技术摘要：
本发明公开了一种分泌非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用，其中，杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO:C202042，杂交瘤细胞株的制备方法包括：1)表达获得非洲猪瘟病毒p34蛋白；2)免疫动物获得免疫脾脏细胞；3)细胞融合和阳性杂交瘤细胞株筛选  全部
背景技术：
非洲猪瘟(African  Swine  Fever,ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病，可导 致家猪接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASF  Virus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的 双链DNA病毒，主要在巨噬细胞的细胞质中复制，结构为正20面体，直径约175～215nm，基因 组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性 DNA病毒。构成病毒粒子的结构蛋白有P72、P54、pp62、P220等蛋白，其中pp62和pp220是ASFV 的两种多聚蛋白前体，分别由CP530R和CP2475L基因编码。pp62蛋白是病毒复制晚期蛋白， 翻译后经蛋白酶加工生成两种结构蛋白P35和P15。pp220蛋白是细胞溶质的膜结合蛋白，蛋 白酶加工后产生病毒粒子的主要成分P150、P37、P34以及P14蛋白，以上这些结构蛋白均存 在于成熟病毒粒子的核衣壳中，约占ASFV总蛋白组分的30％，在核衣壳的装配过程中发挥 着重要作用，对病毒内核蛋白的包装起着重要的作用。P34具有较好的免疫原性，可以作为 疫苗开发的抗原。迄今为止，由于AFSV基因组的复杂性，非洲猪瘟蛋白结构的多样性，一直 尚未研发出十分有效的非洲猪瘟病毒疫苗，缺乏对非猪瘟病毒疫苗方法的开发研究。 血清学检测因为简单操作，成本相对较低，且不需要专门的设备而成为ASF最常用 的诊断检测方法，但是因为没有针对ASF的商业疫苗，这意味着抗ASFV抗体的存在即表明感 染，此外，抗ASFV抗体在感染后7-10天很快出现，并持续数月至数年，但感染强毒株的家猪 和野猪通常在产生特定的抗体免疫反应之前就会死亡，在明确的ASFV感染地区，当减毒和 低毒性病毒循环时，血清学检测对确定恢复和无症状感染的动物至关重要。
技术实现要素：
基于上述现有技术的不足，本发明的目的在提供一种分泌非洲猪瘟病毒p34蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单克隆抗体，以期为非洲猪瘟病毒的检测奠定基础。 作为本申请的第一方面，本申请提供一种分泌非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体 的杂交瘤细胞株。 作为优选，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC  NO:C202042。 作为本申请的第二方面，本申请提供一种分泌非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体 的杂交瘤细胞株的制备方法。 作为优选，所述制备方法包括以下步骤： 1)表达获得非洲猪瘟病毒p34蛋白； 2)免疫动物获得免疫脾脏细胞； 以非洲猪瘟病毒p34蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得免疫脾脏细胞； 4 CN 111549001 A 说　明　书 2/16 页 3)细胞融合和阳性杂交瘤细胞株筛选； 将1×108个所述免疫脾脏细胞与1×107个骨髓瘤细胞进行融合，融合10-14天后对 细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选获得阳性杂交瘤细胞株； 4)分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株的筛选: 以非洲猪瘟病毒p34蛋白为抗原对步骤3)所得阳性杂交瘤细胞株进行筛选，获得 稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行亚克隆，经亚型鉴定为IgG1，取阳性亚克隆建株 保存，即得所述分泌非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 作为优选，所述步骤4)中，分别采用由CHO-S细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34蛋 白、SF9昆虫细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34蛋白和重组腺病毒载体转染HEK293细胞表达 制备的非洲猪瘟病毒p34蛋白对所述阳性杂交瘤细胞株进行筛选，筛选获得的杂交瘤细胞 株所产生的单克隆抗体能够同时被由CHO-S细胞、SF9昆虫细胞和重组腺病毒载体转染 HEK293细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34抗原识别。 作为优选，所述由CHO-S细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34蛋白的制备方法包括将 表达非洲猪瘟病毒p34蛋白的基因序列连于pSecTag-2B获得表达载体pSecTag-2B-p34，使 用pSecTag-2B-p34表达载体转染CHO-S细胞，诱导表达并经纯化后获得非洲猪瘟病毒p34蛋 白； 所述由SF9昆虫细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34蛋白的制备方法包括：将表达非 洲猪瘟病毒p34蛋白的基因序列连于Bacmid的穿梭质粒pFastBac上，获得表达载体 pFastBac-p34，使用Bacmid的感受态细胞DH10Bac将pFastBac-p34转化至其中，提取病毒基 因组即为Bacmid-p34，将Bacmid-p34转染SF9细胞，诱导表达并经纯化后获得非洲猪瘟病毒 p34蛋白； 所述由重组腺病毒载体转染HEK293细胞表达制备的非洲猪瘟病毒p34蛋白的制备 方法包括：将重组腺病毒载体pAd5-p34接种至HEK293细胞中，诱导表达并经纯化后获得非 洲猪瘟病毒p34蛋白。 作为本申请的第三方面，本申请提供一种非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体。 作为优选，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC  NO:C202042的杂交瘤细胞株所分 泌。 作为本申请的第四方面，本申请提供第三方面所述的非洲猪瘟病毒p34蛋白单克 隆抗体在检测非洲猪瘟病毒中的应用。 作为本申请的第五方面，本申请提供第三方面所述的非洲猪瘟病毒p34蛋白单克 隆抗体在制备用于检测非洲猪瘟病毒的免疫检测工具中的应用。 作为优选，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、试纸条或生物芯片。 作为本申请的第五方面，本申请提供一种用于检测样品中非洲猪瘟病毒存在和/ 或其水平的试剂盒。 作为优选，所述试剂盒包括第三方面所述的非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体。 作为优选，所述试剂盒中还包括非洲猪瘟病毒细胞培养物或非洲猪瘟病毒p34蛋 白包被的酶标板、HPR标记的山羊抗鼠二抗、洗涤液、封闭液、抗体稀释液、显色液以及终止 液。 本申请的有益效果： 5 CN 111549001 A 说　明　书 3/16 页 1)本申请采用哺乳动物细胞CHO表达系统制备p34抗原蛋白，使得蛋白的折叠及糖 基化更接近与天然蛋白； 2)本申请通过三种表达系统制备的抗原进行能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 株筛选，获得的杂交瘤细胞株能够稳定地分泌抗非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体，并使所 制备的单克隆抗体特异性更强，可以更适用地进行各项检测工作； 3)本申请的单克隆抗体可应用于腺病毒包装的p34蛋白的检测，因市场上没有p34 抗体的售卖，填补了国内检测试剂盒的空白，且该单克隆抗体能够更好的应用于检测哺乳 动物细胞包装的抗原。 附图说明 图1是p34蛋白扩增电泳图； 图2是酶切产物琼脂图电泳结果图，泳道1是p34片段回收产物，泳道2和3是载体酶 切产物； 图3是pSecTag-2B-p34重组载体菌落PCR验证结果图，其中，选择泳道17、20、21、22 所对应的载体进行酶切验证； 图4是图3泳道17、20、21、22所对应的载体的酶切结果图； 图5是Ni柱纯化示意图； 图6是梯度咪唑洗脱SDS-PAGE检测结果； 图7是p34超滤浓缩后BSA定量检测结果； 图8是单克隆抗体与腺病毒包装的p34蛋白进行免疫反应的实验结果图； 图9是本发明实施例的p34基因片段的扩增结果图； 图10是本发明实施例的重组穿梭质粒pS5E1-p34的载体图谱； 图11是本发明实施例的重组腺病毒载体pAd5-p34的XhoI酶切结果图； 图12是本发明实施例的重组腺病毒载体pAd5-p34的载体图谱。 图13A是CMV-MCS片段和SV40  earlypolyA片段的琼脂糖凝胶电泳结果图,M为 2000Marker，1为CMV-MCS片段，2为SV40-earlypolyA片段；图13B是CMV-MCS- SV40earlypolyA融合片段、PUC片段、Ad5右臂和Ad5左臂的琼脂糖凝胶电泳结果图,M为 2000Marker，1为CMV-MCS-SV40  earlypolyA融合片段，2为PUC，3为Ad5右臂，4为Ad5左臂；图 13C是菌落PCR扩增CMV-MCS-SV40  polyA和Ad5左臂的琼脂糖凝胶电泳结果图；图13D是穿梭 质粒pS5E1的单酶切验证结果图。 本申请的杂交瘤细胞株在中国典型培养物保藏中心(China  Center  for  Type  Culture  Collection，简称CCTCC)进行保藏，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299 号武汉大学，保藏日期为：2020年1月16日，保藏号为CCTCC  NO:C202042，分类名称为： AYP34-83。