技术摘要：
本发明公开了一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法，属于微生物培养技术领域。本发明的方法包括种苗、采集感病叶片和菌种初繁、单孢系转接和扩繁等步骤，包括：使用90mm的一次性培养皿，在培养皿底部垫两张滤纸，加入3mL无菌水进行保湿。将病叶上的单孢子堆用移液枪离散  全部
背景技术：
杨树在全球有广泛栽培，因其生长快、适应性强，而且品种多，选育时间短，成为了 防风固沙林、农田防护林、水土保持林和用材林的主要树种。但是随着大规模杨树人工林的 发展，诸多病害随之流行，严重阻碍了杨树的生长。尤其是杨树叶锈病的发生，导致病害在 杨树林地传播迅速，给杨树种植园带来巨大损失。导致杨树叶锈病的一种落叶松杨珊锈菌 是世界杂交杨树上危害严重的一种病原菌，较成材而言，幼苗和幼树的受害更重，病症为叶 背面出现淡黄色粉状物，且引起树苗提前落叶，严重降低其生长量，造成重大经济损失，并 且造成树势减弱，使杨树抵御其他病虫害以及自然灾害的能力减弱。 近几年，杨树锈病开始得到广泛的重视和研究，在研究其致病菌杨树落叶松杨珊 锈菌时，为获得足量的样本，研究人员通常直接从染病的杨树叶片上刮取大量单孢子堆，由 于这是一种混合菌系，对杨树落叶松杨珊锈菌分子遗传相关的研究极为不利，特别是研究 其群体遗传时，所用的菌需要获得大量的纯菌系，而现有技术中还没有该病菌的人工大量 扩繁其单孢系的良好方法，对该病菌许多研究具有很大的限制和影响。 杨树锈病很多研究需要基于纯的菌系开展，该菌是转主寄主，0、I阶段寄生于落叶 松属(Larix)，II、III阶段寄生于青杨派、黑杨派及以这两派为母本的杂交种上。并且只能 在活的杨树叶片上存活和繁殖，扩繁单孢系比较困难，国内外也没有报道过落叶松杨珊锈 菌单孢系的扩繁。因此现在亟需一套落叶松杨珊锈菌单孢扩繁体系，即得到纯化后的菌系。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种落叶松 杨珊锈菌的单孢扩繁方法，方便快捷高效。 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下： 一种杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，包括：挑取染病杨树叶上的落叶松杨 珊锈菌单孢子堆接种到健康的杨树叶上，繁殖后利用新的健康的杨树叶扩繁，最终获得大 量的单孢系孢子粉。 进一步地，所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，具体步骤包括： 1)种苗：取三到四周的易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗进行炼苗； 2)菌种初繁：摘取步骤1)得到的杨树苗的健康叶片，制成叶盘后用无菌水洗净，挑 取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌的单孢子堆接种到叶盘上培养，每个叶盘上只接种一个 单孢子堆； 3)单孢系转接：待叶盘发病后，分别将每个叶盘上生长的孢子挑接到若干个新的 叶盘上进行培养； 3 CN 111575224 A 说　明　书 2/4 页 4)按单孢系收集孢子粉； 5)单孢系喷接扩繁：将收集的孢子粉配制成孢子悬液，以喷雾的形式接种到多个 新的叶盘上继续培养，得到足够的孢子粉。 进一步地，所述的叶盘的制备和接种后的培养方法为：摘取炼苗后的杨树苗的叶 片，去除主脉切成2×2cm的小方块作为叶盘，无菌水洗净，使叶背面朝上置于培养皿中，培 养皿底部预先加入滤纸和无菌水保湿，接种后用封口膜封好培养皿进行培养。 进一步地，所述步骤2)中接种的具体操作为：在洗净的叶盘上均匀喷洒0.05％吐 温20，然后将病叶上边缘清晰的单孢子堆用移液枪离散至4μL的0.1g/L琼脂水溶液中，再用 移液枪将混有夏孢子堆的琼脂水溶液打在制备好的叶盘上。 进一步地，所述步骤3)具体为：用10mL一次性注射器的针管对准叶盘上的孢子粉， 轻轻刮取孢子粉收集到高温灭菌处理过的离心管内后加入1mL  0.1g/L的琼脂溶液混匀，再 分别转接到若干个新的叶盘上，接种前，新叶盘喷洒0.005％吐温20。 进一步地，所述步骤5)中，孢子悬浮液的配制方法为：将步骤4)收集的孢子粉悬浮 在含0.005％吐温20的0.1g/L琼脂溶液中，混合至浓度为2mg/mL的夏孢子悬浮液，使用喷壶 使孢子悬浮液以喷雾的形式接种到健康的杨树叶盘上，进一步扩大单孢系的繁殖，得到足 够的孢子粉。 进一步地，步骤2)、3)和5)中，叶盘接种，后置于温度为19℃，光周期为16h/24h的 温室中进行培养。 进一步地，所述步骤3)和步骤5)，在获得的孢子量不够时，分别可重复1～5代。 进一步地，步骤1)中所述易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗的品种为 NL895。 相比于现有技术，本发明的有益效果为： 本发明提供的落叶松杨珊锈菌单胞系扩繁体系，生长的单孢子堆边缘清晰，没有 其他污染的情况下，初繁成活率90％以上，喷接成功率95％。潜育期只有6-7天，接菌第7天 开始产孢，8到10天产生大量孢子。因此该方法具有时间短、成活率高、菌系纯、产量大的特 点，为落叶松杨珊锈病的相关研究提供了繁菌基础。 附图说明 图1为三到四周左右的NL895组培苗图； 图2为感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树叶片图，左为叶片背面，右图为叶片正面； 图3为菌种初繁图。