技术摘要：
本发明提供了一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶、制备方法和应用，以携二硫键的双烯烃分子交联透明质酸制备出尺寸可控的纳米凝胶，进一步在该凝胶内原位还原贵金属离子产生荧光纳米团簇，赋予了透明质酸纳米凝胶由可见至近红外范围的荧光。本发明的透明质酸荧光纳米凝胶  全部
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic  Acid,HA)，是一种广泛分布于动物和人体细胞外基质中的 天然线性粘多糖。独特的分子结构及理化性质令HA在机体内显示出多种重要的生理功能， 如调节蛋白质与电解质扩散及运转，组织和稳定细胞外基质，调节细胞的粘附性，并介导细 胞增殖与分化。因此，生物医药及日化等多个领域均可见到透明质酸及其衍生物的使用。HA 携带有丰富的官能团可用于物理化学修饰，且多种癌细胞的表面被证实存在HA受体(CD44 和RHAMM)过度表达，使得以透明质酸构筑抗肿瘤靶向药物递送系统成为一个有价值的课 题。 因分子结构明确、电荷定量、拥有离散的电子跃迁及生物低毒性，贵金属(金和银 等)的荧光纳米簇(Nanoclusters)作为功能材料的研究备受青睐。由十数个至上百个原子 聚集形成的贵金属纳米簇，粒径小于2纳米，实现了单原子与纳米粒子特性间鸿沟的跨越。 相比于其它形式纳米颗粒具有表面等离子共振激起的光散射及吸收，接近电子费米波长尺 寸的金属簇表现出由可见至近红外波段的良好的荧光发射特性(400-900nm)。近红外荧光 拥有较强的组织穿透性，且可明显区别于组织自发荧光，贵金属纳米簇因而被作为生物探 针用于体内外成像。相比于传统荧光染料，纳米簇具有荧光波长可调性、显著的光稳定性、 Stoke位移大及多指数荧光寿命等优势；而与无机的荧光量子点相比，这类纳米簇的低生物 毒性与快速肾清除能力又更胜一筹。另外，基于提升荧光效率同时提供生理环境中胶体稳 定性的需求，贵金属纳米簇在制备时即设计以各种活性大分子(BSA、DNA蛋白质、多糖等)进 行表面修饰或者包裹。因此，所制得的各种纳米级荧光颗粒或凝胶具有进一步化学修饰潜 能，奠定了探针类新产品开发的基础。 近年来，研究表明：纳米载体能够控制药物抵达病灶部位并快速释放药物从而提 高抗肿瘤效果，降低化疗药物毒副作用的同时压制了癌细胞耐药概率。通过理化交联亲水 性或两亲性聚合物形成具有空间网状结构的纳米凝胶，因高含水量、大比表面及高生物相 容性等特性而成为常见的药物载体。通常，肿瘤组织内的生理微环境与正常组织相比有显 著的差异，诸如pH值更低、乏氧、还原性谷胱甘肽浓度超高等。鉴于此，科技工作者巧妙设计 并构造出大量刺激响应性或多重响应的纳米凝胶，用作抗肿瘤药物的递送载体。因此，响应 性纳米凝胶不仅保证了药物递送系统进入体循环时的稳定性，同时能够实现药物富集于瘤 内快速释放。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶，能够负载药物进行靶 向肿瘤的递送，完成瘤内富集和药物触发释放，同时荧光赋予了成像示踪能力。 3 CN 111588690 A 说　明　书 2/7 页 本发明另一目的在于提供一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶的制备方法，利用含 二硫键小分子交联水溶性透明质酸合成尺寸均匀且可控的还原响应纳米凝胶，进一步原位 还原负载贵金属纳米簇制得荧光纳米凝胶。 本发明最后一个目的在于提供一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶的应用，用于负 载药物。 本发明具体技术方案如下： 一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤： 1)制备甲基丙烯酰化的透明质酸； 2)甲基丙烯酰化透明质酸与交联剂加热溶解于去离子水中，氮气保护下，加热条 件下加入过硫酸钾，搅拌反应后，过滤、透析，制得纳米透明质酸纳米凝胶乳液； 3)将步骤2)制备的纳米透明质酸纳米凝胶乳液与贵金属溶液混合，调节至碱性 后，加入还原性溶液，冰水浴搅拌反应，过滤、透析，得到响应性透明质酸荧光纳米凝胶。 步骤1)具体为： 将透明质酸溶解于干燥的二甲亚砜DMSO，再加缚酸剂后，得到混合溶液1，将DMSO 与甲基丙烯酸酐的混合溶液2滴入混合溶液1中，室温搅拌后，用乙醇沉淀并洗涤产物，所得 浅黄色粗产品溶于水后，以稀氢氧化钠溶液调节pH至中性，然后用乙醇沉淀洗涤三次，所得 产物真空干燥后，得到甲基丙烯酰化的透明质酸。 步骤1)中： 所述缚酸剂为三乙胺； 透明质酸与干燥的二甲亚砜的用量比为5:80-150g/ml。 透明质酸与三乙胺的用量比为5:3-6g/ml。 透明质酸与甲基丙烯酸酐的用量比为5:4-8g/ml。 DMSO与甲基丙烯酸酐的混合溶液2中DMSO与甲基丙烯酸酐体积比为2-5:4-8； 所述室温搅拌，搅拌时间为6-12h； 所述稀氢氧化钠溶液浓度0.1-0.5mol/L。 优选的，步骤1)具体为：5克透明质酸溶解于80-150mL干燥的二甲亚砜(DMSO)，再 加3-6mL三乙胺后，得到混合溶液1，将DMSO与甲基丙烯酸酐的混合溶液2滴入得到混合溶液 1中，室温搅拌反应6-12小时后，用乙醇沉淀并洗涤产物，所得浅黄色粗产品溶于50-90mL水 后，以浓度0.1-0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至中性，再用乙醇沉淀洗涤三次，真空干燥 后，用核磁共振氢谱确认得到甲基丙烯酰化的透明质酸。 步骤2)中所述交联剂为N,N-双(丙烯酰)胱胺或N,N-双(丙烯酰)胱胺酸； 步骤2)所述交联剂为N,N-双(丙烯酰)胱胺时，步骤2)具体为：等质量的甲基丙烯 酰化透明质酸与N,N-双(丙烯酰)胱胺加热溶解于去离子水，配制成混合溶液，在氮气保护 下，混合溶液升高温度至80℃加入过硫酸钾，在80℃搅拌下反应，所得白色乳液产品过滤， 滤液用透析袋，在去离子水中透析以去除体系内的小分子。 进一步的，混合溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸与N,N-双(丙烯酰)胱胺总浓度为 2-5.2g/L；过硫酸钾与去离子水用量比为1-2:300g/ml；所述搅拌下反应10分钟， 或者，步骤2)中所述交联剂为N,N-双(丙烯酰)胱胺酸时，步骤2)具体为：等质量的 甲基丙烯酰化透明质酸与N,N-双(丙烯酰)胱胺酸通过加热溶解于去离子水，配制成混合溶 4 CN 111588690 A 说　明　书 3/7 页 液，在氮气保护下，混合液升高温度至80℃加入过硫酸钾，在80℃搅拌下反应，所得白色乳 液产品被过滤，滤液用透析袋在去离子水中透析48小时以去除体系内的小分子。 进一步的，混合溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸与N,N-双(丙烯酰)胱胺酸总浓度 为1-2g/L；过硫酸钾与去离子水用量比为2-3:300g/ml；所述搅拌下反应30分钟。 步骤3)中透明质酸纳米凝胶乳液与贵金属溶液的体积比为50:1-5；所述贵金属溶 液浓度为10-15mg/mL；步骤3)中，所述贵金属溶液为氯金酸溶液或硝酸银溶液； 步骤3)中所述透明质酸纳米凝胶乳液与还原性溶液体积比为50:2；所述还原性溶 液为硼氢化钠(NaBH4)冰水溶液。步骤3)中，所述贵金属溶液与还原性溶液中硼氢化钠 (NaBH4)的用量比为1-5mL：2.5×10-4-4.2×10-5mol。 步骤3)中调节至8-10； 步骤3)中冰水浴反应8-48h； 优选的，步骤3)具体为： 取50mL上述制备的透明质酸纳米凝胶乳液，将5mL10  mg/mL氯金酸溶液在搅拌下 缓慢滴入其中，以稀氢氧化钠溶液将混合液的pH值调到10后，滴入含4.2×10-5mol硼氢化钠 (NaBH4)的2mL硼氢化钠冰水液，冰水浴中搅拌24-48小时后，乳液变成浅棕色，过滤所得乳 液，滤液装入Cut-off分子量为14000的透析袋中透析24小时以除去小分子副产物，得到响 应性透明质酸荧光纳米凝胶；既可用于负载，更可用作检测探针，且在pH值3-11的广泛范围 介质中的稳定性，粒径变化不大。本步骤中，硼氢化钠与透明质酸协同原位还原所得金纳米 簇分散于凝胶内二硫键上，荧光光谱研究表明：该凝胶拥有峰值位于655纳米处的宽荧光发 射，此外，发射波长延伸到了700-800纳米的近红外光区。 或者，步骤3)具体为：取50mL上述制备的透明质酸纳米凝胶乳液，将1mL15  mg/mL 硝酸银溶液在搅拌下缓慢滴入其中，以稀氢氧化钠溶液将混合液的pH值调到8后，滴入含 2.5×10-4mol硼氢化钠(NaBH4)的2mL硼氢化钠冰水液，搅拌8-12小时后，硼氢化钠与透明质 酸协同原位还原所得银纳米簇分散于凝胶内二硫键上，乳液变成橙红色，过滤所得乳液，滤 液装入Cut-off分子量为14000的透析袋中透析24小时以除去小分子副产物，经动态光散射 测定所得纳米凝胶平均粒径为254纳米，且在pH值3-11的广泛范围内粒径变化不大。荧光光 谱研究表明：该凝胶拥有峰值位于630纳米处的宽荧光发射，此外，发射波长延伸到了700- 800纳米的近红外光区。 本发明提供的一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶，采用上述方法制备得到。所述 响应性透明质酸荧光纳米凝胶为纳米球形。纳米球形有利于其在血管里的传递和组织渗 透。 本发明提供的一种响应性透明质酸荧光纳米凝胶的应用，具体用于负载药物。 具体方法为： 将4mL  5mg/mL响应性透明质酸荧光纳米凝胶乳液于搅拌下以氢氧化钠液调节pH 至8，而后滴加1mL  2-2.5mg/mL盐酸阿霉素水溶液，在黑暗环境中将混合液搅拌过夜，时间 8-12小时，用高速离心40分钟除去未被负载的阿霉素，沉积物重新分散在10mM的磷酸缓冲 液(pH＝7.4,PBS)中，即得负载阿霉素的透明质酸荧光纳米凝胶。利用紫外可见吸收光谱和 荧光光谱检测并计算得到纳米凝胶的载药量及载药效率分别为：16％和96％。 本发明利用含二硫键小分子交联水溶性透明质酸合成尺寸均匀且可控的还原响 5 CN 111588690 A 说　明　书 4/7 页 应纳米凝胶，二硫键赋予纳米凝胶还原环境敏感性、贵金属纳米簇拥有延伸至近红外区的 荧光发射，近红外光将有利于其由活体内穿透组织发出外界能检测到的光，这对活体成像 非常有用。 本发明以携二硫键的双烯烃分子交联透明质酸制备出尺寸可控的纳米凝胶，进一 步在该凝胶内原位还原贵金属离子产生荧光纳米团簇，赋予了透明质酸纳米凝胶由可见至 近红外范围的荧光。本发明的透明质酸荧光纳米凝胶尺寸可控且生物相容性良好，具有较 高的胶体和光学稳定性。该荧光纳米凝胶对药物阿霉素的负载率高，拥有优异的肿瘤主动 靶向性，受还原微环境触发能加速释放所负载的药物。因此，本发明所涉纳米凝胶在抗肿瘤 药物负载、靶向控制释放及荧光示踪等医学领域具有较大的应用潜能。 本发明提供了生物相容、还原响应的荧光透明质酸纳米凝胶、制备方法及其药物 控释、生物成像应用。与现有技术相比，本发明原位负载贵金属纳米团簇获取荧光的交联透 明质酸凝胶，能够负载药物，而且，细胞存活率均大于90％即基本无毒性；纳米凝胶负载的 阿霉素对癌细胞的杀伤作用比裸药有明显的增加。而且，透明质酸荧光纳米凝胶能够将抗 肿瘤药物有效递送至病变部位，同时能够实现实时的追踪。 附图说明 图1为透明质酸与甲基丙烯酰化透明质酸的核磁共振氢谱；图中1为透明质酸 H谱；2-为甲基丙烯酰化透明质酸 氢谱； 图2为各种透明质酸与胱胺投料浓度所制纳米凝胶的水合粒径及表面电位； 图3为包覆金纳米簇的透明质酸荧光纳米凝胶的透射电子显微镜图； 图4为包覆金纳米簇的透明质酸荧光纳米凝胶的紫外可见吸收光谱和荧光发射光 谱图(内插图为荧光纳米凝胶在可见光与紫外光照射下的)； 图5为负载阿霉素的透明质酸荧光纳米凝胶在不同介质中的药物释放曲线； 图6为不同浓度的透明质酸荧光纳米凝胶与阿霉素裸药、负载阿霉素纳米凝胶对 A549细胞孵育后，细胞相对存活率图(左图为各种浓度空纳米凝胶对细胞作用，右图为各种 药物浓度的两种样品对细胞作用)； 图7为透明质酸荧光纳米凝胶在荷瘤小鼠体内的近红外光学成像结果； 图8为包覆银纳米簇的透明质酸荧光纳米凝胶的透射电子显微镜图。