技术摘要：
本发明提供一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的方法，属于血液检测分析技术领域，包括以下步骤：（1）测试血液样品的准备；（2）配制内标工作液；（3）取待测物质的标准母液，用标准稀释液将标准母液稀释；（4）取出内标工作液，配置以下溶液，标准曲 全部
背景技术：
质谱法即用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离 子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用 产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的 化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的， 而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物 的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等 信息。 质谱的基本原理是将分析物离子化为各种质荷比（m/z）不同的带电粒子，应用电 磁学原理，带电粒子按m/z在空间或时间上产生分离排列成的图谱，根据它们所形成的图 谱、离子峰强度对分析物进行鉴定和定量。串联质谱（tandemmassspectrometry，MS/MS）就 是将两台质谱仪经碰撞室串联起来，第一台质谱仪作为分离器，第二台质谱仪作为分析仪 对带电粒子进行分析。由于串联质谱技术是对分析物解离后的带电粒子进行分析，所以具 有较高的特异性和灵敏性，其检测水平能达到pg级，且仅需微量的样本量。质谱法还可以进 行有效的定性分析，但对复杂有机化合物分析就无能为力了，而且在进行有机物定量分析 时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分 析方法，特别适合进行有机化合物的定量分析，但定性分析则比较困难，因此两者的有效结 合将提供一个进行复杂化合物高效的定性定量分析的工具。 儿茶酚胺是一种含有儿茶酚（邻苯二酚）和胺基的神经类物质，包括多巴胺、去甲 肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。这三种儿茶酚胺都是以酪氨酸为前体在大脑中枢神 经系统、交感神经系统、肾上腺髓质等部位合成并分泌。嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、肾上腺 髓质增生、脑梗死、重症肌无力、进行性肌营养不良、低血糖、心肌梗死、精神分裂症、躁狂性 精神病等疾病会导致体内儿茶酚胺升高，帕金森病、癫痫、肾上腺切除后、风湿热、营养不良 等疾病会导致体内儿茶酚胺降低。通过对儿茶酚胺的准确检测，能够有效的诊断并及时治 疗相关疾病。利用串联质谱法检测儿茶酚胺的含量具有特异性好、灵敏度高、分析时间短等 优点。 已公开的申请号为CN201410048909.4的中国专利中公开了一种测定人血浆中丹 参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，该发明涉及一种药物含量的测定方 法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。本 发明所述的方法，包括以下步骤：1)对照品储备液的制备：称取丹参素、间位甲基丹参素、原 儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶 3 CN 111721853 A 说 明 书 2/6 页 酸对照品储备液。2)内标溶液的制备：取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。3)血浆样 品处理方法：取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙 酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。4)含量测定：采用LC-MS/MS色谱法， 将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的 面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。该方法抗干扰能 力差、准确性低，测量的结果容易受到外界不利因素的影响。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的 方法，在待测样本中加入丹磺酰氯，通过衍生改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子， 提高正离子模式下的离子化效率，并可以减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低分析物 极性，使其更加容易进入仪器真空环境，提高检测的灵敏度，抗干扰能力强。 本申请中适用于使用串联质谱法检测的儿茶酚胺类物质包括去甲肾上腺素NE、肾 上腺素E、甲氧基去甲肾上腺素NMN、甲氧基肾上腺素MN、多巴胺DA、高香草酸HVA、香草扁桃 酸VMA、甲氧酪胺3-MT。 本发明为一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的方法，包括以 下步骤： （1）测试血液样品的准备：收集待测的全血和健康的全血，用低温离心机离心，分离出 来的血浆在-80℃避光保存，得到待测血浆、健康血浆，低温离心机的离心力为1000-1200g， 离心时的温度为4℃，所述离心的时间为8-10min； （2）配制内标工作液：用乙腈稀释DHBA（二羟基苯甲酸）、MN-D3、VMA-D3母液的混合溶 液，旋涡混合30s,内标工作液的浓度为35.51~42.84nmol/L，稀释完后放入4℃，得到内标工 作液，冰箱备用； （3）取待测物质的标准母液（可以在市面上购买），用标准稀释液将标准母液稀释，稀释 为不同浓度的标准工作液，所述标准稀释液包括甲酸、乙腈，标准稀释液按重量份计包括甲 酸0.04-0.06份、乙腈87-90份，标准工作液的目的是为了找到标准曲线，利用标注曲线能够 求得待测血液的浓度；步骤（3）所述稀释为将母液稀释以后作为第一次稀释母液，再对第一 次稀释母液进行第二次稀释得到第二次稀释母液……，依次进行稀释6-12次。如可以稀释8 次，当次稀释相对于前次稀释的稀释倍数为3，所述第二次稀释是将第一次稀释母液稀释3 倍，所述第三次稀释是将第二次稀释母液稀释3倍……。 （4）取出内标工作液，放置室温5min后，涡旋混合30s，配置以下溶液，标准曲线样： AuL基底样、AuL标准工作液、BuL内标工作液；基底样液：AuL基底样、AuL标准稀释液、BuL内 标工作液；测试样：AuL待测血浆、AuL乙腈、BuL内标工作液；质控样：AuL健康血浆、AuL乙腈、 BuL内标工作液；标准曲线样是用来构建标准曲线，推算待测样品中待测物质的浓度。基底 样就是拿健康人的血浆，然后晾晒，这时的血浆里的儿茶酚胺类物质很少，这个基底样就可 以作为本底，它作用就是排除人的内源性儿茶酚胺水平，这样做更准确。质控样是用来排除 外界干扰，如果质控样做出来结果是对的，说明实验整体没问题，哪怕待测品结果不好，也 只能说明待测样品有问题。 （5）用涡旋混合器充分混合5min，然后在11000r/min4℃下离心10min，用移液枪将 4 CN 111721853 A 说 明 书 3/6 页 标准曲线样、基底样液、测试样、质控样的上清液转移到EP管中，为第一管、第二管、第三管、 第四管，进行冷冻干燥，如可以用1mL的移液枪转移0.7mL上清液到另外一个1.5mlEP管，在- 80℃预冷冻20min后，用真空冷冻干燥器冻干2h10min，剩余体积少于20uL；如果剩余体积较 多，说明真空状态有问题或者冷冻器温度没有降下来，检查完真空冷冻干燥器后，继续冷冻 直至体积少于20uL； （6）分别向第一管、第二管、第三管、第四管中加入NaOH溶液、丹磺酰氯乙腈溶液，旋涡 混合30s，避光进行衍生反应，所述丹磺酰氯乙腈溶液的浓度为3-4mg/mL，所述衍生反应的 反应温度为45-50℃，反应时间为15-20min； （7）向第一管、第二管、第三管、第四管加入反应终止剂、超纯水，旋涡混合、离心后取上 清液，放入孔板中进行液质分析，终止剂为质量分数为4-5%的甲酸溶液，所述液质分析流动 相A为含10mM乙酸铵的0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。 本发明中串联质谱法前处理采用衍生化法处理样本，在样本中加入丹磺酰氯，通 过衍生改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率，并可 以减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低分析物极性，使其更加容易进入仪器真空环境， 提高检测的灵敏度。
本发明提供一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的方法，属于血液检测分析技术领域，包括以下步骤：（1）测试血液样品的准备；（2）配制内标工作液；（3）取待测物质的标准母液，用标准稀释液将标准母液稀释；（4）取出内标工作液，配置以下溶液，标准曲 全部
背景技术：
质谱法即用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离 子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用 产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的 化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的， 而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物 的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等 信息。 质谱的基本原理是将分析物离子化为各种质荷比（m/z）不同的带电粒子，应用电 磁学原理，带电粒子按m/z在空间或时间上产生分离排列成的图谱，根据它们所形成的图 谱、离子峰强度对分析物进行鉴定和定量。串联质谱（tandemmassspectrometry，MS/MS）就 是将两台质谱仪经碰撞室串联起来，第一台质谱仪作为分离器，第二台质谱仪作为分析仪 对带电粒子进行分析。由于串联质谱技术是对分析物解离后的带电粒子进行分析，所以具 有较高的特异性和灵敏性，其检测水平能达到pg级，且仅需微量的样本量。质谱法还可以进 行有效的定性分析，但对复杂有机化合物分析就无能为力了，而且在进行有机物定量分析 时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分 析方法，特别适合进行有机化合物的定量分析，但定性分析则比较困难，因此两者的有效结 合将提供一个进行复杂化合物高效的定性定量分析的工具。 儿茶酚胺是一种含有儿茶酚（邻苯二酚）和胺基的神经类物质，包括多巴胺、去甲 肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。这三种儿茶酚胺都是以酪氨酸为前体在大脑中枢神 经系统、交感神经系统、肾上腺髓质等部位合成并分泌。嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、肾上腺 髓质增生、脑梗死、重症肌无力、进行性肌营养不良、低血糖、心肌梗死、精神分裂症、躁狂性 精神病等疾病会导致体内儿茶酚胺升高，帕金森病、癫痫、肾上腺切除后、风湿热、营养不良 等疾病会导致体内儿茶酚胺降低。通过对儿茶酚胺的准确检测，能够有效的诊断并及时治 疗相关疾病。利用串联质谱法检测儿茶酚胺的含量具有特异性好、灵敏度高、分析时间短等 优点。 已公开的申请号为CN201410048909.4的中国专利中公开了一种测定人血浆中丹 参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，该发明涉及一种药物含量的测定方 法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。本 发明所述的方法，包括以下步骤：1)对照品储备液的制备：称取丹参素、间位甲基丹参素、原 儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶 3 CN 111721853 A 说 明 书 2/6 页 酸对照品储备液。2)内标溶液的制备：取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。3)血浆样 品处理方法：取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙 酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。4)含量测定：采用LC-MS/MS色谱法， 将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的 面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。该方法抗干扰能 力差、准确性低，测量的结果容易受到外界不利因素的影响。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的 方法，在待测样本中加入丹磺酰氯，通过衍生改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子， 提高正离子模式下的离子化效率，并可以减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低分析物 极性，使其更加容易进入仪器真空环境，提高检测的灵敏度，抗干扰能力强。 本申请中适用于使用串联质谱法检测的儿茶酚胺类物质包括去甲肾上腺素NE、肾 上腺素E、甲氧基去甲肾上腺素NMN、甲氧基肾上腺素MN、多巴胺DA、高香草酸HVA、香草扁桃 酸VMA、甲氧酪胺3-MT。 本发明为一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺类物质的方法，包括以 下步骤： （1）测试血液样品的准备：收集待测的全血和健康的全血，用低温离心机离心，分离出 来的血浆在-80℃避光保存，得到待测血浆、健康血浆，低温离心机的离心力为1000-1200g， 离心时的温度为4℃，所述离心的时间为8-10min； （2）配制内标工作液：用乙腈稀释DHBA（二羟基苯甲酸）、MN-D3、VMA-D3母液的混合溶 液，旋涡混合30s,内标工作液的浓度为35.51~42.84nmol/L，稀释完后放入4℃，得到内标工 作液，冰箱备用； （3）取待测物质的标准母液（可以在市面上购买），用标准稀释液将标准母液稀释，稀释 为不同浓度的标准工作液，所述标准稀释液包括甲酸、乙腈，标准稀释液按重量份计包括甲 酸0.04-0.06份、乙腈87-90份，标准工作液的目的是为了找到标准曲线，利用标注曲线能够 求得待测血液的浓度；步骤（3）所述稀释为将母液稀释以后作为第一次稀释母液，再对第一 次稀释母液进行第二次稀释得到第二次稀释母液……，依次进行稀释6-12次。如可以稀释8 次，当次稀释相对于前次稀释的稀释倍数为3，所述第二次稀释是将第一次稀释母液稀释3 倍，所述第三次稀释是将第二次稀释母液稀释3倍……。 （4）取出内标工作液，放置室温5min后，涡旋混合30s，配置以下溶液，标准曲线样： AuL基底样、AuL标准工作液、BuL内标工作液；基底样液：AuL基底样、AuL标准稀释液、BuL内 标工作液；测试样：AuL待测血浆、AuL乙腈、BuL内标工作液；质控样：AuL健康血浆、AuL乙腈、 BuL内标工作液；标准曲线样是用来构建标准曲线，推算待测样品中待测物质的浓度。基底 样就是拿健康人的血浆，然后晾晒，这时的血浆里的儿茶酚胺类物质很少，这个基底样就可 以作为本底，它作用就是排除人的内源性儿茶酚胺水平，这样做更准确。质控样是用来排除 外界干扰，如果质控样做出来结果是对的，说明实验整体没问题，哪怕待测品结果不好，也 只能说明待测样品有问题。 （5）用涡旋混合器充分混合5min，然后在11000r/min4℃下离心10min，用移液枪将 4 CN 111721853 A 说 明 书 3/6 页 标准曲线样、基底样液、测试样、质控样的上清液转移到EP管中，为第一管、第二管、第三管、 第四管，进行冷冻干燥，如可以用1mL的移液枪转移0.7mL上清液到另外一个1.5mlEP管，在- 80℃预冷冻20min后，用真空冷冻干燥器冻干2h10min，剩余体积少于20uL；如果剩余体积较 多，说明真空状态有问题或者冷冻器温度没有降下来，检查完真空冷冻干燥器后，继续冷冻 直至体积少于20uL； （6）分别向第一管、第二管、第三管、第四管中加入NaOH溶液、丹磺酰氯乙腈溶液，旋涡 混合30s，避光进行衍生反应，所述丹磺酰氯乙腈溶液的浓度为3-4mg/mL，所述衍生反应的 反应温度为45-50℃，反应时间为15-20min； （7）向第一管、第二管、第三管、第四管加入反应终止剂、超纯水，旋涡混合、离心后取上 清液，放入孔板中进行液质分析，终止剂为质量分数为4-5%的甲酸溶液，所述液质分析流动 相A为含10mM乙酸铵的0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。 本发明中串联质谱法前处理采用衍生化法处理样本，在样本中加入丹磺酰氯，通 过衍生改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率，并可 以减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低分析物极性，使其更加容易进入仪器真空环境， 提高检测的灵敏度。
