技术摘要：
本发明涉及一种基于新型自发光纳米多孔材料Au@Gd‑MOFs的信号增强型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，首次以自发光纳米多孔材料Au@Gd‑MOFs为电化学发光信号源，利用超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2较传统二维片状材料拥有大 全部
背景技术：
降钙素原（procalcitonin，PCT），是人体血浆中的一种大分子蛋白质，在健康个体 中的浓度非常低（≤ 0.1 ng mL），但在内毒素等细胞因子诱导下，2 h ~ 3 h开始增加，可 在血浆中检测到，6 h ~ 8 h内浓度快速升高，可以反映全身炎症反应的活跃程度，是诊断 和检测细菌炎性疾病感染的一个重要参数。PCT水平的升高会出现严重休克、全身性炎症反 应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS）。有效快速的检测PCT可以监测感染危险 的患者（如外科术后和器官移植后免疫抑制期，多处创伤后）、需要重症监护患者以及探测 细菌感染的全身影响和脓毒性并发症。故寻找一种可以简便快捷灵敏的PCT检测方法有着 重要意义。电致化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，同时兼有电化学和 化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本发明设计了一种信号增强型型 电致化学发光免疫分析方法用于人体血清中PCT的检测。 在本发明中，首次使用一种新型自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs作为标记材料引 入到电化学发光领域。一般传统的电致化学发（ECL）会依赖于Ru(bpy) 2 3 、鲁米诺等典型的 具有发光性能的发光体，其实验操作需要首先找到适合负载这些发光体的功能材料，如需 具有较大的孔隙率、尺寸合适的孔径以及表面是否有可连接的官能团和可进行静电吸附的 电荷，并设法将这些功能材料和发光体复合到一起。这样虽然可以达到化学发光的效果，但 负载其表面的发光体经常会因为结合力不强或其它外力作用导致脱落，从而输出不确定的 检测结果，对传感器的稳定性影响非常大。所以，采用自发光材料来构建化学发光传感器就 可以非常有效的避免这一难题。镧系金属元素通常有很强的荧光发射，而且像Gd离子的荧 光寿命可长达到1~2 ms。经实验证明，基于镧系金属Gd元素合成的Gd-MOFs有着非常强烈的 ECL发射行为。此外，将金纳米颗粒修饰到其表面后，也会曾强ECL发射强度。这不仅保障了 Au@Gd-MOFs可以输出强且稳定的ECL信号，大大简化了实验步骤，而且还提高了其生物相容 性。另外我们利用Pt@Ni(OH)2超薄纳米片聚集而成的纳米花作为基底材料，较普通二维片 状、球状或n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接PCT抗体。从而 可以更加精准的捕获PCT，大大的提高ECL免疫传感器的灵敏度。本发明的原理是随着捕获 PCT的量的增加，连接到传感器表面的自发光材料Au@Gd-MOFs标记的二抗越多，ECL信号逐 渐增强。此外，本发明设计的信号增强型免疫传感器也为其它大分子蛋白质分析物的检测 4 CN 111721825 A 说 明 书 2/7 页 提供了一种新方法。目前基于自发光纳米材料Au@Gd-MOFs构建信号增强型ECL免疫传感器 来检测PCT的方法还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种更灵敏准确的基于自发光纳米材料Au@Gd-MOFs的电致 化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对大分子蛋白PCT的快速、特异、高效检测。 本发明的技术方案如下： 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 1. 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记 PCT偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1 mg ~ 2 mg六水合硝酸镍、1 g ~ 2 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水 中，磁力搅拌5 min ~ 15 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1: 1:1）超声5 min ~ 15 min，出去泡沫镍表面的油层，继续浸没在0.1 mmol L -1 ~ 0.5 mmol L-1盐酸溶液中超声5 min ~ 15 min除去表面氧化物，超纯水、乙醇依次洗涤，低温下氮气吹 干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，80 ℃ ~ 120 ℃ 反应8 h ~ 12 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni (OH)2； 将30 mg ~ 50 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯铂酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子 的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌 8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空 干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将30 mg ~ 40 mg六水合氯化钆和5 mmoL ~ 15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺 （DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h ~ 3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压 反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应6 h ~ 18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃ 真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将30 mg ~ 50 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在 50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠， 0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物， 超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将6 mg ~ 10 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/ mL的PCT溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的 PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭PCT表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最 后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶 液，储存于4 ℃中备用。 5 CN 111721825 A 说 明 书 3/7 页 2. 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法， 包括以下步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面， 室温下晾干； （3）将6 μL、8 μg/mL ~ 12 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键 和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极 表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极 表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增 强型电致化学发光免疫传感器。 3. 电致化学发光传感器用于待测样品的电化学发光检测： （1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极 为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和 化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s； （2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为1 mmol/L ~ 12 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液 中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的PCT标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘 制工作曲线； （3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。 本发明的有益成果 （1）首次以自发光纳米材料Au@Gd-MOFs用于电致化学发光传感器的构建中，利用Au@ Gd-MOFs高且稳定的发光效率来提高传感器光信号的稳定输出，从而获得更高的灵敏度； （2）采用Pt@Ni(OH)2超薄纳米片聚集而成的纳米化作为基底材料，较二维片状、球状或 n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接PCT抗体，更加精准的捕 获PCT，同样可以大大提高传感器的灵敏度； （3）本发明首次将自发光纳米多孔Au@Gd-MOFs和Pt@Ni(OH)2超薄纳米片相结合用于电 致化学发光传感器的构建，基于此构建的传感器可应用于降钙素原PCT的临床检测，具有操 作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.01 ng/mL ~ 20 ng/mL）和检出限低（0.003 ng/mL） 的优点。 实施例1 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1 mg六水合硝酸镍、1 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌5 6 CN 111721825 A 说 明 书 4/7 页 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声5 min，出去泡沫 镍表面的油层，继续浸没在0.1 mmol L-1盐酸溶液中超声5 min除去表面氧化物，超纯水、乙 醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压 反应釜中，80 ℃反应8 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳米花 Pt@Ni(OH)2； 将30 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入1 mL、1%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入4 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入70 mg还原剂 柠檬酸三钠，0.5 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超 纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将30 mg六水合氯化钆和5 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混 合溶液中，磁力搅拌1 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃反应6 h，乙醇 和超纯水分别洗涤两次，40 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将30 mg纳 米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL、1%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入 4 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg硼 氢化钠，室温下搅拌8 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无 色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将6 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃ 恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h封闭PCT表面的非特异性活 性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中， 制得0.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例2 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1.5 mg六水合硝酸镍、1.5 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌 10 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声10 min，出去 泡沫镍表面的油层，继续浸没在0.25 mmol L-1盐酸溶液中超声10 min除去表面氧化物，超 纯水、乙醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内 衬高压反应釜中，100 ℃反应10 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成 的纳米花Pt@Ni(OH)2； 将40 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入2 mL、2%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入5 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入80 mg还原剂 柠檬酸三钠，0.75 mg硼氢化钠，室温下搅拌10 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物， 超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将35 mg六水合氯化钆和10 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的 7 CN 111721825 A 说 明 书 5/7 页 混合溶液中，磁力搅拌2 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，150 ℃反应12 h， 乙醇和超纯水分别洗涤两次，50 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将40 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入2 mL、2%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min， 加入5 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入80 mg还原剂柠檬酸三钠，0.75 mg硼氢化钠，室温下搅拌10 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清 液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将8 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入5 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃ 恒温振荡培养箱中振荡孵化18 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化3 h封闭PCT表面的非特异性活 性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中， 制得1 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例3 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将2 mg六水合硝酸镍、2 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌15 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声15 min，出去泡沫 镍表面的油层，继续浸没在0.5 mmol L-1盐酸溶液中超声15 min除去表面氧化物，超纯水、 乙醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高 压反应釜中，120 ℃反应12 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳 米花Pt@Ni(OH)2； 将50 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入3 mL、3%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入90 mg还原剂 柠檬酸三钠，1 mg硼氢化钠，室温下搅拌12 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超纯 水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将40 mg六水合氯化钆和15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的 混合溶液中，磁力搅拌3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，160 ℃反应18 h， 乙醇和超纯水分别洗涤两次，60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将50 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入3 mL、3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min， 加入6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入90 mg还原剂柠檬酸三钠1 mg 硼氢化钠，室温下搅拌12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液 无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将10 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入6 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化4 h封闭PCT表面的非特异性 活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7 .5的PBS缓冲溶液 8 CN 111721825 A 说 明 书 6/7 页 中，制得1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例4 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、0.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、8 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将2 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、0.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾 干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学 发光免疫传感器。 实施例5 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、1 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、10 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将3 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、1 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干， 用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学发 光免疫传感器。 实施例6 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、1.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、12 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； 9 CN 111721825 A 说 明 书 7/7 页 （4）将4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾 干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学 发光免疫传感器。 实施例7 电致化学发光传感器用于PCT的电化学发光检测： （1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极 为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和 化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s； （2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为10 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化 学发光系统，检测对不同浓度的PCT溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线； （3）将待测样品溶液代替PCT溶液进行测定。 实施例8 人体血清样品中PCT的检测 人体血清样品经前处理后取得上清液1 mL，向其中加入不同浓度的PCT溶液，采用标准 加入法测定样品中PCT的平均回收率，结果见表1. 表1 样品中PCT的检测结果 表1检测结果可以看出，此人体血清提取液样品中PCT检测结果的回收率在95 .0 ~ 105%范围内，表明本发明可以用于谷物样品的检测，方法的精密度高，结果准确可靠。 10
本发明涉及一种基于新型自发光纳米多孔材料Au@Gd‑MOFs的信号增强型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，首次以自发光纳米多孔材料Au@Gd‑MOFs为电化学发光信号源，利用超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2较传统二维片状材料拥有大 全部
背景技术：
降钙素原（procalcitonin，PCT），是人体血浆中的一种大分子蛋白质，在健康个体 中的浓度非常低（≤ 0.1 ng mL），但在内毒素等细胞因子诱导下，2 h ~ 3 h开始增加，可 在血浆中检测到，6 h ~ 8 h内浓度快速升高，可以反映全身炎症反应的活跃程度，是诊断 和检测细菌炎性疾病感染的一个重要参数。PCT水平的升高会出现严重休克、全身性炎症反 应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS）。有效快速的检测PCT可以监测感染危险 的患者（如外科术后和器官移植后免疫抑制期，多处创伤后）、需要重症监护患者以及探测 细菌感染的全身影响和脓毒性并发症。故寻找一种可以简便快捷灵敏的PCT检测方法有着 重要意义。电致化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，同时兼有电化学和 化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本发明设计了一种信号增强型型 电致化学发光免疫分析方法用于人体血清中PCT的检测。 在本发明中，首次使用一种新型自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs作为标记材料引 入到电化学发光领域。一般传统的电致化学发（ECL）会依赖于Ru(bpy) 2 3 、鲁米诺等典型的 具有发光性能的发光体，其实验操作需要首先找到适合负载这些发光体的功能材料，如需 具有较大的孔隙率、尺寸合适的孔径以及表面是否有可连接的官能团和可进行静电吸附的 电荷，并设法将这些功能材料和发光体复合到一起。这样虽然可以达到化学发光的效果，但 负载其表面的发光体经常会因为结合力不强或其它外力作用导致脱落，从而输出不确定的 检测结果，对传感器的稳定性影响非常大。所以，采用自发光材料来构建化学发光传感器就 可以非常有效的避免这一难题。镧系金属元素通常有很强的荧光发射，而且像Gd离子的荧 光寿命可长达到1~2 ms。经实验证明，基于镧系金属Gd元素合成的Gd-MOFs有着非常强烈的 ECL发射行为。此外，将金纳米颗粒修饰到其表面后，也会曾强ECL发射强度。这不仅保障了 Au@Gd-MOFs可以输出强且稳定的ECL信号，大大简化了实验步骤，而且还提高了其生物相容 性。另外我们利用Pt@Ni(OH)2超薄纳米片聚集而成的纳米花作为基底材料，较普通二维片 状、球状或n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接PCT抗体。从而 可以更加精准的捕获PCT，大大的提高ECL免疫传感器的灵敏度。本发明的原理是随着捕获 PCT的量的增加，连接到传感器表面的自发光材料Au@Gd-MOFs标记的二抗越多，ECL信号逐 渐增强。此外，本发明设计的信号增强型免疫传感器也为其它大分子蛋白质分析物的检测 4 CN 111721825 A 说 明 书 2/7 页 提供了一种新方法。目前基于自发光纳米材料Au@Gd-MOFs构建信号增强型ECL免疫传感器 来检测PCT的方法还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种更灵敏准确的基于自发光纳米材料Au@Gd-MOFs的电致 化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对大分子蛋白PCT的快速、特异、高效检测。 本发明的技术方案如下： 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 1. 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记 PCT偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1 mg ~ 2 mg六水合硝酸镍、1 g ~ 2 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水 中，磁力搅拌5 min ~ 15 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1: 1:1）超声5 min ~ 15 min，出去泡沫镍表面的油层，继续浸没在0.1 mmol L -1 ~ 0.5 mmol L-1盐酸溶液中超声5 min ~ 15 min除去表面氧化物，超纯水、乙醇依次洗涤，低温下氮气吹 干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，80 ℃ ~ 120 ℃ 反应8 h ~ 12 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni (OH)2； 将30 mg ~ 50 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯铂酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子 的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌 8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空 干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将30 mg ~ 40 mg六水合氯化钆和5 mmoL ~ 15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺 （DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h ~ 3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压 反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应6 h ~ 18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃ 真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将30 mg ~ 50 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在 50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠， 0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物， 超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将6 mg ~ 10 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/ mL的PCT溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的 PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭PCT表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最 后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶 液，储存于4 ℃中备用。 5 CN 111721825 A 说 明 书 3/7 页 2. 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法， 包括以下步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面， 室温下晾干； （3）将6 μL、8 μg/mL ~ 12 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键 和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极 表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极 表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增 强型电致化学发光免疫传感器。 3. 电致化学发光传感器用于待测样品的电化学发光检测： （1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极 为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和 化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s； （2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为1 mmol/L ~ 12 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液 中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的PCT标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘 制工作曲线； （3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。 本发明的有益成果 （1）首次以自发光纳米材料Au@Gd-MOFs用于电致化学发光传感器的构建中，利用Au@ Gd-MOFs高且稳定的发光效率来提高传感器光信号的稳定输出，从而获得更高的灵敏度； （2）采用Pt@Ni(OH)2超薄纳米片聚集而成的纳米化作为基底材料，较二维片状、球状或 n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接PCT抗体，更加精准的捕 获PCT，同样可以大大提高传感器的灵敏度； （3）本发明首次将自发光纳米多孔Au@Gd-MOFs和Pt@Ni(OH)2超薄纳米片相结合用于电 致化学发光传感器的构建，基于此构建的传感器可应用于降钙素原PCT的临床检测，具有操 作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.01 ng/mL ~ 20 ng/mL）和检出限低（0.003 ng/mL） 的优点。 实施例1 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1 mg六水合硝酸镍、1 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌5 6 CN 111721825 A 说 明 书 4/7 页 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声5 min，出去泡沫 镍表面的油层，继续浸没在0.1 mmol L-1盐酸溶液中超声5 min除去表面氧化物，超纯水、乙 醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压 反应釜中，80 ℃反应8 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳米花 Pt@Ni(OH)2； 将30 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入1 mL、1%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入4 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入70 mg还原剂 柠檬酸三钠，0.5 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超 纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将30 mg六水合氯化钆和5 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混 合溶液中，磁力搅拌1 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃反应6 h，乙醇 和超纯水分别洗涤两次，40 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将30 mg纳 米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL、1%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入 4 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg硼 氢化钠，室温下搅拌8 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无 色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将6 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃ 恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h封闭PCT表面的非特异性活 性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中， 制得0.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例2 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将1.5 mg六水合硝酸镍、1.5 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌 10 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声10 min，出去 泡沫镍表面的油层，继续浸没在0.25 mmol L-1盐酸溶液中超声10 min除去表面氧化物，超 纯水、乙醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内 衬高压反应釜中，100 ℃反应10 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成 的纳米花Pt@Ni(OH)2； 将40 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入2 mL、2%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入5 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入80 mg还原剂 柠檬酸三钠，0.75 mg硼氢化钠，室温下搅拌10 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物， 超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将35 mg六水合氯化钆和10 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的 7 CN 111721825 A 说 明 书 5/7 页 混合溶液中，磁力搅拌2 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，150 ℃反应12 h， 乙醇和超纯水分别洗涤两次，50 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将40 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入2 mL、2%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min， 加入5 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入80 mg还原剂柠檬酸三钠，0.75 mg硼氢化钠，室温下搅拌10 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清 液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将8 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入5 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃ 恒温振荡培养箱中振荡孵化18 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化3 h封闭PCT表面的非特异性活 性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中， 制得1 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例3 超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2、自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT 偶联抗原孵化物溶液的制备 （1）超薄纳米片聚集而成的纳米花Pt@Ni(OH)2的制备 将2 mg六水合硝酸镍、2 g换六亚甲基四胺（HMT）加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌15 min，取5 cm*1.5 cm*0.1 cm的泡沫镍，浸入i-丙醇:丙酮:水（1:1:1）超声15 min，出去泡沫 镍表面的油层，继续浸没在0.5 mmol L-1盐酸溶液中超声15 min除去表面氧化物，超纯水、 乙醇依次洗涤，低温下氮气吹干，称重，和上述混合液一起转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高 压反应釜中，120 ℃反应12 h，得到目标产物，冷冻干燥，即得到超薄纳米片聚集而成的纳 米花Pt@Ni(OH)2； 将50 mg超薄纳米片Pt@Ni(OH)2分散在50 mL超纯水中，加入3 mL、3%的氯铂酸溶液，室 温下搅拌5 min，加入6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制铂纳米粒子的团聚，然后加入90 mg还原剂 柠檬酸三钠，1 mg硼氢化钠，室温下搅拌12 h，溶液慢慢变成深棕色，离心分离悬浮物，超纯 水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到深棕色固体Pt@Ni(OH)2； （2）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs的制备 将40 mg六水合氯化钆和15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的 混合溶液中，磁力搅拌3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，160 ℃反应18 h， 乙醇和超纯水分别洗涤两次，60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Gd-MOFs，将50 mg纳米多孔Gd-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入3 mL、3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min， 加入6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入90 mg还原剂柠檬酸三钠1 mg 硼氢化钠，室温下搅拌12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液 无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Gd-MOFs； （3）自发光纳米多孔材料Au@Gd-MOFs标记PCT孵化物溶液的制备 将10 mg的Au@Gd-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入6 μL、6 mg/mL的PCT溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的PCT偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化4 h封闭PCT表面的非特异性 活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7 .5的PBS缓冲溶液 8 CN 111721825 A 说 明 书 6/7 页 中，制得1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT溶液，储存于4 ℃中备用。 实施例4 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、0.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、8 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将2 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、0.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾 干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学 发光免疫传感器。 实施例5 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、1 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、10 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （4）将3 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、1 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干， 用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学发 光免疫传感器。 实施例6 一种基于镧系金属自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下 步骤： （1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处 理，用超纯水冲洗干净； （2）将6 µL、1.5 mg/mL Pt@Ni(OH)2超薄纳米片水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干； （3）将6 μL、12 μg/mL的PCT第一抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过铂胺键和基底材料 连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； 9 CN 111721825 A 说 明 书 7/7 页 （4）将4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上 非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干； （5）将6 μL、一定浓度的PCT溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃ 晾干； （6）将6 μL、1.5 mg/mL的Au@Gd-MOFs标记PCT第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾 干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Gd-MOFs的信号增强型电致化学 发光免疫传感器。 实施例7 电致化学发光传感器用于PCT的电化学发光检测： （1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极 为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和 化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s； （2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为10 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化 学发光系统，检测对不同浓度的PCT溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线； （3）将待测样品溶液代替PCT溶液进行测定。 实施例8 人体血清样品中PCT的检测 人体血清样品经前处理后取得上清液1 mL，向其中加入不同浓度的PCT溶液，采用标准 加入法测定样品中PCT的平均回收率，结果见表1. 表1 样品中PCT的检测结果 表1检测结果可以看出，此人体血清提取液样品中PCT检测结果的回收率在95 .0 ~ 105%范围内，表明本发明可以用于谷物样品的检测，方法的精密度高，结果准确可靠。 10
