技术摘要：
本发明涉及中药领域，即一种血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法，用于治疗脑血栓。由黄芪，地龙，土鳖虫，水蛭，桃仁，川芎，橘红，当归，鸡血藤按规定量制成，具有较好的治疗心脑血管疾病的功效。实验结果显示，血栓通脉胶囊含药血清可显著提高H2O2（过氧化氢）处  全部
背景技术：
在现有技术中，心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高血压、 动脉粥样硬化、高脂血症、血液粘稠等因素导致的心脏、大脑及全身组织发生的出血性或缺 血性疾病。心脑血管疾病在世界范围内都是死亡的主要原因。根据目前的流行病学资料显 示，预计到2020年，尽管导致死亡的疾病顺序将发生重大变化，冠心病和脑出血将仍然是人 类的第一和第二大致死因素。尽管学界对这些疾病的认识已经有了长足的进展，但传统药 物的治疗作用并没有取得令人满意的结果。然而，最近的研究表明，天然药物和传统中医草 药是预防治疗心脑血管疾病的潜在候选药物。 我国心血管疾病的相关防治工作已取得初步成效，但与此同时，也面临着新的挑 战。总体来说，我国心血管疾病的患病率及死亡率仍处于上升阶。我国心血管疾病的死亡率 位居首位，远高于肿瘤及其它疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上，特别是农村近几年来 心血管疾病的死亡率持续高于城市。中西医联合治疗，可显著降低心脑血管疾病患者的猝 死、心肌梗死、脑卒中等情况的发生，明显改善患者生存质量。心血管疾病负担日渐加重，已 成为我国的一个重大公共卫生问题，防治心血管病，研究开发新的针对心血管疾病的特效 中药复方制剂刻不容缓（《中国心血管病报告2018》概要[J].中国循环杂志,2019.03）。治疗 心脑血管疾病中药种类繁多，疗效各异。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述不足而提供一种血栓通脉药物、制备方法及含量测定方 法。采用现代医学研究手段，对血栓通脉胶囊组方、制备工艺、质量标准以及体内外的功能 研究，为进一步的生产及临床应用打下基础。 本发明的技术解决方案是：血栓通脉药物，其特征在于其药用有效成分由以下重 量份数的原料药制成：黄芪25－35份，地龙8－12份，土鳖虫8－12份，水蛭8－12份，桃仁 15－25份，川芎12－18份，橘红12－18份，当归12－18份，鸡血藤12－18份。优选剂型为胶 囊，即血栓通脉胶囊。 优选，血栓通脉胶囊，其特征在于其药用有效成分由以下重量份数的原料药制成： 黄芪30g，地龙10g，土鳖虫10g，水蛭10g，桃仁20g，川芎15g，橘红15g，当归15g，鸡血藤15g。 浸膏与辅料配比为6:4。 方解：君药：黄芪，补气固表，利尿脱毒。臣药：地龙：清热，平肝，通络。土鳖虫：破血 逐瘀。水蛭：抗凝血，降血脂。桃仁：活血祛瘀，润肠通便。川芎：活血行气，祛风止痛。佐药：橘 红：理气宽中，燥湿化痰。当归：补血活血，润肠通便。鸡血藤：行血补血，舒筋活络。脑血栓形 成属于中医药学脑卒中范畴，患者多为中老年人。病机为本虚标实，元气亏虚，气虚行动无 4 CN 111588763 A 说　明　书 2/27 页 力，痰浊，淤血互结，内阻脉络，气血运行受阻，肢体筋脉失于濡养。痰浊与淤血互相依存，由 淤血必有痰浊，有痰浊必有淤血。因此，治疗应以补气活血通络化痰开窍为法。血栓通脉汤， 以补阳还五汤为主，方中重用黄芪大补元气，气旺则血行，血行则瘀除。虫类药破血逐瘀、当 归活血养血、橘红化痰、鸡血藤通络、全方体现活血化瘀、舒经通络，以达到治疗患者心脑血 管疾病，延缓心脑血管血栓形成的作用。 制备方法：栓通脉药物的制备方法，用8倍溶剂量的70%乙醇，先浸泡药材过夜，再 加热回流1h，提取2次，将药液过滤，而后旋转蒸发仪蒸发药液，待药液略呈粘稠状，将药液 装入蒸发皿中，75℃水浴蒸干，再55℃减压烘干制成浸膏；浸膏粉与辅料淀粉按6:4比例混 合，再喷以适量85%乙醇润湿，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥，再过40目筛， 去除粉尘，灌装，包装，即得血栓通脉胶囊。 血栓通脉药物的含量测定方法，其特征在于该方法中包括如下任一种或几种组 合： （1）黄芪甲苷的含量测定： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain  C18  柱（5μm，4 .6× 250mm），使用蒸发光散射检测器检测，流动相选择乙腈-水（35:65），流动相流速为1.0ml/ min，柱温40℃，漂移管温度40℃。精密称定黄芪甲苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.05μg/μ l，0.10μg/μl  ，0.25μg/μl，0.50μg/μl，0.75μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC 获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标，绘制标准曲线。得到黄芪甲苷线 性回归方程y=2219906.5685x-741089.8761，相关系数R2=0.9981，表明其在0.5-7.5μg之间 线性关系良好。 （2）阿魏酸的含量测定： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain  C18柱（5μm，4.6×250mm）， 流动相选择乙腈-水（17:83），检测波长为316nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃。精密 称定阿魏酸标准品，加甲醇配制成浓度为0.10μg/μl、0.20μg/μl、0.51μg/μl、0.71μg/μl、 1.00μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量 作为横坐标绘制标准曲线；得到阿魏酸线性回归方程y=298925x-47829，相关系数R2= 0.9983，表明其在1.0-10.0μg之间线性关系良好。 （3）橙皮苷含量测定： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain  C18  柱（5μm，4 .6× 250mm），流动相选择甲醇-水（40:60），检测波长为284nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35 ℃。精密称定橙皮苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.02μg/μl、1.53μg/μl、2.01μ g/μl、3.01μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标， 进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到橙皮苷线性回归方程y=298067x-169274，相关系数 R2=0.9992，表明其在5.0-30.1μg之间线性关系良好。 （4）苦杏仁苷含量测定 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain  C18  柱（5μm，4 .6× 250mm），流动相选择甲醇-水（20:80），检测波长为210nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35 ℃。精密称定苦杏仁苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.01μg/μl、1.52μg/μl、 2.00μg/μl、3.02μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵 5 CN 111588763 A 说　明　书 3/27 页 坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到苦杏仁苷线性回归方程y=565333x-613222，相 关系数R2=0.9972，表明其在5.0-30.2μg之间线性关系良好。 功效：补气活血，通络化痰，破血逐瘀。 药物剂型不限于胶囊，按上述各药用原料与制药上常用的药用载体，如赋形剂或 辅料可以混合制成片剂、颗粒剂、散剂、丸剂或其它常规制剂。 本发明的优点是：1、血栓通脉胶囊是自主研发的天然药物制剂，具有较好的治疗 心脑血管疾病的功效，具有广阔的市场前景。2、本实验首先以乙醇浓度、溶剂量、提取时间 和提取次数为影响因素考察项目，设计L（349 ）正交试验表，经实验验证，确定最佳提取工艺， 即乙醇浓度70%，溶剂倍量8倍，提取次数2次，提取时间1h。考虑到服用及携带方便，将药物 改良为胶囊剂。综合考量辅料种类、浸膏与辅料配比、堆密度等因素，最终确定选择淀粉为 辅料，浸膏与辅料配比为6:4，以85%乙醇作为润湿剂，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒， 40℃干燥，再过40目筛，去除粉尘，得到颗粒，灌装胶囊即得（见实验例1）。3、本研究以《中国 药典》2015版作为依据，选取黄芪甲苷、阿魏酸、橙皮苷、苦杏仁苷4种有效成分，建立了稳 定、高效、方便、快捷的质量标准。4、实验结果显示，血栓通脉胶囊含药血清可显著提高H2O2 （过氧化氢）处理的HUVEC的细胞活力，降低LDH、MDA、ROS含量，并提高GSH（谷胱甘肽）、NO（一 氧化氮）、SOD（超氧化物歧化酶）含量，提示血栓通脉胶囊含药血清具有一定的保护血管内 皮细胞免受氧化损伤的能力（见实验例2）。5、实验结果显示，与对照组相比，血栓通脉胶囊 可显著抑制SD大鼠体内及体外血栓形成，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组效果好于 低剂量组。同时血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠血小板聚集，且随剂量增加，抑制效果增 强，高剂量组抑制率甚至可达到77.56%。与对照组相比，血栓通脉胶囊可显著延长昆明小鼠 的出血时间及凝血时间，随给药剂量的提高，出血时间显著延长，高剂量组效果最好，而低 剂量组的凝血时间要长于高剂量组。与模型组相比，血栓通脉胶囊可显著下调SD大鼠血清 中TXB2、ET-1含量，而提高6-Keto-PGF1α含量。以上结果均提示血栓通脉胶囊可能增强SD大 鼠及昆明小鼠的抗栓能力（见实验例3）。6、通过对血栓通脉胶囊黄芪组分进行薄层鉴别和 高效液相检测，再按照《中国药典》2015版四部制剂通则中胶囊剂项下的要求，进行相应项 目检查，建立质量标准。结果显示：供试品、对照药材/对照标准品，在薄层色谱上显现的斑 点位置相同，而阴性对照样品在相同的位置无对应斑点；供试品中各有效成分含量较高；胶 囊剂项下的水分检测、崩解时限、装量差异等项目均符合药典规定。按照《中国药典》2015版 四部通则9001胶囊剂项下检测标准，进行影响因素试验、加速试验检测，结果表明血栓通脉 胶囊稳定性良好。6、经血栓通脉胶囊治疗脑血栓累计50例临床观察：治愈率48％，显效率 88％，有效率98％，无效率2％。疗效显著。 下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 附图说明 图1  黄芪甲苷标准曲线。 图2  制剂中黄芪紫外灯（365nm）下TLC鉴别图谱。 图3 阿魏酸标准曲线。 图4 橙皮苷标准曲线。 图5  苦杏仁苷标准曲线。 6 CN 111588763 A 说　明　书 4/27 页 图6 大鼠腹主动脉分离。 图7  HUVEC在不同浓度H2O2处理下细胞活力比较。 图8 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC细胞活力的影响。 图9不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC  LDH释放量的影响。 图10不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中GSH含量的影响。 图11不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中NO含量的影响。 图12不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中SOD含量的影响。 图13不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中MDA含量的影响。 图14血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、eif2α、  cleaved  caspase-3和GAPDH表达水平的影响。 图15不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、 eif2α、  cleaved  caspase-3和GAPDH表达水平的影响。 图16 是FeCl3诱导SD大鼠颈总动脉血栓形成。 图17 是血栓通脉胶囊对FeCl3诱导SD大鼠颈总动脉血栓重量的影响。 图18 血栓通脉胶囊对SD大鼠体外血栓形成血栓重量的影响。 图19血栓通脉胶囊对SD大鼠血小板聚集的影响。 图20 血栓通脉胶囊对昆明小鼠出血时间的影响。 图21 血栓通脉胶囊对昆明小鼠凝血时间的影响。 图22 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TX2含量的影响。 图23 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量的影响。 图24 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中ET-1含量的影响。