技术摘要：
本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种25‑羟基维生素D检测试剂盒、制备方法及检测方法。一种25‑羟基维生素D检测试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂及样本处理试剂，其中，所述R1试剂包括链霉亲和素磁微粒溶液；所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的25‑羟基  全部
背景技术：
维生素D是一种脂溶性固醇类衍生物，主要有维生素D2与D3两种形式。维生素D2由 紫外线照射植物中的麦角固醇产生；维生素D3则由人体表皮和真皮内含有的7-脱氢胆固醇 经日光中紫外线照射转变而成。在人体内，维生素D2和D3与血浆中维生素D结合蛋白结合并 转运到肝脏，经肝细胞微粒体中的单氧酶系统(25-羟化酶)的作用，形成25-羟基维生素D (包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)。25-羟基维生素D在肾近端小管上皮细胞线粒 体内经α羟化酶系统作用下转变为1,25-二羟基维生素D，它是维生素D最大的生物作用形 式，可促进肠道钙结合蛋白的合成。而25-羟基维生素D是人体内维生素D代谢中的主要储存 形式，能够反映机体的维生素D水平，因此通过检测25-羟基维生素D来评估人体维生素D水 平。 维生素D是维持骨骼健康的主要元素，通过调节人体内的骨钙代谢和血磷代谢促 进人体内骨骼生长，还参与人体细胞的分化和免疫功能的调节，直接关系到人体新陈代谢 的平衡进而影响身体健康状况。维生素D缺乏将导致肌肉乏力，儿童期维生素D的严重缺乏 将导致骨骼畸形，即佝偻病；若该病发生于成人，则会出现发育成熟的骨骼钙化不全，成为 骨软化症。研究表明，维生素D缺乏可能使某些心血管疾病、自身免疫性疾病和感染疾病的 发病率升高，而长期摄入过多的维生素D，将引起高血钙和高尿钙，严重者将因肾钙化、心脏 和大动脉钙化而死亡。越来越多的医疗专业人员和患者已经意识到维生素D的缺乏或过量 均会对健康产生风险，医疗机构检验量激增，因此需要我们提供更稳定、准确的检测试剂， 帮助医生得到准确的检测结果。当然，25-羟基维生素D测定试剂的检测结果仅供临床参考， 不能单独作为诊断或排除病例的依据。 然而，目前采用的化学发光免疫法检测25-羟基维生素D，仍有灵敏度低、特异性 差、重现性差、检测范围窄等问题。仍需开发一种检验灵敏度高、特异性强、检测范围宽、重 现性好的25-羟基维生素D检测试剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检验灵敏度高、特异性强、检测 范围宽、重现性好的25-羟基维生素D检测试剂盒、制备方法及检测方法。 为实现上述目的，本发明提供了一种25-羟基维生素D检测试剂盒，采取以下技术 方案： 一种25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂及样 本处理试剂，其中， 所述R1试剂包括链霉亲和素包被的磁微粒溶液，所述链霉亲和素包被的磁微粒的 5 CN 111721944 A 说　明　书 2/17 页 浓度为0.05～1mg/ml，所述磁微粒的粒径为1～4μm； 所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体溶液，所述碱性磷 酸酶标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的浓度为0.2～1.0ng/mL，抗25-羟基维生素D单 克隆抗体与碱性磷酸酶的标记比例为1：1～10：1； 所述R3试剂包括生物素标记的25-羟基维生素D抗原，生物素标记的25-羟基维生 素D抗原浓度为0.05～0.2％； 所述样本处理试剂包括弱酸性缓冲液、还原剂及低级醇溶剂，用于从结合蛋白中 解离25-羟基维生素D。 本发明人通过大量研究实验考察后发现，传统技术中的待测样本中25-羟基维生 素D与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体往往结合不充分，使检测结果不准确、 试剂盒的灵敏度低。其中一个原因在于，待测样本常采用强碱性溶液使其中的25-羟基维生 素D解离出来，然而强碱性溶液在一定程度上会使碱性磷酸酶的活性降低，使得解离出来的 25-羟基维生素D没有与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体充分结合，导致检测 灵敏度低，检测结果不准确；另一个原因在于，25-羟基维生素D属于小分子疏水物质，不易 与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体结合，导致检测灵敏度低，检测结果不准 确。 在上述研究发现的基础上，本发明对传统技术进行了改进，将样本处理试剂采用 弱酸性缓冲液，使25-羟基维生素D从待测样本中有效解离的同时，保持碱性磷酸酶标记的 25-羟基维生素D单克隆抗体的活性；采用还原剂避免25-羟基维生素D转化，提高25-羟基维 生素D抗原活性，促进25-羟基维生素D与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体结 合；采用低级醇溶剂可促进25-羟基维生素D溶解。该样本处理试剂各成分协同作用能够使 25-羟基维生素D从待测样本中有效解离，并保持25-羟基维生素D与碱性磷酸酶标记的25- 羟基维生素D单克隆抗体的活性，并使二者充分结合，达到该检测试剂盒检测准确，灵敏度 高的效果。 在其中的一个实施例中，所述弱酸性缓冲液的pH值为5.5～6.9；所述弱酸性缓冲 液选自柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种；所述弱酸性缓冲液优选为柠檬 酸缓冲液；所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.05～2.5％，优选为柠檬酸缓冲液的浓度为1.5％。 在其中的一个实施例中，所述还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐，还 原性谷胱甘肽、半胱氨酸或β-巯基乙醇中的一种；所述还原剂优选为β-巯基乙醇，所述β-巯 基乙醇的浓度为0.05％～5％，优选为所述β-巯基乙醇的浓度为0.1％～2.5％；更优选为β- 巯基乙醇的浓度为0.25％～1％，最优选为β-巯基乙醇的浓度为0.5％； 在其中的一个实施例中，所述低级醇溶剂的浓度为10％～20％，优选为低级醇溶 剂的浓度为10％～15％，更优选为低级醇溶剂的浓度为15％；所述低级醇溶剂选自甲醇或 乙醇中的一种。 在其中的一个实施例中，所述样本处理试剂还包括0.02～0.1％的防腐剂，所述防 腐剂为叠氮化钠或Procline300中的一种。 在其中的一个实施例中，所述R1试剂还包括0.02～0.1mol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸 缓冲液及0.02～0.1％的防腐剂，所述防腐剂为叠氮化钠或Procline300中的一种； 在其中的一个实施例中，所述R2试剂还包括0.02～0.1mol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸 6 CN 111721944 A 说　明　书 3/17 页 缓冲液及0.02～0.1％的防腐剂，所述防腐剂为叠氮化钠或Procline300中的一种； 在其中的一个实施例中，所述R3试剂还包括0.02～0.1mol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸 缓冲液及0.02～0.1％的防腐剂，所述防腐剂为叠氮化钠或Procline300中的一种。 在其中的一个实施例中，所述试剂盒还包括校准品及质控品，所述校准品和质控 品分别包括25-羟基维生素D抗原、血清、防腐剂和缓冲液，所述血清选自羊血清、牛血清、马 血清、驴血清或含人血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所 述防腐剂的质量百分比浓度为0.02～0.1％，所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、 Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为7.2～7.4；所述校 准品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为0.0ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、 100ng/mL和120ng/mL；所述质控品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为20ng/mL和 80ng/mL。 本发明还提供了一种如上所述的25-羟基维生素D检测试剂盒的制备方法，其特征 在于，包括R2试剂中碱性磷酸酶标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的制备方法包括： (1)ALP-mal的制备： 1)添加DMF到EMCS中，配制成60～100mM的EMCS溶液； 2)将EMCS溶液添加到ALP调制用缓冲液中； 3)搅拌ALP溶液的同时添加上述混合液，温度35～38℃，加热50～70分钟； 4)进行离心脱盐，回收离心脱盐后溶液； (2)ALP-mal标记还原： 1)缓冲液置换，用离心脱盐柱进行25-羟基维生素D单克隆抗体缓冲液的置换，回 收缓冲液置换后的溶液； 2)凝胶过滤用缓冲液溶解MEA，配制0.2～0.5M的MEA溶液； 3)25-羟基维生素D单克隆抗体溶液的巯基化； 4)脱盐,反应结束后进行离心脱盐，回收脱盐后溶液； 5)ALP-mal的导入,将ALP-mal加入到上述溶液中，密封，2-8℃静置反应约16-24小 时； 6)终止,添加0.1M的MEA溶液到步骤5)中的溶液中，充分搅拌，温度35～38℃，反应 5～15分钟； 7)保存,终止后的溶液2-8℃环境下保存。 在其中的一个实施例中，所述25-羟基维生素D检测试剂盒,其特征在于,所述R3试 剂中生物素标记的抗25-羟基维生素D抗原的制备方法，包括如下步骤： (1)将所述25羟基维生素D抗原用脱盐柱中进行脱盐，得纯化液； (2)按照DMF：生物素＝1：3～5的比例配制1～30mM生物素溶液； (3)将纯化液加入到生物素溶液中，常温反应20～40min； (4)反应后脱盐，回收离心液即可得到生物素标记的抗25羟基维生素D抗原。 在其中的一个实施例中，所述的25-羟基维生素D检测试剂盒的制备方法，其特征 在于，所述R1试剂中链霉素亲和素包被的磁微粒的制备方法包括如下步骤：取链霉亲和素 磁微粒溶液，用0.02～0.1mol/LTRIS缓冲溶液稀释得到的浓度为0.05～1mg/ml链霉亲和素 磁微粒。 7 CN 111721944 A 说　明　书 4/17 页 在其中的一个实施例中，所述的25-羟基维生素D检测试剂盒的制备方法，其特征 在于，所述校准品液系列和质控品液系列的制备方法为： (1)用缓冲液、血清和防腐剂配制成校准品稀释液； (2)用DMF溶解25-羟基维生素D抗原； (3)用步骤(1)中的校准品稀释液稀释溶解后的25羟基维生素D抗原，得25羟基维 生素D抗原浓度分别为0ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL和120ng/mL的校准品 液系列；或者，用步骤(1)中的校准品稀释液稀释溶解后的25羟基维生素D抗原，得25羟基维 生素D抗原浓度分别为20ng/mL和80ng/mL的质控品液系列。 本发明还提供了一种用于检测25-羟基维生素D的化学发光免疫方法，其特征在 于，采用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤： 步骤A：将待测样本、样本处理试剂和R2试剂混合，36～38℃温育20～40分钟，使待 测样本中的25-羟基维生素D充分解离，并与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体 充分结合，洗涤； 步骤B：加入R1试剂和R3试剂，36～38℃温育5～15分钟，洗涤； 步骤C：加入化学发光底物，使其在酶的催化下，产生发光信号，由光量子阅读系统 接收，光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，软件根据光信号与Cutoff值自动计算 待测样本中的25-羟基维生素D含量； 所述化学发光底物为(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二 氧环乙烷，AMPPD。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： (1)本发明的一种25-羟基维生素D的检测试剂盒，样本处理试剂包括弱酸性缓冲 剂、还原剂及低级醇溶剂，三者协同发挥作用，能够有效将25-羟基维生素D从待测样本中解 离出来，并增强25-羟基维生素D的抗原活性及溶解性，保持碱性磷酸酶标记的抗25-羟基维 生素D单克隆抗体的活性，使25-羟基维生素D与碱性磷酸酶标记的抗25-羟基维生素D单克 隆抗体充分结合，从而提高了检测灵敏度及检测的准确度。 (2)本发明的25-羟基维生素D的化学发光免疫方法，采用上述试剂盒，先加入待测 样本与样本处理试剂和R2试剂，温育，使待测样本中的25-羟基维生素D充分解离，并与碱性 磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体充分结合形成复合物，洗涤，再加入R1试剂链霉 亲和素标记的磁性微粒及R3试剂生物素标记的25-羟基维生素D抗原，该方法使25-羟基维 生素D与碱性磷酸酶标记的25-羟基维生素D单克隆抗体充分结合，再清洗，避免了待测25- 羟基维生素D的损失，再加入链霉亲和素磁微粒与生物素标记的25-羟基维生素D抗原，从而 提高了检测灵敏度。 (3)本发明的25-羟基维生素D化学发光检测试剂盒通过免疫发光竞争法实现化学 发光检测，该试剂盒具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围。 (4)本发明提供的25-羟基维生素D化学发光检测试剂盒只需要40μL血清或者血浆 就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。 (5)本发明提供的25-羟基维生素D的测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联 用，实现了自动化监测，避免了人为操作导致的误差，提高了检测速度和检测效率。 (6)本发明提供的25-羟基维生素D化学发光检测试剂盒使用高质量抗体抗干扰能 8 CN 111721944 A 说　明　书 5/17 页 力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。 附图说明 为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一 些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。 图1为本申请实施例中25-羟基维生素D检测试剂盒与进口试剂盒测定值得相关 性.。