技术摘要：
提供一种快速测定含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒。1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒，对于含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用辅酶I和葡萄糖脱氢酶与NAD 全部
背景技术：
1，5-脱水葡萄糖醇(简称1，5-AG)可弥补其他血糖监控指标的不足，例如空腹血 糖、糖化白蛋白、糖化血红蛋白分别只能反映即时、近2～3周和近2～3个月的血糖，没有一 个指标能准确反映最近3～7天的血糖变化情况，1，5-AG刚好补了这个空缺。1，5-AG水平越 低，说明血糖控制越差。 1，5-脱水葡萄糖醇的化学结构与葡萄糖非常相似，已知商品化定量1，5-脱水葡萄 糖醇的试剂盒都必需清除试样中葡萄糖的干扰，由于生物试样中葡萄糖的含量远远大于1， 5-脱水葡萄糖醇，并且1，5-脱水葡萄糖醇的含量很低，故准确定量测定1，5-脱水葡萄糖醇 的含量非常困难。 目前测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶学方法主要包括(1)吡喃糖氧化酶法，该方法采 用葡萄糖激酶和丙酮酸激酶去除试样中葡萄糖的干扰，但葡萄糖激酶与1，5-脱水葡萄糖醇 也发生作用，使测定不准确；并且该方法直接采用Trinder’s显色法，测定灵敏度低。(2)1， 5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶法(中国专利授权公告号CN1179051C)，该方法采用二磷酸 腺苷依赖型己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸果糖激酶将试样中的葡萄糖转化为果 糖-1，6-二磷酸，去除葡萄糖干扰，该方法酶系复杂，定量试剂中含有6个酶和多个辅酶，以 消除葡萄糖产物和二磷酸腺苷的影响，在同一试剂中难以获得针对全部工具酶的最佳反应 条件，并且，磷酸葡萄糖异构酶也会发生可逆反应，使测定不准确。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种更加简便、节约的测定含葡萄糖试样中1， 5-脱水葡萄糖醇的方法，试样中的葡萄糖被完全清除，并且消除逆反应，不会干扰1，5-脱水 葡萄糖醇的定量测定方法，以及采用这些方法的试剂和试剂盒。 本发明的另一个优点是清除试样中葡萄糖的酶系与测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶 系采用不同的酶系及其辅酶或类似物，从而进一步消除干扰。 本发明的另一个优点是测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系不受二磷酸腺苷浓度的影 响，可以选用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶。 该方法采用氧化型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NAD)，或其类似物例如氧 化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称thio-NAD)、或氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸 (简称APAD)，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系(酶系1)，将试样 中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，达到实质上完全 清除试样中葡萄糖干扰的目的；随之采用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶和1，5-脱水葡 萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，在氧化型辅酶II选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 3 CN 111575339 A 说 明 书 2/8 页 酸(简称NADP)或氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称thio-NADP)，存在下与1，5- 脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型NADP进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。 另外，本发明还涉及1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，其含有氧化型NAD或其类似化 合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型 己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶。 另外，本发明还涉及1，5二脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由含有氧化型 NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷 酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶的试剂组成。 另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类 似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全 转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应。 另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除试剂，其特征在于该试剂含有氧化型NAD 或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于 采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系， 将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，采用酶反 应对试样中1，5-脱水葡萄糖醇进行定量。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，该试剂含有 氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱 水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒 由氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5- 脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。 本发明中所指试样是有可能含有葡萄糖的任何试样，例如血液、血浆、血清、尿液 等生物体试样。 试样中葡萄糖的清除方法可以按照下述反应式进行： GDH：葡萄糖脱氢酶 MDH：苹果酸脱氢酶 NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 仅仅将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯时，由于反应是可逆的，生成的葡萄糖酸内酯 可以再转化为葡萄糖，在该反应体系中通过将NADH转化为NAD，防止了葡萄糖的再转化，试 样中的葡萄糖可以完全消除。另外，氧化NADH后，也消除了NADH对后续测定的影响。 上述消除葡萄糖的方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐 4 CN 111575339 A 说 明 书 3/8 页 剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～ 50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。 葡萄糖脱氢酶NAD或NADP依赖型均可以，特别优选NAD依赖型，浓度优选0.1～ 200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。 NAD依赖型苹果酸脱氢酶的浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2 ～30U/mL。 两种酶都是市售商品，如东洋坊公司的NAD/NADP依赖型葡萄糖脱氢酶，积水公司 的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶，东洋坊公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶，Sorachim公司的NAD依 赖型苹果酸脱氢酶。 氧化型辅酶I选自NAD，或thio-NAD、APAD等类似物，浓度优选0.01mM～100mM，更优 选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化镁、 土温20、或曲拉通X-100，无机盐类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优 选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～ 0.5％。 通过上述反应消除葡萄糖后，即可采用由三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、氧化型辅 酶II和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，与1，5-脱水葡萄糖醇反应， 对生成的还原型辅酶II进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。 试样中1，5-脱水葡萄糖醇的的定量方法可以按照下述反应式进行： ATP：三磷酸腺苷 ADP：二磷酸腺苷 1，5-AG-6-P：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸 1，5-AG-6-PDH：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 上述酶反应方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定 剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条 件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。 检测1，5-脱水葡萄糖醇所需的酶、辅酶II只要不影响试样中消除葡萄糖，不干扰 后续定量，可以与消除葡萄糖的酶系共存。 ATP依赖型己糖激酶浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/ mL。 1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶必需选择NADP依赖型，以隔离消除葡萄糖的酶 系1，保证测定准确性，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/mL。 辅酶II的浓度优选0.01mM～100mM，更优选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂 如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、土温20、或曲拉通X-100，无机盐 类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度 优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～0.5％。 5 CN 111575339 A 说 明 书 4/8 页 两种酶很容易从市售商品获得，如三磷酸腺苷依赖型己糖激酶可从罗氏公司、东 洋坊公司、旭化成公司购得，NADP依赖型1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶可从旭化成公司 购得。 由于1，5-脱水葡萄糖醇在试样中的浓度很低，糖代谢异常情况下浓度更低，故有 必要对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，例如黄递酶催化还原型辅酶II与四唑 盐反应，生成甲臜色素，选择摩尔吸光度高的四唑盐，生成的甲臜色素吸光度更高。常用的 四唑盐包括氯化2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑(简称INT)、3，3’-[3， 3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’-二甲基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐氯化 物](简称NTB)、2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简称WST- 1)，硝基蓝四唑盐、2-(4-碘代苯)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简 称WST-3)，2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-(2-磺乙基)氨基甲酰苯基]-3，3’-二甲氧基-4， 4’-二亚苯基)二四氮唑二钠盐(简称WST-5)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’- 二甲基]-双(2，5-二苯基-2H-四唑盐氯化物)(简称TB)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-苯基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-硫代苯基)-2H-四唑盐(简称MTS)等。 四唑盐浓度优选0.01～50mM，特别优选0.1～10mM。 本发明中使用的黄递酶为NADP依赖型，以进一步隔离消除葡萄糖的酶系1，保证测 定准确性，其商品可从旭化成公司购得，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优 选1～30U/mL。 另外，对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，还可以采用Trinder’s方 法，用NADPH氧化酶氧化NADPH生成过氧化氢，对过氧化氢进行显色定量。Trinder’s方法中 使用的过氧化物酶和各种色原体，包括独立色原体和与4-氨基安替比林组合的色原体，优 选摩尔吸光度高的独立色原体，以提高测定灵敏度。 独立色原体包括10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(简称DA-67)， N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺(简称DA-64)，10-N-羧基甲基氨基甲酰 基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(简称CCAP)等。 与4-氨基安替比林组合的色原体包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺 (简称TOOS)，N，N-二(4-磺丙基)-3-甲苯胺(简称TODB)等。 反应在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色 原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分 钟，优选2～10分钟。 缓冲液例如磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、Good‘s缓冲液等。 赋活剂例如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、甘油、 甘露糖醇、海藻糖、土温20、曲拉通X-100等。 稳定剂例如牛血清白蛋白、氨基酸、可溶性淀粉、聚乙二醇、螯合剂等。 其它可以添加的酶或辅酶例如过氧化氢酶、FAD等。 防腐剂例如ProClin 300、叠氮钠等。 本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型 辅酶I或其类物、草酰乙酸、己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化 型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、 6 CN 111575339 A 说 明 书 5/8 页 色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 上述试剂可以制成1，5-脱水葡萄糖醇定量用试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2组 成，试剂1含有(a)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者 (b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇- 6-磷酸脱氢酶，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活 性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸 腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧 化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性 剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的葡萄糖消除用试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其 类似物、草酰乙酸，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面 活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、三磷酸腺 苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调 节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅 酶等。 该定量试剂可以制成由试剂1和试剂2组成的试剂盒，其中试剂1含有(a)葡萄糖脱 氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者(b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱 氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，必要时还含 有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑 盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6- 磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧化型辅酶II，必要时还含有 上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、 其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的各种试剂可以调制成冻干品后供给，也可以溶解于水等液体中供给。 附图说明 【图1】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡 萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。 【图2】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到 的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。 【图3】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡 萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。 【图4】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到 的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。
提供一种快速测定含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒。1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒，对于含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用辅酶I和葡萄糖脱氢酶与NAD 全部
背景技术：
1，5-脱水葡萄糖醇(简称1，5-AG)可弥补其他血糖监控指标的不足，例如空腹血 糖、糖化白蛋白、糖化血红蛋白分别只能反映即时、近2～3周和近2～3个月的血糖，没有一 个指标能准确反映最近3～7天的血糖变化情况，1，5-AG刚好补了这个空缺。1，5-AG水平越 低，说明血糖控制越差。 1，5-脱水葡萄糖醇的化学结构与葡萄糖非常相似，已知商品化定量1，5-脱水葡萄 糖醇的试剂盒都必需清除试样中葡萄糖的干扰，由于生物试样中葡萄糖的含量远远大于1， 5-脱水葡萄糖醇，并且1，5-脱水葡萄糖醇的含量很低，故准确定量测定1，5-脱水葡萄糖醇 的含量非常困难。 目前测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶学方法主要包括(1)吡喃糖氧化酶法，该方法采 用葡萄糖激酶和丙酮酸激酶去除试样中葡萄糖的干扰，但葡萄糖激酶与1，5-脱水葡萄糖醇 也发生作用，使测定不准确；并且该方法直接采用Trinder’s显色法，测定灵敏度低。(2)1， 5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶法(中国专利授权公告号CN1179051C)，该方法采用二磷酸 腺苷依赖型己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸果糖激酶将试样中的葡萄糖转化为果 糖-1，6-二磷酸，去除葡萄糖干扰，该方法酶系复杂，定量试剂中含有6个酶和多个辅酶，以 消除葡萄糖产物和二磷酸腺苷的影响，在同一试剂中难以获得针对全部工具酶的最佳反应 条件，并且，磷酸葡萄糖异构酶也会发生可逆反应，使测定不准确。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种更加简便、节约的测定含葡萄糖试样中1， 5-脱水葡萄糖醇的方法，试样中的葡萄糖被完全清除，并且消除逆反应，不会干扰1，5-脱水 葡萄糖醇的定量测定方法，以及采用这些方法的试剂和试剂盒。 本发明的另一个优点是清除试样中葡萄糖的酶系与测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶 系采用不同的酶系及其辅酶或类似物，从而进一步消除干扰。 本发明的另一个优点是测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系不受二磷酸腺苷浓度的影 响，可以选用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶。 该方法采用氧化型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NAD)，或其类似物例如氧 化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称thio-NAD)、或氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸 (简称APAD)，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系(酶系1)，将试样 中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，达到实质上完全 清除试样中葡萄糖干扰的目的；随之采用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶和1，5-脱水葡 萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，在氧化型辅酶II选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 3 CN 111575339 A 说 明 书 2/8 页 酸(简称NADP)或氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称thio-NADP)，存在下与1，5- 脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型NADP进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。 另外，本发明还涉及1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，其含有氧化型NAD或其类似化 合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型 己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶。 另外，本发明还涉及1，5二脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由含有氧化型 NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷 酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶的试剂组成。 另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类 似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全 转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应。 另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除试剂，其特征在于该试剂含有氧化型NAD 或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于 采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系， 将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，采用酶反 应对试样中1，5-脱水葡萄糖醇进行定量。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，该试剂含有 氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱 水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。 另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒 由氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5- 脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。 本发明中所指试样是有可能含有葡萄糖的任何试样，例如血液、血浆、血清、尿液 等生物体试样。 试样中葡萄糖的清除方法可以按照下述反应式进行： GDH：葡萄糖脱氢酶 MDH：苹果酸脱氢酶 NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 仅仅将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯时，由于反应是可逆的，生成的葡萄糖酸内酯 可以再转化为葡萄糖，在该反应体系中通过将NADH转化为NAD，防止了葡萄糖的再转化，试 样中的葡萄糖可以完全消除。另外，氧化NADH后，也消除了NADH对后续测定的影响。 上述消除葡萄糖的方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐 4 CN 111575339 A 说 明 书 3/8 页 剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～ 50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。 葡萄糖脱氢酶NAD或NADP依赖型均可以，特别优选NAD依赖型，浓度优选0.1～ 200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。 NAD依赖型苹果酸脱氢酶的浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2 ～30U/mL。 两种酶都是市售商品，如东洋坊公司的NAD/NADP依赖型葡萄糖脱氢酶，积水公司 的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶，东洋坊公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶，Sorachim公司的NAD依 赖型苹果酸脱氢酶。 氧化型辅酶I选自NAD，或thio-NAD、APAD等类似物，浓度优选0.01mM～100mM，更优 选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化镁、 土温20、或曲拉通X-100，无机盐类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优 选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～ 0.5％。 通过上述反应消除葡萄糖后，即可采用由三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、氧化型辅 酶II和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，与1，5-脱水葡萄糖醇反应， 对生成的还原型辅酶II进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。 试样中1，5-脱水葡萄糖醇的的定量方法可以按照下述反应式进行： ATP：三磷酸腺苷 ADP：二磷酸腺苷 1，5-AG-6-P：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸 1，5-AG-6-PDH：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 上述酶反应方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定 剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条 件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。 检测1，5-脱水葡萄糖醇所需的酶、辅酶II只要不影响试样中消除葡萄糖，不干扰 后续定量，可以与消除葡萄糖的酶系共存。 ATP依赖型己糖激酶浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/ mL。 1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶必需选择NADP依赖型，以隔离消除葡萄糖的酶 系1，保证测定准确性，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/mL。 辅酶II的浓度优选0.01mM～100mM，更优选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂 如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、土温20、或曲拉通X-100，无机盐 类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度 优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～0.5％。 5 CN 111575339 A 说 明 书 4/8 页 两种酶很容易从市售商品获得，如三磷酸腺苷依赖型己糖激酶可从罗氏公司、东 洋坊公司、旭化成公司购得，NADP依赖型1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶可从旭化成公司 购得。 由于1，5-脱水葡萄糖醇在试样中的浓度很低，糖代谢异常情况下浓度更低，故有 必要对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，例如黄递酶催化还原型辅酶II与四唑 盐反应，生成甲臜色素，选择摩尔吸光度高的四唑盐，生成的甲臜色素吸光度更高。常用的 四唑盐包括氯化2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑(简称INT)、3，3’-[3， 3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’-二甲基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐氯化 物](简称NTB)、2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简称WST- 1)，硝基蓝四唑盐、2-(4-碘代苯)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简 称WST-3)，2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-(2-磺乙基)氨基甲酰苯基]-3，3’-二甲氧基-4， 4’-二亚苯基)二四氮唑二钠盐(简称WST-5)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’- 二甲基]-双(2，5-二苯基-2H-四唑盐氯化物)(简称TB)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-苯基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-硫代苯基)-2H-四唑盐(简称MTS)等。 四唑盐浓度优选0.01～50mM，特别优选0.1～10mM。 本发明中使用的黄递酶为NADP依赖型，以进一步隔离消除葡萄糖的酶系1，保证测 定准确性，其商品可从旭化成公司购得，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优 选1～30U/mL。 另外，对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，还可以采用Trinder’s方 法，用NADPH氧化酶氧化NADPH生成过氧化氢，对过氧化氢进行显色定量。Trinder’s方法中 使用的过氧化物酶和各种色原体，包括独立色原体和与4-氨基安替比林组合的色原体，优 选摩尔吸光度高的独立色原体，以提高测定灵敏度。 独立色原体包括10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(简称DA-67)， N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺(简称DA-64)，10-N-羧基甲基氨基甲酰 基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(简称CCAP)等。 与4-氨基安替比林组合的色原体包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺 (简称TOOS)，N，N-二(4-磺丙基)-3-甲苯胺(简称TODB)等。 反应在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色 原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分 钟，优选2～10分钟。 缓冲液例如磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、Good‘s缓冲液等。 赋活剂例如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、甘油、 甘露糖醇、海藻糖、土温20、曲拉通X-100等。 稳定剂例如牛血清白蛋白、氨基酸、可溶性淀粉、聚乙二醇、螯合剂等。 其它可以添加的酶或辅酶例如过氧化氢酶、FAD等。 防腐剂例如ProClin 300、叠氮钠等。 本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型 辅酶I或其类物、草酰乙酸、己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化 型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、 6 CN 111575339 A 说 明 书 5/8 页 色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 上述试剂可以制成1，5-脱水葡萄糖醇定量用试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2组 成，试剂1含有(a)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者 (b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇- 6-磷酸脱氢酶，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活 性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸 腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧 化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性 剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的葡萄糖消除用试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其 类似物、草酰乙酸，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面 活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、三磷酸腺 苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调 节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅 酶等。 该定量试剂可以制成由试剂1和试剂2组成的试剂盒，其中试剂1含有(a)葡萄糖脱 氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者(b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱 氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，必要时还含 有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑 盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6- 磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧化型辅酶II，必要时还含有 上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、 其它酶及其基质或辅酶等。 本发明的各种试剂可以调制成冻干品后供给，也可以溶解于水等液体中供给。 附图说明 【图1】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡 萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。 【图2】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到 的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。 【图3】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡 萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。 【图4】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到 的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。
