技术摘要：
本发明涉及一种高通量筛选细胞响应环境极端温度靶点基因的方法，首先构建或购买CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。然后将该细胞文库均匀的分成几份，其中一份用完全培养基在正常培养条件下培养，作为对照组；其他几份用完全培养基在极端温度条件下培养，直至细胞数量仅  全部
背景技术：
温度是影响生物体生命活动的重要外部因素，恒温动物通过体温调节中枢来适应 环境温度；变温动物则对环境温度更加敏感，已有研究报道证实极端温度对农业害虫的活 动产生重大影响，对农业生产危害加剧(如传粉昆虫蜜蜂受到极端温度影响，数量减少、生 命状态变差，传粉能力减弱，导致农作物减产)；植物固定不能移动，对极端温度只能被动接 受，早春寒冷、夏日极端高温等对农林作物产生极大危害，导致农林作物减产。随着全球变 暖越来越严重，极端温度席卷全球，对生命活动产生重大影响。目前来看，全球变暖趋势进 一步加剧，必将带来更加严重而频繁的极端温度，研究极端温度对生物的影响，筛选极端温 度影响细胞的靶点基因，对于减少极端温度对生物的损害至关重要。 传统的研究功能基因的技术手段是正向遗传学，解决了大量的生物学问题，但是 耗时耗力。CRISPR/Cas9介导的全基因组筛选是研究功能基因组的全新技术手段，可以在全 基因组范围内高通量，短周期，低成本的研究大量基因功能，对于筛选特定功能基因具有很 好的效果，目前已经广泛应用于人、小鼠、果蝇等模式生物，在筛选药物靶点基因、抗病毒靶 点基因、免疫相关基因等方面取得了重要研究成果。在筛选特定功能基因组方面显示出优 异的效果。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量筛选细胞响应环境极端温度靶点基 因的方法。 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种高通量筛选细胞响应环境极端温度靶点基因的方法，具体步骤如下： (1)构建转基因系统递送的CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库； (2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全 基因组编辑细胞文库； (3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成若干份，其中一份作为对照组，剩余的 几份作为实验组，同时收集对照组细胞和实验组细胞，并分别抽提细胞基因组DNA； (4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段， 分别建库后执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选细胞响应环境极端温度靶点基因，靶点 基因筛选标准p<0.05。 作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是： (1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合 成包含打靶位点的单链寡核苷酸库； 3 CN 111549063 A 说　明　书 2/4 页 (1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。 作为进一步优选的技术方案之一，按照Cas作用规律，在真核生物全基因组水平设 计所有编码蛋白的基因的编辑位点，其打靶位点有如下规律： 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，设计的sgRNA序列与其在基因组上的打靶位点 序列一致，并有如下规律：5’-G-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；根据以上规律设计真核生物全 部编码蛋白的基因的打靶位点。 作为进一步优选的技术方案之一，运用搭桥PCR技术和酶切连接技术将合成的单 链寡核苷酸库克隆到载体pB-CRISPR上，构建得到基因编辑载体库pB-CRISPR-library。 作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳 定整合到细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库，库容＞100×。 作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，所述细胞为真核生物细胞或原核生物细 胞。 作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库 均匀分成若干份，其中一份作为对照组，用完全培养基在细胞最佳培养温度条件下培养；剩 余的几份作为实验组，分别用完全培养基在极端温度下培养，极端温度是高于或者低于细 胞最佳培养温度，细胞生长状态明显受到影响，直至细胞数量仅存约10％，同时收集对照组 细胞和实验组细胞，并分别抽提细胞基因组DNA。 作为优选的技术方案之一，步骤(4)的具体方法是，与对照组相比，实验组sgRNA富 集或消耗的基因即为细胞响应环境极端温度刺激的候选靶点基因。 本发明的有益效果在于： 本发明首先构建或购买CRISPR/Cas全基因组编辑载体细胞文库。然后将该细胞文 库均匀的分成几份，其中一份用完全培养基在正常培养条件下培养，作为对照组；其他几份 用完全培养基在极端温度下培养，直至细胞数量仅存约10％，作为实验组。将收集到的实验 组和对照组细胞分别抽提基因组，用高通量测序方法分析sgRNA丰度，筛选细胞响应环境极 端温度靶点基因。本发明最大的优点是简单高效，能够在全基因组水平筛选功能基因组。 附图说明 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明： 图1为本发明的工作流程图； 图2为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端低温(4℃)条件下靶点基因富集情 况； 图3为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端高温(30℃)条件下靶点基因富集情 况； 图4为家蚕BmE细胞响应极端温度基因的亚细胞定位比例。(Mit,线粒体；ERM,内质 网膜；GOLM,高尔基体膜；PM,细胞质膜)。