技术摘要：
本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227；采用同源重组缺失技术从S型羊种布鲁氏菌Rev.1获 全部
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌细菌引起的以感染家 畜为主 的人畜共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物疫病， 我国将其列为二类 动物疫病。 我国与人类布病有关的传染源主要是患病羊、牛。感染动物可从乳汁、粪 便和尿 液中排出病原菌，长期或终身带菌，当患病母畜流产时，大量病菌随着 流产胎儿、胎衣和子 宫分泌物一起排出，成为最危险的传染源。 布病疫苗是实施控制动物布病的重要手段。 我国现有的动物布病疫苗有：猪、牛、羊均可使用的布鲁氏菌活菌苗(S2 株)，主要 用于羊的布鲁氏菌活菌苗(M5株)，以及从国外引进用于牛的布鲁 氏菌活疫苗(A19株)。其 中，S2株应用最为广泛，据2011-2013年中国兽医 药品监察所生物制品产品批签发的统计 数据，我国每年使用S2株疫苗达1.5 亿头份以上，占动物布病疫苗的98％以上。 国际上，目前在使用的动物布病疫苗有：用于羊的布鲁氏菌活菌苗(Rev.1 株)，用 于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)及极少数地方在使用的布鲁氏菌活 疫苗(RB51株)。 根据菌株表型的不同，布鲁氏菌病疫苗可分为光滑(Smooth，S)型疫苗 和粗糙 (Rough，R)型疫苗。普遍使用的为S型疫苗，但历史上曾经短暂使用 过R型灭活疫苗45/20， 上世纪90年代，美国批准了另一种R型布鲁氏菌病活 疫苗RB51，但至今只有极少数地方使 用。 S型活疫苗有较好的免疫效果，但免疫抗体会干扰对野毒感染的抗体诊断， 并且 存在一定的安全性问题；R型活疫苗能区分感染与免疫的涉及LPS抗体的 诊断且安全性有 所提高，但是其免疫保护弱于S型活疫苗。 本发明通过用诱变剂诱变S型羊种布鲁氏菌Rev .1获得粗糙(R)型布鲁 氏菌 RM227，通过同源重组由S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得光滑(S)型布鲁 氏菌Rev.1-ΔwadC，两 种菌株经优选配比，制备成布鲁氏菌病RS双价疫苗，本 发明的RS双价疫苗既具有S型布鲁 氏菌病活疫苗的良好免疫保护力，又兼具 R型布鲁氏菌病活疫苗能区分自然感染抗体与免 疫所涉及的脂多糖(LPS)抗 体的诊断，还具有与R型布鲁氏菌病活疫苗近似的安全性，为预 防布鲁氏菌病 提供一种新型疫苗。
技术实现要素：
本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌 Rev.1随 机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。 所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌 株，获 3 CN 111733097 A 说 明 书 2/12 页 得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227于2020年5月12日保藏 于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19808。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养 基中配制成 R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌 株，37℃恒温摇床培养3 天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结 晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴 定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁 氏菌RM227。 所述R型布鲁氏菌诱变培养基的制备方法为：取0.1克诱导剂吖啶黄溶于 100mL灭 菌蒸馏水中，此为原液；取15g TSB溶于500mL蒸馏水中，121℃15min 高压灭菌，待其冷却至 室温，加入上述配制原液0.5μL，置于37℃恒温摇床， 1天后取出备用，即为诱变培养基。 所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组基因获得菌株， 获得的 菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，于020年5月12日保 藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19807。 所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为： (1)扩增羊种布鲁氏菌Rev .1的wadC基因上、下游同源臂，获得目的基 因片段 wadC-U和wadC-D； (2)融合羊种布鲁氏菌的wadC基因上、下游同源臂，获得融合后目的 片段wadC- UD； (3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC 19-SacB，构建重组质粒pUC 19-SacB- wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1 感受态细胞中，再 接种到氨苄平板培养基上，长出菌落后，将菌落原位复制接 种到氨苄平板培养基和蔗糖平 板培养基上，挑取氨苄板上长出而同时蔗糖板没 有长出的菌落为单交换菌；挑取单交换菌 菌落同时划线接种到氨苄板，蔗糖 板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即 为双交换菌；对双交换 菌进行PCR鉴定，对确定获得的wadC缺失菌株，命名为光滑(S)型布 鲁氏 菌Rev.1-ΔwadC。 本发明还公开上述布鲁氏菌保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。 本发明还公开一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，所述RS双价疫苗的生产菌株 包含权 利要求2或3所述的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和权利要求4或5所 述的光滑(S)型布鲁氏菌 Rev.1-ΔwadC。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 的配比 浓度为106-7:1；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑 (S)型布鲁氏菌Rev.1- ΔwadC的配比浓度为107:1。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为1011CFU/mL；所述光滑(S)型 布鲁氏菌 Rev.1-ΔwadC浓度为104CFU/mL-106CFU/mL；优选地，所述粗糙(R) 型布鲁氏菌RM227浓度为 1011CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 浓度为104CFU/mL。 所述RS双价疫苗中还包括疫苗保护剂；优选地，所述疫苗保护剂为明胶 蔗糖疫苗 保护剂。 所述布鲁氏菌病RS双价疫苗采用冻干工艺制备，所述冻干工艺为已批注 的布鲁 氏菌病活疫苗常规冻干工艺。 本发明具有有益效果如下： 4 CN 111733097 A 说 明 书 3/12 页 1、本实验通过诱导剂成功诱导了一株具有良好遗传稳定性的减毒株粗糙 (R)型 布鲁氏菌RM227,诱导株RM227缺失基因中包含wboA和wboB基因， 影响细菌的生长繁殖，较 亲本株对小鼠巨噬细胞的增殖能力有着明显的下降。 2、本发明通过同源重组基因技术获得一株具有良好遗传稳定性的减毒株 光滑 (S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，缺失wadC基因，对细菌的生长繁殖无影 响，其在胞内存活率 低于亲本株。 3、将粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 混合成双价 疫苗，用其免疫小鼠，在一定浓度配比范围内，两者间既存在协同 作用提高免疫保护，又可 区分自然感染抗体与免疫所涉及脂多糖(LPS)抗体 的诊断，而且安全性良好。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是 本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。 图1.诱变剂诱导菌株结晶紫染色鉴定。 图2.PCR检测布鲁氏菌LPS合成相关基因，M：DNA marker 5000；1： manAoAg；2-3： manBoAg；4：Gmd；5：Pmm；6：Pgm；7：wbkA；8：wbkB；9： wbkC；10：wbkD；11：wbkE；12：wbkF；13： wboA；14：wboB；15：Wa**；16： Per；17：Wzm；18：Wzt；19：man Bcore；20：man Ccore。 图3.诱导株RM227布鲁氏菌R型特性检测，A热凝集试验:1.犬种布鲁 氏菌RM6/66； 2,羊种布鲁氏菌M111；3,诱导株RM227；4,亲本株Rev.1；B菌 落结晶紫染色(左：Rev.1，右： RM227)；C吖啶黄凝集试验(1：Rev.1，2： RM227)。 图4.诱导株RM227和亲本株Rev.1生长曲线。 图5.巨噬细胞内存活测定(**,p≤0.01)。 图6.PCR扩增wadC基因上、下游同源臂，M：DNA Marker 2000；1：wadC-U 引物的PCR 产物；2：wadC-D引物的PCR产物。 图7.wadC-UD融合PCR扩增，M：DNA Marker 2000；1：融合PCR扩增产 物。 图8.转化菌落PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1-4：阴性质粒；5： 阳性质粒。 图9.单交换子筛选结果。 图10.第一次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对 照；2：Rev.1； 3-5：检测菌。 图11.双交换子筛选结果。 图12.第二次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对 照；2：Rev.1； 3-10：检测菌。 图13.内部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker 1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因 缺失株。 图14.外部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker 1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因 缺失株。 图15.亲本株Rev.1及其缺失株Rev.1-ΔwadC的生长曲线。 5 CN 111733097 A 说 明 书 4/12 页 图16.Rev.1和Rev.1-ΔwadC在BMDC、RAW264.7细胞中的存活能力。 图17.RS双价苗各组抗体变化水平：虚线表示阳性判定标准；①-⑤：RS 双价苗①- ⑤组。 图18.各组小鼠脾脏重：注：RS双价苗1-5组表示RS双价苗各组(免疫 剂量由低到 高)；S单价苗1-5组代表S单价苗各组(免疫剂量由低到高)；S 代表光滑型缺失株Rev.1-Δ wadC；R代表粗糙型诱导株M227。
本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227；采用同源重组缺失技术从S型羊种布鲁氏菌Rev.1获 全部
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌细菌引起的以感染家 畜为主 的人畜共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物疫病， 我国将其列为二类 动物疫病。 我国与人类布病有关的传染源主要是患病羊、牛。感染动物可从乳汁、粪 便和尿 液中排出病原菌，长期或终身带菌，当患病母畜流产时，大量病菌随着 流产胎儿、胎衣和子 宫分泌物一起排出，成为最危险的传染源。 布病疫苗是实施控制动物布病的重要手段。 我国现有的动物布病疫苗有：猪、牛、羊均可使用的布鲁氏菌活菌苗(S2 株)，主要 用于羊的布鲁氏菌活菌苗(M5株)，以及从国外引进用于牛的布鲁 氏菌活疫苗(A19株)。其 中，S2株应用最为广泛，据2011-2013年中国兽医 药品监察所生物制品产品批签发的统计 数据，我国每年使用S2株疫苗达1.5 亿头份以上，占动物布病疫苗的98％以上。 国际上，目前在使用的动物布病疫苗有：用于羊的布鲁氏菌活菌苗(Rev.1 株)，用 于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)及极少数地方在使用的布鲁氏菌活 疫苗(RB51株)。 根据菌株表型的不同，布鲁氏菌病疫苗可分为光滑(Smooth，S)型疫苗 和粗糙 (Rough，R)型疫苗。普遍使用的为S型疫苗，但历史上曾经短暂使用 过R型灭活疫苗45/20， 上世纪90年代，美国批准了另一种R型布鲁氏菌病活 疫苗RB51，但至今只有极少数地方使 用。 S型活疫苗有较好的免疫效果，但免疫抗体会干扰对野毒感染的抗体诊断， 并且 存在一定的安全性问题；R型活疫苗能区分感染与免疫的涉及LPS抗体的 诊断且安全性有 所提高，但是其免疫保护弱于S型活疫苗。 本发明通过用诱变剂诱变S型羊种布鲁氏菌Rev .1获得粗糙(R)型布鲁 氏菌 RM227，通过同源重组由S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得光滑(S)型布鲁 氏菌Rev.1-ΔwadC，两 种菌株经优选配比，制备成布鲁氏菌病RS双价疫苗，本 发明的RS双价疫苗既具有S型布鲁 氏菌病活疫苗的良好免疫保护力，又兼具 R型布鲁氏菌病活疫苗能区分自然感染抗体与免 疫所涉及的脂多糖(LPS)抗 体的诊断，还具有与R型布鲁氏菌病活疫苗近似的安全性，为预 防布鲁氏菌病 提供一种新型疫苗。
技术实现要素：
本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌 Rev.1随 机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。 所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌 株，获 3 CN 111733097 A 说 明 书 2/12 页 得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227于2020年5月12日保藏 于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19808。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养 基中配制成 R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌 株，37℃恒温摇床培养3 天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结 晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴 定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁 氏菌RM227。 所述R型布鲁氏菌诱变培养基的制备方法为：取0.1克诱导剂吖啶黄溶于 100mL灭 菌蒸馏水中，此为原液；取15g TSB溶于500mL蒸馏水中，121℃15min 高压灭菌，待其冷却至 室温，加入上述配制原液0.5μL，置于37℃恒温摇床， 1天后取出备用，即为诱变培养基。 所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组基因获得菌株， 获得的 菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，于020年5月12日保 藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19807。 所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为： (1)扩增羊种布鲁氏菌Rev .1的wadC基因上、下游同源臂，获得目的基 因片段 wadC-U和wadC-D； (2)融合羊种布鲁氏菌的wadC基因上、下游同源臂，获得融合后目的 片段wadC- UD； (3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC 19-SacB，构建重组质粒pUC 19-SacB- wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1 感受态细胞中，再 接种到氨苄平板培养基上，长出菌落后，将菌落原位复制接 种到氨苄平板培养基和蔗糖平 板培养基上，挑取氨苄板上长出而同时蔗糖板没 有长出的菌落为单交换菌；挑取单交换菌 菌落同时划线接种到氨苄板，蔗糖 板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即 为双交换菌；对双交换 菌进行PCR鉴定，对确定获得的wadC缺失菌株，命名为光滑(S)型布 鲁氏 菌Rev.1-ΔwadC。 本发明还公开上述布鲁氏菌保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。 本发明还公开一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，所述RS双价疫苗的生产菌株 包含权 利要求2或3所述的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和权利要求4或5所 述的光滑(S)型布鲁氏菌 Rev.1-ΔwadC。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 的配比 浓度为106-7:1；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑 (S)型布鲁氏菌Rev.1- ΔwadC的配比浓度为107:1。 所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为1011CFU/mL；所述光滑(S)型 布鲁氏菌 Rev.1-ΔwadC浓度为104CFU/mL-106CFU/mL；优选地，所述粗糙(R) 型布鲁氏菌RM227浓度为 1011CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 浓度为104CFU/mL。 所述RS双价疫苗中还包括疫苗保护剂；优选地，所述疫苗保护剂为明胶 蔗糖疫苗 保护剂。 所述布鲁氏菌病RS双价疫苗采用冻干工艺制备，所述冻干工艺为已批注 的布鲁 氏菌病活疫苗常规冻干工艺。 本发明具有有益效果如下： 4 CN 111733097 A 说 明 书 3/12 页 1、本实验通过诱导剂成功诱导了一株具有良好遗传稳定性的减毒株粗糙 (R)型 布鲁氏菌RM227,诱导株RM227缺失基因中包含wboA和wboB基因， 影响细菌的生长繁殖，较 亲本株对小鼠巨噬细胞的增殖能力有着明显的下降。 2、本发明通过同源重组基因技术获得一株具有良好遗传稳定性的减毒株 光滑 (S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，缺失wadC基因，对细菌的生长繁殖无影 响，其在胞内存活率 低于亲本株。 3、将粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 混合成双价 疫苗，用其免疫小鼠，在一定浓度配比范围内，两者间既存在协同 作用提高免疫保护，又可 区分自然感染抗体与免疫所涉及脂多糖(LPS)抗体 的诊断，而且安全性良好。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是 本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。 图1.诱变剂诱导菌株结晶紫染色鉴定。 图2.PCR检测布鲁氏菌LPS合成相关基因，M：DNA marker 5000；1： manAoAg；2-3： manBoAg；4：Gmd；5：Pmm；6：Pgm；7：wbkA；8：wbkB；9： wbkC；10：wbkD；11：wbkE；12：wbkF；13： wboA；14：wboB；15：Wa**；16： Per；17：Wzm；18：Wzt；19：man Bcore；20：man Ccore。 图3.诱导株RM227布鲁氏菌R型特性检测，A热凝集试验:1.犬种布鲁 氏菌RM6/66； 2,羊种布鲁氏菌M111；3,诱导株RM227；4,亲本株Rev.1；B菌 落结晶紫染色(左：Rev.1，右： RM227)；C吖啶黄凝集试验(1：Rev.1，2： RM227)。 图4.诱导株RM227和亲本株Rev.1生长曲线。 图5.巨噬细胞内存活测定(**,p≤0.01)。 图6.PCR扩增wadC基因上、下游同源臂，M：DNA Marker 2000；1：wadC-U 引物的PCR 产物；2：wadC-D引物的PCR产物。 图7.wadC-UD融合PCR扩增，M：DNA Marker 2000；1：融合PCR扩增产 物。 图8.转化菌落PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1-4：阴性质粒；5： 阳性质粒。 图9.单交换子筛选结果。 图10.第一次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对 照；2：Rev.1； 3-5：检测菌。 图11.双交换子筛选结果。 图12.第二次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对 照；2：Rev.1； 3-10：检测菌。 图13.内部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker 1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因 缺失株。 图14.外部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker 1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因 缺失株。 图15.亲本株Rev.1及其缺失株Rev.1-ΔwadC的生长曲线。 5 CN 111733097 A 说 明 书 4/12 页 图16.Rev.1和Rev.1-ΔwadC在BMDC、RAW264.7细胞中的存活能力。 图17.RS双价苗各组抗体变化水平：虚线表示阳性判定标准；①-⑤：RS 双价苗①- ⑤组。 图18.各组小鼠脾脏重：注：RS双价苗1-5组表示RS双价苗各组(免疫 剂量由低到 高)；S单价苗1-5组代表S单价苗各组(免疫剂量由低到高)；S 代表光滑型缺失株Rev.1-Δ wadC；R代表粗糙型诱导株M227。
