为构建瞬转体系中PCR扩增TSHR结果； 图3为瞬转体系中蛋白的表达和纯化；Western blot结果中，1是阴性细胞上清，2 是表达TSHR细胞上清；SDS-PAGE结果中，3是未纯化的细胞上清，4是纯化后的蛋白； 图4为稳转体系中蛋白的表达和纯化；Western blot结果中，1是阴性细胞上清，2 是表达TSHR细胞上清；SDS-PAGE结果中，3是未纯化的细胞上清，4是纯化后的蛋白； 图5为临床相关性。 4 CN 111548422 A 说 明 书 3/9 页
