技术摘要：
本发明公开了一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用，属生物医用高分子材料技术领域。阳离子化柞蚕丝素蛋白由经1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐活化的柞蚕丝素蛋白与聚乙烯亚胺偶联得到，表面带正电荷的柞蚕丝素蛋白依靠静电吸附作  全部
背景技术：
肿瘤的基因治疗是指利用基因操作方法引入外源基因，纠正肿瘤细胞基因的结构 或功能缺陷，或通过增强宿主对肿瘤的杀伤能力和机体的防御机能治疗肿瘤。基因治疗具 有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势，其关键在于构建安全、高效的基因传递载体。目的 基因递送至肿瘤细胞的方式主要包括两种，依托病毒载体的介导和借助非病毒载体的转 染。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物。脂质体价格昂贵，易与血浆蛋白发 生吸附作用导致质粒DNA解体，转染效率不稳定。阳离子聚合物可与DNA结合，形成尺寸较小 的微粒复合物，但因缺乏疏水结构域，不能与内质膜直接作用来融合或破坏内质体的稳定 性。非病毒载体转染目的基因的效率和基因表达水平远低于病毒载体，难以有效地发挥目 的基因的抑癌作用，同时还存在细胞毒性、降解性差等问题。 病毒载体利用亲代病毒高度进化的机制，有效识别和感染细胞，进而获得稳定、高 效的基因表达，适合基因治疗的应用和作为生物学研究的工具。腺病毒作为常用的基因传 递载体，不仅能有效地将目的基因递送至肿瘤细胞中并高水平表达，也易于培养和纯化，还 能够插入大片段的外源基因，携带的基因不会整合到受染细胞基因组，表达的基因序列稳 定，没有致癌和致突变的危险。但腺病毒也存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对柯 萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性等不足。采用阳离子聚合物静电涂层腺病毒，能屏蔽腺 病毒与宿主的相互作用，阻断腺病毒的固有受体介导的内吞作用。聚乙烯亚胺和聚赖氨酸 是最早用于静电涂层腺病毒的阳离子聚合物，能增强肿瘤细胞对腺病毒的感染性，保护腺 病毒免受血清抗体的中和，但存在核内体逃逸效率低、降解性差和细胞毒性问题，还存在进 入血液后快速解离的障碍。因此，构建生物相容性好、可生物降解、感染效率高、免疫原性低 的新型腺病毒基因载体在肿瘤基因治疗领域将具有广阔的应用前景。 在本发明之前，文献“Systemic  image-guided  liver  cancer  radiovirotherapy  using  dendrimer-coated  adenovirus  encoding  the  sodium  iodide  symporter  as  theranostic  gene”（J  Nucl  Med,  2013,  54:  1450-1457）中采用聚酰胺-胺型树状高分子 涂层腺病毒载体，能够明显增强细胞对载体的摄取并阻断腺病毒对柯萨奇-腺病毒受体阳 性细胞的趋向性。但是聚酰胺-胺型树状高分子的降解性差，影响载体中目的基因在靶细胞 中的表达。
技术实现要素：
本发明针对裸腺病毒载体的缺陷和现有腺病毒复合物载体的不足，提供一种能高 效率递送外源性目的基因、低细胞毒性的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法 3 CN 111575317 A 说　明　书 2/6 页 及其应用。 本发明采用以下技术方案实现发明目的：提供一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病 毒复合物，阳离子化柞蚕丝素蛋白以静电吸附作用涂层至腺病毒表面；所述复合物的粒径 为315～448  nm，复合物的表面Zeta电位为-7.2～-0.1  mV。 本发明技术方案还包括一种如上所述的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的 制备方法，将柞蚕丝脱胶、溶解、透析后得到再生柞蚕丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加 工： （1）将分子量为1.8  kD的聚乙烯亚胺（PEI）溶解于三蒸水中，配制成浓度为0.5～8  mg/ mL的聚乙烯亚胺溶液；将生柞蚕丝素蛋白溶液用三蒸水配制成浓度为10  mg/mL，在冰浴中 平衡20～30分钟； （2）按柞蚕丝素蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液体积比为10:1，向柞蚕丝素蛋白溶液中逐 滴加入聚乙烯亚胺溶液，缓慢搅拌，用0.1  mol/L的4-吗啉乙磺酸调节溶液的pH值至7.8～ 8.0，再加入占柞蚕丝素蛋白质量20%的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，继 续缓慢搅拌，冰浴中反应12～15小时；反应产物经截留分子量3.5  kD的透析袋在温度为0～ 4  °C的三蒸水中透析后，再经离心超滤处理，得到阳离子化柞蚕丝素蛋白溶液，阳离子化柞 蚕丝素蛋白的表面Zeta电位为 2.4～ 12.1  mV； （3）将步骤（2）制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白溶液用三蒸水配制成浓度10～150 μg/ mL；腺病毒用磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释至效价(1～2)×107  pfu/mL；按体积比1:3～3:1， 将腺病毒与阳离子化柞蚕丝素蛋白混合均匀，涡旋处理1分钟，室温静置30～45分钟，得到 阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物。 步骤（2）所述的离心超滤处理，用截留分子量3  kD的超滤管在温度为0～4  °C、转 速7500  rpm的条件下离心超滤30分钟。 本发明技术方案中所述的腺病毒携带生长抑制因子4（ING4）基因、白细胞介素-24 （IL-24）基因、血管内皮生长因子165（VEGF165）基因、血管生成素1（Ang-1）基因中的一种或 两种基因。 本发明提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的应用，复合物能特异性感 染靶细胞，所述靶细胞为对细胞膜表面过表达整合素αvβ3和/或αvβ5细胞。 所述的靶细胞包括肺癌细胞、肝癌细胞、血管内皮细胞。 本发明的原理是：柞蚕丝素蛋白中大量的极性氨基酸残基使其比家蚕丝素蛋白具 有更丰富的化学反应活性和修饰位点。柞蚕丝素蛋白在中性环境下带负电荷，采用化学改 性手段使柞蚕丝素蛋白表面带上正电荷，能赋予其直接涂层裸腺病毒的能力，并且能减弱 腺病毒载体与细胞膜之间的静电相斥作用，增强细胞对载体的摄取。柞蚕丝素蛋白具有优 异的生物相容性、较低的免疫原性以及可控的生物降解性，采用柞蚕丝素蛋白涂层腺病毒， 可降低腺病毒载体的细胞毒性和免疫原性风险。 与现有技术相比，本发明的明显优点如下： 1.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率显著提高。本发明利 用正负电荷相互吸引的原理使阳离子化柞蚕丝素蛋白涂层至腺病毒表面，屏蔽裸腺病毒表 面的大量负电荷，减弱腺病毒载体与细胞膜之间的静电排斥作用，显著提高基因转染效率。 2.天然柞蚕丝素蛋白中富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列，RGD序列能 4 CN 111575317 A 说　明　书 3/6 页 够与细胞表面的整合素αvβ3和αvβ5特异性结合，帮助载体靶向转入细胞中，显著提高基因转 染效率。 3.柞蚕丝素蛋白经PEI改性后携带大量的自由氨基，涂层腺病毒形成的丝素/腺病 毒复合物进入细胞后会产生“质子海绵”效应，复合物中的氨基鳌合大量质子，引起氯离子 内流，导致溶酶体渗透性肿胀而破裂，腺病毒完全暴露出来无遮挡，诱导其携带的目的基因 在细胞内有效释放，显著提高目的基因的表达水平。 4.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率显著提高，能降 低腺病毒的有效使用滴度，避免高滴度腺病毒的细胞毒性。 5.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物，因柞蚕丝素蛋白可生物 降解且具有优异的生物相容性和较低的免疫原性，既能有效降低腺病毒载体的细胞毒性， 也能降低腺病毒的免疫原性风险，同时能阻断腺病毒对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋 向性。 6.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率高、细胞毒性低， 在针对其靶细胞的体内外感染中具有良好的应用前景。 附图说明 图1为本发明提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物制备原理示意图； 图2为裸腺病毒的扫描电镜照片； 图3为本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的扫描电镜照片； 图4和图5分别为经裸腺病毒感染的肺癌细胞H460的激光共聚焦显微镜照片和流式细 胞检测图； 图6和图7分别为经本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染的 肺癌细胞H460的激光共聚焦显微镜照片和流式细胞检测图； 图8为本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白、裸腺病毒、阳离子化柞蚕丝素蛋 白/腺病毒复合物对脐静脉内皮细胞HUVEC的细胞毒性对比柱状图。