技术摘要：
一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，属于酶工程技术领域。本发明将相同酶活的葡聚糖酶AnEglA6和BglA等体积混合，得到复配型酶液；取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合，58‑62℃保温25‑35min，冰水浴冷却；加入第二种10×处理液BG02，在58‑62℃保温25‑35min，冰水浴冷  全部
背景技术：
葡聚糖酶主要用于降解生物质原料中的葡聚糖大分子。葡聚糖是一种广泛存在于 植物种子中的大分子物质，具有很高的粘度。以淀粉质原料进行的发酵工业中，由于原料中 含有一定量的葡聚糖，因此发酵液中添加葡聚糖酶可以有效降低发酵液的粘度，提高搅拌 效率，减少搅拌能耗。在酒精发酵工业中，很多酶制剂，如糖化酶、葡聚糖酶等，在使用时一 般是直接添加在发酵液中，在发酵过程中逐步水解发酵液中的大分子。微生物的发酵过程 很复杂，往往伴随pH的变化，同时酒精发酵倾向于根据市场和工厂所处环境的具体情况选 用尽可能廉价的原料，由此配制的发酵液的pH等特性往往有很大的变化，因此具有宽泛pH 适应范围的酶制剂在应用上可以获得更稳定的效果。 本发明在前期工作中获得了两种葡聚糖酶，AnEglA6和BglA，前者是一种适应低pH 环境的葡聚糖酶，其最适pH在4左右[韩冰,  王施兰,  德青美朵,  沈微, 陈献忠,  樊游.  一 种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析.  食品与发酵工业,  2018,  44(11):  55-62.]，而后者的最适pH在6.5左右[陈玉娟,  沈微,  陈献忠,  王正祥.  解淀粉芽孢杆菌 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达.  生物技术,  2011,  21(2):  22-26]。本 发明将两种葡聚糖酶混合获得一种新的复配型葡聚糖酶，其酶活在pH4~6.5的范围内基本 稳定。葡聚糖酶AnEglA6和BglA本身在4℃条件下基本稳定，但这两种酶混合后获得的新型 复配型葡聚糖酶却很不稳定，两种酶在混合后大约1小时内酶活基本稳定，随后开始迅速下 降，大约4℃下，12小时后剩余酶活不到混合时的20%，因此，这种复配酶难以存储，显然不具 有应用的可能性。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，针 对上述葡聚糖酶混合液进行处理，所得的葡聚糖酶混合液的稳定性明显提高。 本发明的技术方案，一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，将相同酶活的葡聚糖酶 AnEglA6和BglA等体积混合，得到复配型酶液；取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合， 58-62℃保温25-35min，冰水浴冷却；加入第二种10×处理液BG02，在58-62℃保温25- 35min，冰水浴冷却；继续加入10×处理液BG03，充分混合，即得到高稳定性葡聚糖酶SL04。 所述10×处理液BG01，具体为：10mM柠檬酸-柠檬酸钠，10mM  KCl，1mmol/L  MnSO4， 2mmol/L  CuSO4，5g/L  凝结多糖，2U菠萝蛋白酶的水溶液，pH为4.1-4.3。 所述10×处理液BG02，具体为：30mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，10mM  EDTA .Na2， 0.05%  SDS，20%酒精，pH为8.0±0.1。 所述10×处理液BG03，具体为：含有50mM柠檬酸-柠檬酸钠，30%酒精，pH为5.5± 0.1。 3 CN 111549017 A 说　明　书 2/4 页 所述葡聚糖酶AnEglA6和BglA。 所述葡聚糖酶AnEglA6的制备方法同文献[韩冰,  王施兰,  德青美朵,  沈微, 陈 献忠,  樊游.  一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析.  食品与 发酵工业,  2018 ,  44(11):  55-62 .]。是采用该文献报道的巴斯德毕赤酵母Pichia  pastoris  GS115/pPIC9K-eglA6b发酵获得的。在该论文发表时该菌株已经保藏在中国高校 工业微生物资源信息平台，编号为：CICIM  Y1489。所述AnEglA6的酶液是用该菌株摇瓶发酵 获得的粗酶液，发酵方法同上述文献，发酵水平大约在2500U/mL，结果与上述文献报道基本 一致。 所述葡聚糖酶BglA的制备方法同文献[陈玉娟,  沈微, 陈献忠,  王正祥.  解淀粉 芽孢杆菌 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达.  生物技术,  2011,  21(2):  22-26]。是采用该 文献报道的重组菌Bacillus  amyloliquefaciens  (pUB-PQ-GM-bglA)发酵制备，发酵方法 与该文献一致，发酵液酶活大约在1000U/mL，发酵单位比上述文献报道的1500U/mL低，这主 要源于检测底物的不同，上述文献采用地衣多糖为底物，而本发明以大麦葡聚糖为底物，以 大麦葡聚糖为底物检测得到的酶活单位一般较低。对此，文献[韩冰,  王施兰,  德青美朵,  沈微,  陈献忠,  樊游.  一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分 析 .  食品与发酵工业 ,  2018 ,  44 (11) :  55-62 .]进行了论述。重组菌Bacillus  amyloliquefaciens  (pUB-PQ-GM-bglA)由该文献作者保藏在江南大学生物工程学院，本发 明使用该菌株时将该菌株在中国高校工业微生物资源信息平台进行了重新保藏，保藏编号 为：CICIM  B6930。在保藏上述菌株时由于中国高校工业微生物资源信息平台工作人员认为 该菌株的名称不符合现在的基因工程菌株的命名规则，根据该中心的建议，其名称更改为： Bacillus  amyloliquefaciens  7658/pUB-PQ-GM-bglA。 葡聚糖酶酶活的测定：按文献[韩冰,  王施兰,  德青美朵,  沈微, 陈献忠,  樊游.  一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析.  食品与发酵工业,  2018,  44(11):  55-62.]进行，其中文献中1.4.3中的用于检测的底物为：1%底物（用0.05  mol/L柠檬酸-0.1  mol/L  Na2HPO4缓冲液配制，pH4.0），更改为：1%底物（用0.05  mol/L柠檬 酸-0.1  mol/L  Na2HPO4缓冲液配制，pH5.5），检测温度为60  ℃。所述底物均为大麦葡聚糖。 复配型葡聚糖酶在不同pH条件下的酶活检测方法如下：分别配制pH  3.5～7.0的 0.05  mol/L柠檬酸-0.1mol/L  Na2HPO4缓冲液，将底物大麦葡聚糖按1%的浓度溶解在上述缓 冲液中，在55℃下，测定酶在上述不同pH缓冲液中的酶活力，以最高酶活性为100%，计算不 同pH条件下相对活性。 不同pH的0.05mol/L柠檬酸-0.1mol/L  Na2HPO4缓冲液配制方法：按照文献[诸葛健  王正祥.  工业微生物实验技术手册.  北京:  中国轻工业出版社,  1994.  P682-683]进行， 文献提供的是0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L  Na2HPO4缓冲液配制方法，因此实际使用时是采用 去离子水稀释到1/2的溶液，如果pH出现偏离则用NaOH或  HCl调整pH。 本发明的有益效果：采用本发明方法获得的葡聚糖酶SL04在pH4~6.5范围内活性 稳定在60%以上，在4℃环境存储7天酶活下降幅度在40%以内。本发明获得的高稳定性葡聚 糖酶在酒精发酵等领域有应用前景。 4 CN 111549017 A 说　明　书 3/4 页 附图说明 图1是SL01在不同pH下的酶活变化。 图2是SL04在不同pH下的酶活变化。 图3是复配型葡聚糖酶不同方式处理后的储存稳定性。 图4是高稳定性葡聚糖酶SL04的保存稳定性。