技术摘要：
本发明公开了一种可气溶胶化的SEB类毒素疫苗干粉吸入剂。本发明保护一种干粉制剂：灭活的SEB蛋白0.049‑0.0.051g：CpG 0.049‑0.0.051g：甘露醇0.98‑1.02g：肌醇0.98‑1.02g：亮氨酸0.49‑0.51g：泊洛沙姆0.049‑0.051ml。本发明还保护一种干粉制剂的制备方法：将SEB 全部
背景技术：
金黄色葡萄球菌属于杆菌纲杆菌目葡萄球菌科，是一种常见的致病菌，在自然界 广泛存在于空气、水、人和动物排泄物、地面及物体表面，是一种重要的人畜共患病。典型的 金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8μm左右，光镜下排列成葡萄串状；无芽孢、鞭毛，大多数无 荚膜；可在普通培养基形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，菌落颜色依菌株而异，初呈灰白 色，继而为金黄色、白色或柠檬色。革兰氏染色阳性，衰老或死亡后可转为阴性。对不良的环 境抵抗能力较强,在干燥空气中可以存活数月，但不繁殖；耐热，70℃下1h，80℃下30min不 会被杀死；耐低温，在冷冻食品中不易死亡；耐高渗，可以在15％Nacl和40％胆汁中生长。 金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒 素，低分子量可溶，有强大的激活淋巴细胞的能力，可使淋巴细胞产生强烈的细胞毒性作用 和高水平的细胞因子(如肿瘤坏死因子TNF-α等)，对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用。目前发 现的肠毒素分型有A、B、C1、C2、C3、D和E等。其中金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)能在很低浓度条件下激活大量T细胞，并刺激释放细胞因子，能引起人 和动物呕吐、腹泻、腹痛等中毒症状，甚至造成机体不可逆的病变导致死亡。1.7μg的SEB就 可杀死一个成年人，是被列入联合国《禁止生物武器公约》核查清单的11种生物毒素之一。 SEB感染一个重要的临床症状是毒性休克综合征(TSS)，这与SEB的超抗原特性有 关，是SEB刺激免疫细胞分泌过量的细胞因子的结果。目前对SEB中毒的治疗仅限于支持疗 法，尚缺乏更有效的手段。而SEB疫苗的思路是对SEB蛋白进行基因突变或修饰，使之失去或 降低超抗原的毒性作用，但能刺激机体产生具有保护作用的特异抗体，用于防治SEB的毒性 效应。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可气溶胶化的SEB类毒素疫苗干粉吸入剂。 本发明保护一种干粉制剂(干粉制剂甲)，原料组成为：灭活的SEB蛋白、CpG、甘露 醇、肌醇、亮氨酸和泊洛沙姆。 本发明还保护一种干粉制剂(干粉制剂乙)，原料组成以及配比如下： 灭活的SEB蛋白0.049-0.0.051g：CpG 0.049-0.0.051g：甘露醇0.98-1.02g：肌醇 0.98-1.02g：亮氨酸0.49-0.51g：泊洛沙姆0.049-0.051ml。 本发明还保护一种干粉制剂(干粉制剂丙)，原料组成以及配比如下： 灭活的SEB蛋白0 .05g：CpG 0 .05g：甘露醇1g：肌醇1g：亮氨酸0.5g：泊洛沙姆 0.05ml。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法甲)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； 3 CN 111588841 A 说 明 书 2/7 页 SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白、CpG、甘露醇、肌醇、亮氨酸和泊洛沙姆。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法乙)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白0 .049-0 .0 .051g/100mL、CpG0 .049- 0.0.051g/100mL、甘露醇0.98-1.02g/100mL、肌醇0.98-1.02g/100mL、亮氨酸0.49-0.51g/ 100mL、泊洛沙姆0.049-0.051％(体积百分含量)。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法丙)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白0.05g/100mL、CpG 0.05g/100mL、甘露醇 1g/100mL、肌醇1g/100mL、亮氨酸0.5g/100mL、泊洛沙姆0.05％(体积百分含量)。 以上任一所述SEB类毒素溶液中，余量为水。 以上任一所述SEB类毒素溶液的pH值为7.2。 以上任一所述SEB类毒素溶液用1M氢氧化钠溶液调pH值至7.2。 以上任一所述灭活的SEB蛋白可为将SEB蛋白进行甲醛进行灭活得到的。甲醛和 SEB蛋白的摩尔比可为(4300-21500)：1。甲醛和SEB蛋白的摩尔比为4300:1。 以上任一所述喷雾冷冻干燥的方法具体可为：冰浴预冷2小时后的SEB类毒素溶液 通过二流体喷头的进口直接喷雾至冷介质(例如液氮)中，将冰晶进行真空冷冻干燥。 以上任一所述喷雾冷冻干燥的方法具体可为：将SEB类毒素溶液冰浴预冷2小时， 然后取20ml转入注射器中，注射器出口连接二流体喷头的进口，直接喷雾至液氮中(不锈钢 盆中装有3/4体积的液氮，置于磁力搅拌器上进行搅拌；如有需要，喷雾中途添加液氮；喷头 离液氮液面≈10cm，设置气泵气压0.15兆帕)，喷出来的雾化液滴，在液氮作用下迅速冷冻 成冰晶；将冰晶连同少量剩余液氮转移至不锈刚杯中，开口处封上一层纱布，置于真空冷冻 干燥机中干燥36h以上。 本发明还保护以上任一所述方法制备得到的干粉制剂。 本发明还保护以上任一所述干粉制剂在制备金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗中的应 用。 本发明还保护一种金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗，其活性成分为以上任一所述干 粉制剂。 以上任一所述疫苗可为治疗疫苗或预防疫苗。 以上任一所述金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗为用于治疗和/或预防金黄色葡萄球 菌肠毒素B中毒的疫苗。 以上任一所述干粉制剂为可气溶胶化的干粉吸入剂。 SEB蛋白即金黄色葡萄球菌肠毒素B。 以上任一所述SEB蛋白即序列表的序列1所示的蛋白质。 以上任一所述亮氨酸为L-亮氨酸。 本发明中制备得到的干粉制剂，总粒子空气动力学质量中值直径为5.41μm，粒子 呈圆球状，形态疏松多孔，粒径分布较均匀。干粉制剂有利于疫苗沉积到肺深部，可以增加 抗原与粘膜组织接触反应的时间，有助于提高免疫保护效果。 将本发明提供的干粉制剂通过手持式干粉气溶胶肺递送装置递送至小鼠肺部进 4 CN 111588841 A 说 明 书 3/7 页 行三次免疫，血清和肺匀浆液中抗体(IgG、IgG1、Ig2a、IgM和IgA)的滴度随时间推移逐渐升 高，表明三次免疫起到了免疫增强效果，可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫及粘膜免 疫。三次免疫后进行SEB攻毒，SEB液体组和SEB干粉组小鼠生存率可达100％，感染后无明显 临床症状。相反，未经过SEB类毒素疫苗干粉免疫的小鼠则生存率为0％，表明SEB类毒素疫 苗干粉对小鼠起到很好的免疫保护效果。 本发明为金黄色葡萄球菌肠毒素B干粉疫苗的研发可行性提供了支持。本发明对 于金黄色葡萄球菌肠毒素B的防控具有重大的应用价值。 附图说明 图1为SEB干粉吸入剂的粒子形态。 图2为生存率的结果。 图3为血清中IgG滴度的结果。 图4为血清中IgG1滴度的结果。 图5为血清中Ig2a滴度的结果。 图6为血清中IgM滴度的结果。 图7为血清中IgA滴度的结果。 图8为肺匀浆上清中IgG滴度的结果。 图9为肺匀浆上清中IgG1滴度的结果。 图10为肺匀浆上清中Ig2a滴度的结果。 图11为肺匀浆上清中IgM滴度的结果。 图12为肺匀浆上清中IgA滴度的结果。 图13为血清中IFN-γ的浓度的结果。 图14为血清中TNF-α的浓度的结果。 图15为肺匀浆上清中IFN-γ的浓度的结果。 图16为肺匀浆上清中TNF-α的浓度的结果。
本发明公开了一种可气溶胶化的SEB类毒素疫苗干粉吸入剂。本发明保护一种干粉制剂：灭活的SEB蛋白0.049‑0.0.051g：CpG 0.049‑0.0.051g：甘露醇0.98‑1.02g：肌醇0.98‑1.02g：亮氨酸0.49‑0.51g：泊洛沙姆0.049‑0.051ml。本发明还保护一种干粉制剂的制备方法：将SEB 全部
背景技术：
金黄色葡萄球菌属于杆菌纲杆菌目葡萄球菌科，是一种常见的致病菌，在自然界 广泛存在于空气、水、人和动物排泄物、地面及物体表面，是一种重要的人畜共患病。典型的 金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8μm左右，光镜下排列成葡萄串状；无芽孢、鞭毛，大多数无 荚膜；可在普通培养基形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，菌落颜色依菌株而异，初呈灰白 色，继而为金黄色、白色或柠檬色。革兰氏染色阳性，衰老或死亡后可转为阴性。对不良的环 境抵抗能力较强,在干燥空气中可以存活数月，但不繁殖；耐热，70℃下1h，80℃下30min不 会被杀死；耐低温，在冷冻食品中不易死亡；耐高渗，可以在15％Nacl和40％胆汁中生长。 金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒 素，低分子量可溶，有强大的激活淋巴细胞的能力，可使淋巴细胞产生强烈的细胞毒性作用 和高水平的细胞因子(如肿瘤坏死因子TNF-α等)，对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用。目前发 现的肠毒素分型有A、B、C1、C2、C3、D和E等。其中金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)能在很低浓度条件下激活大量T细胞，并刺激释放细胞因子，能引起人 和动物呕吐、腹泻、腹痛等中毒症状，甚至造成机体不可逆的病变导致死亡。1.7μg的SEB就 可杀死一个成年人，是被列入联合国《禁止生物武器公约》核查清单的11种生物毒素之一。 SEB感染一个重要的临床症状是毒性休克综合征(TSS)，这与SEB的超抗原特性有 关，是SEB刺激免疫细胞分泌过量的细胞因子的结果。目前对SEB中毒的治疗仅限于支持疗 法，尚缺乏更有效的手段。而SEB疫苗的思路是对SEB蛋白进行基因突变或修饰，使之失去或 降低超抗原的毒性作用，但能刺激机体产生具有保护作用的特异抗体，用于防治SEB的毒性 效应。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可气溶胶化的SEB类毒素疫苗干粉吸入剂。 本发明保护一种干粉制剂(干粉制剂甲)，原料组成为：灭活的SEB蛋白、CpG、甘露 醇、肌醇、亮氨酸和泊洛沙姆。 本发明还保护一种干粉制剂(干粉制剂乙)，原料组成以及配比如下： 灭活的SEB蛋白0.049-0.0.051g：CpG 0.049-0.0.051g：甘露醇0.98-1.02g：肌醇 0.98-1.02g：亮氨酸0.49-0.51g：泊洛沙姆0.049-0.051ml。 本发明还保护一种干粉制剂(干粉制剂丙)，原料组成以及配比如下： 灭活的SEB蛋白0 .05g：CpG 0 .05g：甘露醇1g：肌醇1g：亮氨酸0.5g：泊洛沙姆 0.05ml。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法甲)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； 3 CN 111588841 A 说 明 书 2/7 页 SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白、CpG、甘露醇、肌醇、亮氨酸和泊洛沙姆。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法乙)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白0 .049-0 .0 .051g/100mL、CpG0 .049- 0.0.051g/100mL、甘露醇0.98-1.02g/100mL、肌醇0.98-1.02g/100mL、亮氨酸0.49-0.51g/ 100mL、泊洛沙姆0.049-0.051％(体积百分含量)。 本发明还保护一种干粉制剂的制备方法(方法丙)，包括如下步骤： 将SEB类毒素溶液进行喷雾冷冻干燥，得到干粉制剂； SEB类毒素溶液中，含有灭活的SEB蛋白0.05g/100mL、CpG 0.05g/100mL、甘露醇 1g/100mL、肌醇1g/100mL、亮氨酸0.5g/100mL、泊洛沙姆0.05％(体积百分含量)。 以上任一所述SEB类毒素溶液中，余量为水。 以上任一所述SEB类毒素溶液的pH值为7.2。 以上任一所述SEB类毒素溶液用1M氢氧化钠溶液调pH值至7.2。 以上任一所述灭活的SEB蛋白可为将SEB蛋白进行甲醛进行灭活得到的。甲醛和 SEB蛋白的摩尔比可为(4300-21500)：1。甲醛和SEB蛋白的摩尔比为4300:1。 以上任一所述喷雾冷冻干燥的方法具体可为：冰浴预冷2小时后的SEB类毒素溶液 通过二流体喷头的进口直接喷雾至冷介质(例如液氮)中，将冰晶进行真空冷冻干燥。 以上任一所述喷雾冷冻干燥的方法具体可为：将SEB类毒素溶液冰浴预冷2小时， 然后取20ml转入注射器中，注射器出口连接二流体喷头的进口，直接喷雾至液氮中(不锈钢 盆中装有3/4体积的液氮，置于磁力搅拌器上进行搅拌；如有需要，喷雾中途添加液氮；喷头 离液氮液面≈10cm，设置气泵气压0.15兆帕)，喷出来的雾化液滴，在液氮作用下迅速冷冻 成冰晶；将冰晶连同少量剩余液氮转移至不锈刚杯中，开口处封上一层纱布，置于真空冷冻 干燥机中干燥36h以上。 本发明还保护以上任一所述方法制备得到的干粉制剂。 本发明还保护以上任一所述干粉制剂在制备金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗中的应 用。 本发明还保护一种金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗，其活性成分为以上任一所述干 粉制剂。 以上任一所述疫苗可为治疗疫苗或预防疫苗。 以上任一所述金黄色葡萄球菌肠毒素B疫苗为用于治疗和/或预防金黄色葡萄球 菌肠毒素B中毒的疫苗。 以上任一所述干粉制剂为可气溶胶化的干粉吸入剂。 SEB蛋白即金黄色葡萄球菌肠毒素B。 以上任一所述SEB蛋白即序列表的序列1所示的蛋白质。 以上任一所述亮氨酸为L-亮氨酸。 本发明中制备得到的干粉制剂，总粒子空气动力学质量中值直径为5.41μm，粒子 呈圆球状，形态疏松多孔，粒径分布较均匀。干粉制剂有利于疫苗沉积到肺深部，可以增加 抗原与粘膜组织接触反应的时间，有助于提高免疫保护效果。 将本发明提供的干粉制剂通过手持式干粉气溶胶肺递送装置递送至小鼠肺部进 4 CN 111588841 A 说 明 书 3/7 页 行三次免疫，血清和肺匀浆液中抗体(IgG、IgG1、Ig2a、IgM和IgA)的滴度随时间推移逐渐升 高，表明三次免疫起到了免疫增强效果，可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫及粘膜免 疫。三次免疫后进行SEB攻毒，SEB液体组和SEB干粉组小鼠生存率可达100％，感染后无明显 临床症状。相反，未经过SEB类毒素疫苗干粉免疫的小鼠则生存率为0％，表明SEB类毒素疫 苗干粉对小鼠起到很好的免疫保护效果。 本发明为金黄色葡萄球菌肠毒素B干粉疫苗的研发可行性提供了支持。本发明对 于金黄色葡萄球菌肠毒素B的防控具有重大的应用价值。 附图说明 图1为SEB干粉吸入剂的粒子形态。 图2为生存率的结果。 图3为血清中IgG滴度的结果。 图4为血清中IgG1滴度的结果。 图5为血清中Ig2a滴度的结果。 图6为血清中IgM滴度的结果。 图7为血清中IgA滴度的结果。 图8为肺匀浆上清中IgG滴度的结果。 图9为肺匀浆上清中IgG1滴度的结果。 图10为肺匀浆上清中Ig2a滴度的结果。 图11为肺匀浆上清中IgM滴度的结果。 图12为肺匀浆上清中IgA滴度的结果。 图13为血清中IFN-γ的浓度的结果。 图14为血清中TNF-α的浓度的结果。 图15为肺匀浆上清中IFN-γ的浓度的结果。 图16为肺匀浆上清中TNF-α的浓度的结果。
