技术摘要：
本发明公开了一种肠靶向的口服益生菌制剂及其制备方法和应用，所述制剂的核心是含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核，从内核往外，依次交替包裹碱性氨基酸聚合物层和海藻酸钙层，最外层是碱性氨基酸聚合物层；所述的制剂含有至少2层碱性氨基酸聚合物层。本发明微囊采用多层结  全部
背景技术：
益生菌广泛存在于人体肠道等部位，是人体肠道微生态的重要组成部分。益生菌 已被证实与人体的生理作用密切相关，除改善肠道健康、促进营养吸收外，还与糖尿病、心 血管疾病、肝病、肿瘤等疾病密切相关。因此，将益生菌精准递送到结肠等部位并定殖，从而 调节肠道内的菌群平衡，进而调节宿主黏膜与系统免疫功能，对人类健康有重要意义。 目前人们主动摄取益生菌的主要途径有介入式粪菌移植和口服益生菌制剂(粉、 片或流体)。但介入式粪菌移植需临床操作、条件要求高，且受众体验和耐受性差，无法大规 模推广。口服益生菌制剂给药方便、耐受性好、易于大规模推广，是人们摄取益生菌的发展 方向。但口服益生菌目前面临生物利用度低、难定植等缺陷。 优良的口服益生菌制剂须满足下列条件：第一，制剂须克服胃酸、胃蛋白酶以及胆 盐的生理屏障，使益生菌在到达结肠部位时仍有足够的活性且可定殖；第二，制剂须有合适 的崩解位点及较高的崩解度，确保在肠道部位靶向释放、且在排出消化道前能将益生菌全 部或者大部分放出；第三，制剂必须有较高的黏附强度及足够多的黏附位点，从而提高益生 菌在肠道的滞留率；第四，受个体因素限制较小，有利于推广；第五，制备工艺简单、快捷、温 和，适宜于大规模工艺生产；第六，所用制剂材料具有良好的生物安全性。然而，现有的口服 益生菌递送系统多只针对一个或几个方面展开优化，很难能从真正实现口服益生菌的生物 利用度。 中国发明专利ZL201310024931.0公开了一种口服pH响应性肠靶向载体及其制备 方法与应用，该载体由海藻酸钙凝胶内核和硫酸鱼精蛋白层组成。该专利虽然在一定程度 上实现了益生菌耐酸和耐胆盐活性的提高，但未能很好地解决益生菌在肠道部位的靶向释 放问题，且其益生菌存活率仍有待提高。因此，如何较为快速便捷地制备出耐胃酸和胆盐活 性高、具有肠道靶向、生物利用度高、定植效果好的口服益生菌制剂，便成为当前生物医学 工程领域亟待解决的重要课题。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种肠 靶向的口服益生菌制剂，是包裹了多层碱性氨基酸聚合物的益生菌海藻酸钙微球。 本发明的另一目的在于提供上述肠靶向的口服益生菌制剂的制备方法，首先通过 静电液滴法制备一定粒径大小海藻酸钙微囊，再先后吸附碱性氨基酸聚合物、海藻酸钠及 氯化钙，制备可负载益生菌的多层碱性氨基酸聚合物-海藻酸钙微囊。 本发明的另一目的在于提供上述的口服益生菌制剂在肠道靶向递送益生菌中的 应用。 3 CN 111714473 A 说　明　书 2/11 页 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种肠靶向的口服益生菌制剂，其核心是含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核，从内 核往外，依次交替包裹碱性氨基酸聚合物层和海藻酸钙层，最外层是碱性氨基酸聚合物层； 所述的制剂含有至少2层碱性氨基酸聚合物层。 优选地，所述的碱性氨基酸聚合物为2层。 所述的益生菌可以是乳酸链球菌、植物乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳 杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种中的一种以上； 所述的碱性氨基酸聚合物是等电点条件下pH值大于7且主要组分为赖氨酸及精氨 酸的蛋白质或多肽； 所述的碱性氨基酸聚合物优选鲑精蛋白、鲱精蛋白、鲟精蛋白、溶菌酶、聚赖氨酸、 聚精氨酸或大豆碱性多肽中的一种以上； 所述的肠靶向尤其是指结肠靶向。 上述口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤： (1)将益生菌用海藻酸钠溶液重悬，然后滴加到钙离子溶液中，固化反应生成含有 益生菌的海藻酸钙凝胶内核； (2)步骤(1)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后加入到碱性 氨基酸聚合物溶液中，振荡反应，在海藻酸钙凝胶内核包裹上一层碱性氨基酸聚合物； (3)步骤(2)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后重复步骤(1) 和(2)的操作至少一次，制得至少包裹两层碱性氨基酸聚合物的口服益生菌制剂； 步骤(1)中，所述海藻酸钠的分子量为1～20万，所述海藻酸钠溶液的浓度(W/V)为 0.5-2.5％； 步骤(1)所述的滴加优选采用注射泵操作，注射泵流速为8-12mL/h； 步骤(1)所述的钙离子溶液是钙离子的可溶性盐溶液，可以是氯化钙溶液、硝酸钙 溶液，等等；其中钙离子的浓度优选0.1-1M； 步骤(1)所述固化反应的时间优选40-60min； 步骤(2)所述碱性氨基酸聚合物溶液的浓度为2-5mg/mL； 步骤(2)所述的振荡反应，转速为80-150rpm，反应时间为10-20min。 上述的口服益生菌制剂可以应用在肠道靶向递送益生菌中。 本发明的原理是：本专利采用多层结构益生菌微囊，由于结构更加致密，能可以更 好地隔绝胃酸、蛋白酶及胆盐对益生菌的侵蚀，确保高活性的益生菌通过人体消化道屏障； 多层微囊进入肠道之后，因为胰蛋白酶能够特异性结合并与外层的碱性氨基酸聚合物层反 应，使得碱性氨基酸聚合物层降解，同时消耗内层海藻酸钙中的钙离子，使其快速脱落。 当碱性氨基酸聚合物和海藻酸钙在微囊表面交替形成多层结构时，胰蛋白酶会优 先与外层的碱性氨基酸聚合物及海藻酸钙反应，延缓与海藻酸钙母体(即含有益生菌的海 藻酸钙凝胶内核)作用的时间，导致其会在小肠的末端才开始崩解。 同时，由于酶的亲和性，会有越来越多的胰蛋白酶分子结合并参与海藻酸钙母体 的崩解反应，使得母体崩解强度更加剧烈，能在短时间内崩解完全，崩解时间的延迟与崩解 强度的提高，说明该多层微囊能将益生菌高效地递送至远端消化道，释放位点明确，有良好 的结肠靶向效应；当多层微囊崩解后，具有黏性的微囊材料会帮助益生菌黏附在肠道上，由 4 CN 111714473 A 说　明　书 3/11 页 于益生菌已完全放出，在肠道的黏附位点足够多，益生菌滞留率进一步提高；胰蛋白酶是消 化液是重要组分之一，本发明多层微囊仅仅依赖胰蛋白酶的触发作用，具有一定普适性。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 1、本发明微囊采用多层结构，相较于单层微囊，包覆效果更致密，能很好包埋微生 物；抗酸性更好，能抵抗胃酸、胆盐的侵袭，显著提高细菌存活率。 2、本发明的多层微囊以碱性氨基酸聚合物为外层包裹层，不会抑制微囊崩解，反 而能使微生物快速精准高效地在小肠末端释放，靶向性优良。 3、本发明多层微囊能在短时间内从固态崩解成为液态，在结肠处的黏附位点足够 多，结肠的滞留率显著提高。 4、相较于其他益生菌口服递送系统，本发明多层微囊仅仅依赖消化道内胰蛋白酶 的作用，受个体因素影响较小，有利于推广。 5、本发明采用静电液滴法，制备工艺简单快捷温和，无活性损失，微囊粒径均一， 适合工业化生产。 6、本发明的多层微囊使用的原料(海藻酸钠、碱性氨基酸聚合物、氯化钙)具有良 好的生物安全性及生物相容性，在食品加工领域已广泛使用，生物安全性有保障。 附图说明 图1是实施例3中多层微囊先后在人工胃液及人工小肠液中崩解度的崩解曲线；其 中的小图为AP0.5； 图2是实施例1中Balb/c小鼠用多层微囊灌胃24h后消化道解剖荧光成像图； 其中，plain代表未包埋，AP0.5代表海藻酸钙微囊，AP1.0、AP2.0及AP3.0分别代表包裹 1、2、3层碱性氨基酸聚合物的海藻酸钙微囊。