技术摘要：
本发明涉及一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用，属于分子探针技术领域。本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行PCR，避免了非特  全部
背景技术：
癌症也叫恶性肿瘤，具有增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特 征。它可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官 功能衰竭而死亡。目前，肺癌仍然是最具威胁生命的疾病，由于其发病率和死亡率的居高不 下，在世界范围内越来越普遍。根据国家癌症中心发布的统计数据，2015年我国新发肺癌患 者例数为78.7万，约占癌症新患病例的20％。更糟糕的是，未来几十年，肺癌新增病例数量 预计将翻一番，这会给国家社保系统、医疗系统和家庭生活带来重大负担。 虽然近几十年来在诊治方面做了很多努力，但肺癌的预后仍然很差，肺癌在5年内 生存率低于15％。这主要是由于肺癌诊断时间常在晚期，治疗性手术不再作为选择。因为肺 癌在初期的发展非常隐蔽，主要表现为：呼吸短促、咳嗽和体重下降等症状，常常也属于着 肺炎症状，故肺癌确诊是一个难点。传统的肺癌的早期检测技术包括胸部X线摄影、低剂量 计算机断层扫描(LDCT)和肺活检。然而，这些技术在肺癌的早期检测中存在一些局限性，包 括高假阳性率、侵袭性、潜在的过度诊断、过高的成本或辐射诱发的癌症。另一方面，标准免 疫测定法(如ELISA、RIA、IF等)已成为检测LC生物标志物的成熟技术，但耗时、成本高，只能 在集中的实验室中进行。此外，这些免疫测定法大多为单重测定法，对检测疾病早期低浓度 的生物标志物不够敏感。所以需要开发一种灵敏度高的早期肺癌检测技术。 近年来，许多科学家提出了通过标志物来诊断肺癌，其中对miRNA的研究较多。 miRNA是一种非编码RNA，一般是18-25个碱基长度。研究表明，人类约30％的基因受到miRNA 的调控，miRNA的表达水平与人类多种疾病的发生密切相关。传统定量检测miRNA的方法主 要包括Northern  blotting、原位杂交、微阵列法、滚环扩增和反转录聚合酶链反应等。这些 方法大体可以归为无需样本扩增的探针直接杂交法和基于样本miRNAs扩增的检测方法。它 们各有优缺点：不经过扩增的方法操作简便，但对样本量需求较大，且灵敏度较低；而基于 扩增的方法灵敏度较高，但其受限于无法直接检测miRNAs水平和非特异性扩增。其原因在 于miRNAs的序列很短，这些扩增手段及相应的探针设计都需要非常精细和复杂的设计。传 统PCR技术大都通过检查其前体而进行间接判断， 因此，现有的诊断方法并不能反映真实的miRNAs水平，并且，miRNAs在体液中的表 达量远低于其在组织中的表达，因此常规检测组织中miRNAs的技术并不一定适用于体液 miRNAs的检测，需要讲究新的能够增强检测信号的探针以及方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的 3 CN 111549100 A 说　明　书 2/5 页 构建方法；本发明的目的之二在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针；本发明的 目的之三在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针在检测miRNA方面的应用。 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 1.一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，所述构建方法包括如下步 骤： (1)制备DNA探针：根据待测的miRNA分子序列合成与所述miRNA分子配对的DNA探 针，所述DNA探针的一端修饰荧光基团，另一端修饰生物素； (2)偶联培育：将所述DNA探针预热后与链霉亲和素磁珠(SMBs)悬浊液混合，在30- 40℃条件下培育； (3)清洗：首先将培育后的混合物用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的DNA 探针，然后用TT缓冲液重复清洗，再次将DNA探针加入到TT缓冲液中进行重悬后在80℃下培 育，除去液体以去除结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到一种检测miRNA分 子的磁性微球DNA探针。 优选的，步骤(1)中，所述miRNA分子包括肿瘤疾病或病毒传染性疾病的疾病标志 物miRNA。 优选的，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备： 将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠(SMBs)，在室温 条件下，用IBM缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到固 定清洗缓冲液(B&W  buffer)中即可。 优选的，步骤(2)中，所述DNA探针与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol  DNA与40μg  MBs链霉亲和素磁珠混合的比例进行。 优选的，步骤(2)中，所述预热为在70～85℃下预热5～30min；所述培育时间为 10min以上。 优选的，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配 制：向pH＝8.0的250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的 20混合而成。 2.由上述构建方法构建得到的磁性微球DNA探针。 3.上述磁性微球DNA探针在检测miRNA分子方面的应用。 优选的，所述miRNA分子为肺癌标志物miRNA时，按照如下方法进行检测：首先向所 述磁性微球DNA探针中加入所述miRNA、DSN和RNase抑制剂，在热循环仪中反应；然后用磁铁 固定磁珠后提取上层清液，测试上清液的荧光强度，从荧光强度得到所述miRNA的浓度。 本发明的有益效果在于： 1、本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，该方法简 单，容易操作，通过该方法能够将两端分别修饰有荧光基团和生物素的DNA探针固定在顺磁 性的微球上，使其中的生物素与链霉亲和素更好地偶联形成磁性微球DNA探针，能够针对性 检测miRNA分子； 2、本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始 miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行 PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。与传统的分离方法相比，把磁珠用于 生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富 4 CN 111549100 A 说　明　书 3/5 页 集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。 本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并 且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可 以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和 获得。 附图说明 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优 选的详细描述，其中： 图1为待检测miRNA与磁性微球DNA探针杂化成双联、以及DSN酶切反应释放荧光基 团的过程； 图2为本发明构建的磁性微球DNA探针对待检测miRNA检测流程； 图3为实施例1中四种不同结构的探针对肺癌标志物miRNA-21的荧光测试结果； 图4为实施例1中制备的含有P1的磁性微球DNA探针对不同待测分子的荧光检测结 果。