技术摘要：
本发明提供了一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法，属于植物生物技术领域。本发明的检测引物包含一条正向引物SEQ ID NO.1和两条反向引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。利用本发明的引物，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可区分转 全部
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。雄性不育是指 雄性生殖器官无法产生正常花粉，而雌性生殖器官发育正常，能接受正常花粉而受精结实 的现象。水稻是自花授粉作物，利用雄性不育迫使水稻接受外来花粉，既可以利用杂种优势 提高水稻的产量、品质和抗性，又可以实现大规模杂交种制备，在杂交水稻产业中具有十分 重要的意义。海南波莲水稻基因科技有限公司于2013 年用钴60对籼稻材料9311进行辐射， 筛选获得一份隐性核雄性不育材料，命名为1907。该突变性状由CYP704B2基因在基因编码 区第794 个碱基后的GGG被替换为T导致(龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311 辐射诱变突 变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)： 44-52)。 利用隐性核雄性不育系进行水稻杂交育制种被袁隆平院士誉为第三代杂交水稻 技术，能够克服目前生产上广泛应用的三系和两系杂交水稻种质资源利用率低和制种风险 高的缺陷(袁隆平.杂交水稻发展的战略.杂交水稻,2018,33(5):1–2.)。其基本原理是将紧 密连锁的育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因导入隐性核雄性不育突变体中获得 该不育突变体的保持系，再利用保持系生产不育系用于杂交种生产(邓兴旺,王海洋,唐晓 艳等.杂交水稻育种将迎来新时代.中国科学:生命科学,2013 ,43:864–868 .)。在将上述 1907突变体及相应的CYP704B2突变基因用于第三代杂交水稻技术的研发过程中，如何有效 区分转基因植株及其自交、杂交、回交后代中外源 CYP704B2转基因(即育性恢复基因)、内 源野生型CYP704B2基因和内源突变型CYP704B2基因成为一个需要克服的问题。 转基因检测大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类 (Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6):1991-2002)。其中，基于核酸水平的检测具有检测方便、体系成熟、可检测范 围广及通量高等特点，因此使用较为广泛(Elenis D ,Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347-54)。基于核酸水平的检测方法按 具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR 检测技术；2、荧光定量PCR检测技术；3、多 重PCR检测技术；4、核酸杂交检测技术；5、基因芯片检测技术等。 为了解决在转基因植株及其自交、杂交、回交后代中有效区分外源CYP704B2转基 因、内源野生型和突变型CYP704B2基因及其组合的问题，本发明通过在外源CYP704B2转基 因中引入SNP，并结合1907 中CYP704B2基因的突变位点，设计引物，通过传统定性PCR即实 现了对转基因材料及其后代中内、外源基因的基因分型。本鉴定方法操作简便，成本低廉， 通量可控，特别适合小、微企业的研究和生产需要。 3 CN 111593135 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种鉴别转基因 水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2 基因的分子标记和引物组合。 本发明的第二个目的是提供利用上述标记和引物组合区分转基因水稻及其自交、 杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因并鉴定植株基因型的方法及其应用。 本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂 交、回交后代的花粉育性。 本发明提供的一种鉴别转基因水稻中内、外源CYP704B2基因的分子标记，其通过 核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。 本发明提供了上述分子标记在鉴定转基因水稻中内、外源 CYP704B2基因型中的 应用。 本发明提供了利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代 的花粉育性的应用。 本发明提供了前述分子标记、引物组合或试剂盒在作物育种或种质资源改良中的 应用。 所述的作物包括但不限于水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。 本发明提供的一种用于检测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源 CYP704B2基因型的引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。 含有所述引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。 本发明的SEQ ID NO.1所示的正向引物GY-1F： GTCGGGTTTGGGGTTGAGATC，SEQ ID NO.2所示的反向引物 HF-1R:CGACGTGCAAGAACTTCCTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物NY- 1R:GTAACGATGATGTTGGCAGCGTAGTAT。 本发明上述引物组合是针对野生型CYP704B2基因(其序列信息记载于文献中，龙 湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016， 30(1)：44-52)的编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变，以及基因编码区第839位与外 源CYP704B2转基因(即育性恢复基因)的SNP多态性(A/C)、第896位与外源基因的SNP多态性 (G/C)设计、筛选后获得。外源 CYP704B2转基因中的两个C的SNP为人为引入，是同义突变， 其中第 839位的突变产生了一个Stu I/Hae III切点，第896位的突变删除了一个 Xmn I的 切点。由于野生型品种中含有该转基因对应的内源基因，本申请在不改变所编码的氨基酸 序列的条件下，做这样SNP的引入进行基因修饰，是为了区分植物基因组本身的内源基因与 导入的外源基因。本发明引入SNP的位置确保在引起功能变化的序列差异位点(即 1907突 变位点)的200bp范围内，便于设计引物和控制PCR产物大小。 引物HF-1R只能与修饰过密码子的外源CYP704B2转基因配对，引物NY-1R可以与野 生型和突变型内源基因配对。此外，HF-1R的3’端第三个碱基引入T→C的突变。NY-1R的3’端 第三个碱基引入A→T 的突变和第五个碱基引入C→A的突变，5’端第三个碱基引入G→A的 突变，以便于提高HF-1R和NY-1R对目标序列的相对识别能力。GY-1F 为公共正向引物，位于 第794位碱基后GGG被替换为T的突变前21个碱基，同HF-1R配对只能以外源基因为模板扩增 出142bp的PCR产物。 GY-1F同NY-1R配对可分别以突变型和野生型内源基因为模板扩增出 90bp和92bp的PCR产物。 4 CN 111593135 A 说 明 书 3/6 页 进一步地，本发明提供了一种检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外 源CYP704B2基因及基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1所 示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小 进行分析，根据电泳条带确定待测样品的基因型。 若扩增产物只出现90bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合突变基因型 cyp704b2；若只出现92bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合野生基因型 CYP704B2；若出现90bp和92bp两条带，则表明待测样品为不含外源基因的杂合基因型。若出 现90bp和142bp 两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2；若出 现92bp和142bp的两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2；若出 现90bp、92bp和142bp的三条带，则表明待测样品为含外源基因的杂合基因型。 90bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，92bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所 示，142bp条带的参考序列如SEQ ID NO.6所示。 本发明的实施例中采用的转基因材料为转基因水稻。本领域技术人员应当理解， 由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中 扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但 这种差异通常不会影响标记的使用。 进一步地，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench TopTM Taq master mix 6μL，10 μM的一个正向、两个反向引物各0.3μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL； PCR反应条件为：94℃，3min；94℃、20s，61℃、25s，72℃、 35s，共35个循环；接着72 ℃、5min，最后20℃，1min。 在本发明的实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电 泳条件为：10％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA， P＝85W，电泳2h。 本发明还提供了利用上述标记预测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代花粉育 性的方法。采用前述的检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因 及基因型的方法鉴定转基因植株中CYP704B2基因的基因型，凡带有外源CYP704B2基因和/ 或内源野生型CYP704B2基因的转基因植株花粉可育，凡只带有内源突变型CYP704B2基因的 转基因植株花粉不育。即采用本发明提供的SEQ ID NO.1-3所述的引物在同一个PCR反应体 系中扩增待测样本，若扩增产物只出现90bp条带，则表明对应植物花粉不育；若扩增带型中 出现92bp或142bp条带，则表明对应植株花粉可育。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计并开发了一种扩增片段 短、特异性强的三引物分子标记。利用该标记只需通过简单的一次PCR反应和PAGE凝胶电 泳，不但可用于转基因材料及其后代的内、外源CYP704B2基因型鉴定，还可用于育种过程中 将上述转基因材料中的内、外源CYP704B2基因转育至其它水稻种质中，并可用于各种水稻 种质中相应内、外源基因的追踪、剔除。此鉴定方式操作简便，同时通量可控；实验结果准 确、直观；所需实验设备和引物合成成本低廉。 附图说明 图1是本发明分子标记的引物设计示意图。GY-1F是正向引物，可以分别与 CYP704B2的1907突变基因、野生型基因和外源转基因匹配。HF-1R是反向引物，只能与外源 5 CN 111593135 A 说 明 书 4/6 页 CYP704B2转基因匹配。NY-1R 也是反向引物，能与突变基因和野生型基因匹配。箭头所指为 各引物中引入的错配碱基。GGG突变位点和内、外源转基因的SNP位点用方框标出。 图2是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的基因型 鉴定PAGE胶电泳图。泳道1为1907纯合突变株，泳道 2-6为T1代分离群体。PCR产物大小标记 在胶图右侧。 图3是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的花粉育 性鉴定图。 图4是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T0 代植株与C815S杂 交产生的F2群体的基因型鉴定PAGE胶电泳图。泳道1-3分别为1907纯合株、1907杂合株和中 花11，4-9泳道为F2单株。 PCR产物大小标记在胶图右侧。 图5是图4中4-9泳道对应的F2植株的育性鉴定图。A是中花11野生型植株的花粉碘 染结果。B-G分别依次对应于图4中4-9泳道植株的花粉碘染结果。
本发明提供了一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法，属于植物生物技术领域。本发明的检测引物包含一条正向引物SEQ ID NO.1和两条反向引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。利用本发明的引物，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可区分转 全部
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。雄性不育是指 雄性生殖器官无法产生正常花粉，而雌性生殖器官发育正常，能接受正常花粉而受精结实 的现象。水稻是自花授粉作物，利用雄性不育迫使水稻接受外来花粉，既可以利用杂种优势 提高水稻的产量、品质和抗性，又可以实现大规模杂交种制备，在杂交水稻产业中具有十分 重要的意义。海南波莲水稻基因科技有限公司于2013 年用钴60对籼稻材料9311进行辐射， 筛选获得一份隐性核雄性不育材料，命名为1907。该突变性状由CYP704B2基因在基因编码 区第794 个碱基后的GGG被替换为T导致(龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311 辐射诱变突 变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)： 44-52)。 利用隐性核雄性不育系进行水稻杂交育制种被袁隆平院士誉为第三代杂交水稻 技术，能够克服目前生产上广泛应用的三系和两系杂交水稻种质资源利用率低和制种风险 高的缺陷(袁隆平.杂交水稻发展的战略.杂交水稻,2018,33(5):1–2.)。其基本原理是将紧 密连锁的育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因导入隐性核雄性不育突变体中获得 该不育突变体的保持系，再利用保持系生产不育系用于杂交种生产(邓兴旺,王海洋,唐晓 艳等.杂交水稻育种将迎来新时代.中国科学:生命科学,2013 ,43:864–868 .)。在将上述 1907突变体及相应的CYP704B2突变基因用于第三代杂交水稻技术的研发过程中，如何有效 区分转基因植株及其自交、杂交、回交后代中外源 CYP704B2转基因(即育性恢复基因)、内 源野生型CYP704B2基因和内源突变型CYP704B2基因成为一个需要克服的问题。 转基因检测大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类 (Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6):1991-2002)。其中，基于核酸水平的检测具有检测方便、体系成熟、可检测范 围广及通量高等特点，因此使用较为广泛(Elenis D ,Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347-54)。基于核酸水平的检测方法按 具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR 检测技术；2、荧光定量PCR检测技术；3、多 重PCR检测技术；4、核酸杂交检测技术；5、基因芯片检测技术等。 为了解决在转基因植株及其自交、杂交、回交后代中有效区分外源CYP704B2转基 因、内源野生型和突变型CYP704B2基因及其组合的问题，本发明通过在外源CYP704B2转基 因中引入SNP，并结合1907 中CYP704B2基因的突变位点，设计引物，通过传统定性PCR即实 现了对转基因材料及其后代中内、外源基因的基因分型。本鉴定方法操作简便，成本低廉， 通量可控，特别适合小、微企业的研究和生产需要。 3 CN 111593135 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种鉴别转基因 水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2 基因的分子标记和引物组合。 本发明的第二个目的是提供利用上述标记和引物组合区分转基因水稻及其自交、 杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因并鉴定植株基因型的方法及其应用。 本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂 交、回交后代的花粉育性。 本发明提供的一种鉴别转基因水稻中内、外源CYP704B2基因的分子标记，其通过 核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。 本发明提供了上述分子标记在鉴定转基因水稻中内、外源 CYP704B2基因型中的 应用。 本发明提供了利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代 的花粉育性的应用。 本发明提供了前述分子标记、引物组合或试剂盒在作物育种或种质资源改良中的 应用。 所述的作物包括但不限于水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。 本发明提供的一种用于检测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源 CYP704B2基因型的引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。 含有所述引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。 本发明的SEQ ID NO.1所示的正向引物GY-1F： GTCGGGTTTGGGGTTGAGATC，SEQ ID NO.2所示的反向引物 HF-1R:CGACGTGCAAGAACTTCCTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物NY- 1R:GTAACGATGATGTTGGCAGCGTAGTAT。 本发明上述引物组合是针对野生型CYP704B2基因(其序列信息记载于文献中，龙 湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016， 30(1)：44-52)的编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变，以及基因编码区第839位与外 源CYP704B2转基因(即育性恢复基因)的SNP多态性(A/C)、第896位与外源基因的SNP多态性 (G/C)设计、筛选后获得。外源 CYP704B2转基因中的两个C的SNP为人为引入，是同义突变， 其中第 839位的突变产生了一个Stu I/Hae III切点，第896位的突变删除了一个 Xmn I的 切点。由于野生型品种中含有该转基因对应的内源基因，本申请在不改变所编码的氨基酸 序列的条件下，做这样SNP的引入进行基因修饰，是为了区分植物基因组本身的内源基因与 导入的外源基因。本发明引入SNP的位置确保在引起功能变化的序列差异位点(即 1907突 变位点)的200bp范围内，便于设计引物和控制PCR产物大小。 引物HF-1R只能与修饰过密码子的外源CYP704B2转基因配对，引物NY-1R可以与野 生型和突变型内源基因配对。此外，HF-1R的3’端第三个碱基引入T→C的突变。NY-1R的3’端 第三个碱基引入A→T 的突变和第五个碱基引入C→A的突变，5’端第三个碱基引入G→A的 突变，以便于提高HF-1R和NY-1R对目标序列的相对识别能力。GY-1F 为公共正向引物，位于 第794位碱基后GGG被替换为T的突变前21个碱基，同HF-1R配对只能以外源基因为模板扩增 出142bp的PCR产物。 GY-1F同NY-1R配对可分别以突变型和野生型内源基因为模板扩增出 90bp和92bp的PCR产物。 4 CN 111593135 A 说 明 书 3/6 页 进一步地，本发明提供了一种检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外 源CYP704B2基因及基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1所 示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小 进行分析，根据电泳条带确定待测样品的基因型。 若扩增产物只出现90bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合突变基因型 cyp704b2；若只出现92bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合野生基因型 CYP704B2；若出现90bp和92bp两条带，则表明待测样品为不含外源基因的杂合基因型。若出 现90bp和142bp 两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2；若出 现92bp和142bp的两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2；若出 现90bp、92bp和142bp的三条带，则表明待测样品为含外源基因的杂合基因型。 90bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，92bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所 示，142bp条带的参考序列如SEQ ID NO.6所示。 本发明的实施例中采用的转基因材料为转基因水稻。本领域技术人员应当理解， 由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中 扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但 这种差异通常不会影响标记的使用。 进一步地，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench TopTM Taq master mix 6μL，10 μM的一个正向、两个反向引物各0.3μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL； PCR反应条件为：94℃，3min；94℃、20s，61℃、25s，72℃、 35s，共35个循环；接着72 ℃、5min，最后20℃，1min。 在本发明的实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电 泳条件为：10％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA， P＝85W，电泳2h。 本发明还提供了利用上述标记预测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代花粉育 性的方法。采用前述的检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因 及基因型的方法鉴定转基因植株中CYP704B2基因的基因型，凡带有外源CYP704B2基因和/ 或内源野生型CYP704B2基因的转基因植株花粉可育，凡只带有内源突变型CYP704B2基因的 转基因植株花粉不育。即采用本发明提供的SEQ ID NO.1-3所述的引物在同一个PCR反应体 系中扩增待测样本，若扩增产物只出现90bp条带，则表明对应植物花粉不育；若扩增带型中 出现92bp或142bp条带，则表明对应植株花粉可育。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计并开发了一种扩增片段 短、特异性强的三引物分子标记。利用该标记只需通过简单的一次PCR反应和PAGE凝胶电 泳，不但可用于转基因材料及其后代的内、外源CYP704B2基因型鉴定，还可用于育种过程中 将上述转基因材料中的内、外源CYP704B2基因转育至其它水稻种质中，并可用于各种水稻 种质中相应内、外源基因的追踪、剔除。此鉴定方式操作简便，同时通量可控；实验结果准 确、直观；所需实验设备和引物合成成本低廉。 附图说明 图1是本发明分子标记的引物设计示意图。GY-1F是正向引物，可以分别与 CYP704B2的1907突变基因、野生型基因和外源转基因匹配。HF-1R是反向引物，只能与外源 5 CN 111593135 A 说 明 书 4/6 页 CYP704B2转基因匹配。NY-1R 也是反向引物，能与突变基因和野生型基因匹配。箭头所指为 各引物中引入的错配碱基。GGG突变位点和内、外源转基因的SNP位点用方框标出。 图2是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的基因型 鉴定PAGE胶电泳图。泳道1为1907纯合突变株，泳道 2-6为T1代分离群体。PCR产物大小标记 在胶图右侧。 图3是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的花粉育 性鉴定图。 图4是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T0 代植株与C815S杂 交产生的F2群体的基因型鉴定PAGE胶电泳图。泳道1-3分别为1907纯合株、1907杂合株和中 花11，4-9泳道为F2单株。 PCR产物大小标记在胶图右侧。 图5是图4中4-9泳道对应的F2植株的育性鉴定图。A是中花11野生型植株的花粉碘 染结果。B-G分别依次对应于图4中4-9泳道植株的花粉碘染结果。
