技术摘要：
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞。所述方法将RNP复合物通过电转的方法转入T细胞中，使其分化成为ITNK细胞，所述方法能够提高体外重编程效率，且得到ITNK细胞具有较好的体外扩增  全部
背景技术：
CRISPR(Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats，规律 成簇间隔短回文重复系统)，CRISPR/Cas是一种具有核酸内切酶活性的复合体，其中Cas是 CRISPR相关的蛋白质。CRISPR/Cas能够识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链 DNA断裂(Double-strand  breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接 (Non-homologous  end  joining,NHEJ) ,造成移码突变(frameshift  mutation)，导致基因 敲除。 CRISPR/Cas系统是一种原本存在于自然界原核生物中的免疫防御系统，用来抵抗 噬菌体或者病毒等外来遗传物质的入侵。它为细菌提供了获得性免疫(类似于哺乳动物的 二次免疫)，当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR/Cas 系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，使外源基因的表达沉默，从而达到抵抗病毒干扰 的目的。 由于CRISPR/Cas系统精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因 编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种。其 中，Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA：crRNA(CRISPR  RNA)和tracrRNA(trans- activating  crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，已经能够将这两种小RNA融合 成一条RNA链，简称sgRNA(single  guide  RNA)。不过，尽管这种技术已经成功应用于多种细 胞系，它对原代细胞的编辑效率却非常低，严重限制了CRISPR技术在原代细胞上的应用。 T细胞是适应性免疫系统中非常重要的调节和效应细胞，近年来基于T细胞的免疫 治疗技术受到了越来越多的关注。同时，人们也在不断尝试对T细胞进行基因编辑以研究其 激活分化机制或者增强其抗肿瘤功能。Li等人在2010年首次提出且成功将小鼠T细胞重编 程成NK样细胞(induced  T-to-natural  killer  cells，ITNK细胞)(具体参见Li ,P .et  al .Reprogramming  of  T  cells  to  natural  killer-like  cells  upon  Bcl11b  deletion.Science  329,85-89(2010) .)，并于近年采用CRISPR/Cas9技术成功地将人T细胞 重编程成为ITNK细胞。 为进一步提高重编程效率，有研究者尝试将Cas9和gRNA通过病毒载体或者电转的 方式对原代T细胞进行基因编辑，但是打靶效率非常低，而且直接电转DNA会对T细胞造成较 高毒性。还有研究者尝试电转Cas9和体外转录或合成的单链gRNA的复合物来提高对原代T 细胞的编辑效率(参见Rutz ,S .&Seki ,A .Optimized  RNP  transfection  for  highly  efficient  CRISPR/Cas9-mediated  gene  knockout  in  primary  T  cells .Journal  of  Experimental  Medicine  215,985-997(2018) .)。但是，使用CRISPR/CAS9技术重编程ITNK 细胞仍然面临效率低且毒性大等问题。 3 CN 111607569 A 说　明　书 2/6 页 因此，如何进一步提高重编程效率、降低对细胞的毒性，同时提高重编程后细胞的 功能，得到打靶效率较高且能有效识别和杀伤肿瘤细胞的重编程ITNK细胞，是本领域急需 解决的问题。
技术实现要素：
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞 的方法，该方法操作步骤较为简单，重编程效率较高，且能够获得扩增能力较好、杀伤肿瘤 细胞效率高的重编程ITNK细胞。 为达此目的，本发明采用以下技术方案： 第一方面，基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，所述方法通过电转化将RNP 复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞；所述RNP复合物包括crRNA、tracrRNA和 Cas9蛋白。 本发明中，采用电转化的方式将RNP复合物转入T细胞当中，所述T细胞为原代T细 胞，通过此方法可以实现对原代T细胞的基因编辑，将其转化成NK样细胞，即ITNK细胞，且该 方法重编程效率较高；同时，通过该方法制备得到的ITNK细胞的体外扩增能力较强，对肿瘤 细胞的杀伤能力也较好。 本发明中，所述crRNA表示CRISPR  RNA，tracrRNA表示trans-activating  crRNA， crRNA和tracrRNA结合能够实现Cas9的靶向切割。 作为本发明优选的技术方案，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与 Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，例如可以是1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1: 4.5或1:5等。 优选地，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，例如可以 是1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.15或1:1.2等。 优选地，所述crRNA的靶基因包括Bcl11b基因。本发明中将原代T细胞中的Bcl11b 基因敲除，可以诱导原代T细胞分化为具有NK样细胞活性，称为ITNK细胞。 为了更加直观地凸显出电转RNP复合物的重编辑效率，重编辑后细胞的扩增能力 与杀伤能力，本发明以含有cas9蛋白和敲除Bcl11b  gRNA的PX458质粒(记为PX458- gBCL11b)为阳性对照组与电转RNP复合物的实验组进行了比较，实验中为了提高基因编辑 的成功率，使用了多种不同的sg-RNA的序列，其中，所使用的sg-RNA的序列包括SEQ  ID  NO.1～6： sgRNA1：gaccctgacctgctcacctg(SEQ  ID  NO.1) sgRNA2：gaccatgaactgctcacttg(SEQ  ID  NO.2) sgRNA3：gaagcagtgtggcggcagct(SEQ  ID  NO.3) sgRNA4：gaagcattgtggcttcagct(SEQ  ID  NO.4) sgRNA5：ggtcagacggaggctccctt(SEQ  ID  NO.5) sgRNA6：ggtcatccggaggctcgatt(SEQ  ID  NO.6)。 通过mMESSAGE  mMACHINETM  T7  Transcription  Kit试剂盒体外获得靶向基因的 gRNA的mRNA产品。与直接电转质粒PX458-gBCL11b得到ITNK细胞相比，本发明提供的重编程 方法的效率较高，重编辑后细胞的扩增能力与杀伤能力都较好。 4 CN 111607569 A 说　明　书 3/6 页 优选地，所述RNP复合物的摩尔浓度为40～120μM，例如可以是40μM、50μM、60μM、70 μM、80μM、90μM、100μM、110μM或120μM等。 优选地，电转时所述RNP复合物与细胞的使用量比例为(2～100)μL:106个细胞，例 如可以是2μL:106个、5μL:106个、10μL:106个、15μL:106个、20μL:106个、25μL:106个、30μL: 106个、50μL:106个、60μL:106个、70μL:106个、80μL:106个、90μL:106个或100μL:106个等。 作为本发明优选的技术方案，所述crRNA的核苷酸序列为25～35bp，例如可以是 25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp或35bp等。 优选地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.7～12所示。 crRNA1：gaccctgacctgctcacctggttttagagcta(SEQ  ID  NO.7) crRNA2：gaccatgaactgctcacttggttttagagcta(SEQ  ID  NO.8) crRNA3：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta(SEQ  ID  NO.9) crRNA4：gaagcattgtggcttcagctgttttagagcta(SEQ  ID  NO.10) crRNA5：ggtcagacggaggctcccttgttttagagcta(SEQ  ID  NO.11) crRNA6：ggtcatccggaggctcgattgttttagagcta(SEQ  ID  NO.12) 作为本发明优选的技术方案，所述tracrRNA的核苷酸序列为50～60bp，例如可以 是50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp或60bp等。 优选地，所述tracrRNA的核苷酸序列可以是如SEQ  ID  NO.13和14所示的核苷酸序 列。 tracrRNA1：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg (SEQ  ID  NO.13) tracrRNA2：tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtg (SEQ  ID  NO.14)。 作为本发明优选的技术方案，所述电转化的电压为1.5～2.5kV，时间为3～5ms。 优选地，所述电转化结束后，所得细胞悬液置于完全培养基中培养。 优选地，所述完全培养基包括T551-H3完全培养基，所述T551-H3完全培养基中含 有质量分数为3～8％自体血清(例如可以是4％、5％、6％或7％等)，所述自体血清为T细胞 来源中的血清，所述T551-H3完全培养基中还包括400～800IU/mL(例如可以是500IU/mL、 600IU/mL、700IU/mL或750IU/mL等)hIL-2以及10～30μg/mL(例如可以是15μg/mL、20μg/mL、 25μg/mL或28μg/mL等)的硫酸庆大霉素。 作为本发明优选的技术方案，所述T细胞采用Ficoll密度梯度离心法进行分离。优 选地，所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选。 本发明中所述Ficoll密度梯度离心法与磁珠分选方法均为本领域常用的实验方 法。 作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤： (1)将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白制成RNP复合物，所述RNP复合物中crRNA和 tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，所述RNP复合物中crRNA和 tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.7～12所示，所 述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.13～14所示，所述crRNA的靶基因为Bcl11b基因； (2)采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血得到外周血单个核细胞，采用磁珠分 5 CN 111607569 A 说　明　书 4/6 页 选方法进行分选得到T细胞，并激活所述T细胞；所述激活时可以采用MACS激活试剂盒激活T 细胞24～48小时，再洗脱激活磁珠，得到激活的T细胞备用； (3)通过电转化的方法将步骤(1)所述的RNP复合物电转入步骤(2)所述激活的T细 胞中，之后再转入完全培养基中培养，培养18～24小时后，更换新鲜的完全培养基，培养一 段时间后能够得到所述ITNK细胞。 第二方面，如第一方面所述的方法制备得到的ITNK细胞。 利用第一方面所述的电转化方法得到的ITNK细胞的体外扩增能力和体外杀伤能 力都优于直接电转ITNK质粒获得的ITNK细胞。 本发明中，所述的ITNK细胞可以应用于治疗肿瘤的药物等多种研究当中。 本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值 范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括 的具体点值。 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果： (1)本发明提供的重编程方法将RNP复合物通过电转的方法转入T细胞中，使其分 化成为ITNK细胞，所述方法能够提高体外重编程效率，电转RNP复合物得到的ITNK细胞中， CD8阳性细胞群的NKp30为40.6～61.6％；该方法能够从整体上提升重编程ITNK细胞制备能 力，使更多的临床患者获益； (2)本发明提供的重编程方法得到ITNK细胞具有较好的体外扩增能力，在电转后 第14天，其细胞扩增倍数为26.8～62.2倍；且所述ITNK细胞具有较强的体外杀伤功能，在效 靶比降低至1:2甚至更低时，电转RNP组对靶细胞的杀伤能力明显强于电转质粒组。 附图说明 图1为实施例2中不同组细胞的重编程效率散点图。 图2为实施例3中不同组细胞的体外扩增能力曲线图。 图3为实施例4中不同组细胞的体外杀伤能力曲线图。