技术摘要：
本发明涉及种子训练方法及其用途，具体地，提供的是种子训练方法和产生重组蛋白质的方法，其包括使用这些种子训练方法。
背景技术：
常常使用含有编码重组蛋白质的核酸的哺乳动物细胞以生产治疗上或商业上重 要的蛋白质。在多种多样的产品线的当前环境中，生物技术公司越来越多地被驱动以开发 可高度灵活而且划算地生产治疗剂的创新的技术方案。 含有编码重组蛋白质的核酸的哺乳动物细胞经常在大的生产生物反应器中培养 以生产感兴趣的治疗蛋白质。使用种子训练方法以产生足够数目的所述哺乳动物细胞以接 种所述大生产生物反应器。常规的种子训练方法以冷藏的细胞库小瓶的解冻开始，然后是 在逐渐更大的培养容器中的多个培养步骤(例如，5个或更多)。常规的种子训练方法有几个 缺点，包括对于每个步骤过程中多项人工作业的要求，这使得整个工艺对于污染和操作者 错误是易受损的。此外，常规的种子训练方法是耗费时间的，这是由于培养步骤的数目且由 于在N-1步实现的低细胞密度(生产生物反应器的接种之前的(penultimate  to)细胞培养 物)，其在大规模生产生物反应器中仅可得到小于0.5x  106细胞/mL的起始细胞密度，这需 要5-10日生长期以达到所述稳态生产细胞密度。
技术实现要素：
本发明至少部分基于开发种子训练方法，其导致几个优势，包括，例如，较低的复 杂度，减少的培养步骤数目，减少的从起始细胞培养物(例如，解冻的细胞库)到接种生产生 物反应器的时间量，减少的人工操纵量，减少的污染风险，生产生物反应器中较高的起始细 胞活细胞密度，和生产生物反应器中较短的生长期(例如，达到所述稳态生产细胞密度所需 的短时间段)。所提供的种子训练方法包括(a)将多个重组哺乳动物细胞在容器内所包含的 第一培养基中处理以提供第一细胞培养物；(b)分批培养所述第一细胞培养物至细胞密度 范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL；(c)将一定体积的(b)的第一细胞培养物 在灌注生物反应器内所包含的第二培养基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约0.50x  106细胞/mL的第二细胞培养物；(d)灌注培养所述第二细胞培养物至 细胞密度范围为约5.0x  106细胞/mL至约120x  106细胞/mL；并(e)将一定体积的(d)的第二 细胞培养物在生产生物反应器内所包含的第三培养基中处理以提供具有初始细胞密度范 4 CN 111575225 A 说　明　书 2/44 页 围为0.20x  106细胞/mL至约8.0x  106细胞/mL的生产细胞培养物。本文还提供生产重组蛋白 质(例如，重组治疗蛋白质)的方法，其包括使用本文所述的种子训练方法之一。 本文提供的是种子训练方法，其包括：(a)将多个重组哺乳动物细胞在容器内所包 含的第一培养基中处理以提供第一细胞培养物；(b)分批培养所述第一细胞培养物至细胞 密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL；(c)将一定体积的步骤(b)的第一细 胞培养物在灌注生物反应器内所包含的第二培养基中处理，以提供具有初始细胞密度范围 为约0.25x  106细胞/mL至约0.5x  106细胞/mL的第二细胞培养物；(d)灌注培养所述第二细 胞培养物至细胞密度范围为约5x  106细胞/mL至约120x  106细胞/mL；并(e)将一定体积的步 骤(d)的第二细胞培养物在生产生物反应器内所包含的第三培养基中处理，以提供具有初 始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL的生产细胞培养物。在这些方法 的一些实施方案中，(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括：将冷冻的细胞库解冻；和 将一定体积的解冻的细胞库在所述第一培养基中处理。在本文所述的任何方法的一些实施 方案中，所述冷冻的细胞库包含约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/mL的细胞密度范围。在 本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述解冻的细胞库含有至少60％(例如，至少 90％)的活细胞百分比。 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(a)中处理所述多个重组哺乳动物细 胞包括将一定体积的含有所述多个重组哺乳动物细胞的第三细胞培养物在所述第一培养 基中处理。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(1)将多个所述重组哺乳动物 细胞在容器内所包含的第四培养基中处理以提供所述第三细胞培养物；(2)分批培养(1)中 的第三细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL，其中将一 定体积的(2)中的第三细胞培养物在(a)中的第一培养基中处理。在本文所述的任何方法的 一些实施方案中，(a)中的容器和(1)中的容器之一或两者是可丢弃的单次使用的生物反应 器(例如，可丢弃的单次使用的生物反应器包括塑胶无菌袋)。 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(1)中处理所述多个重组哺乳动物细 胞包括：将冷冻的细胞库解冻；并将一定体积的解冻的细胞库在所述第四培养基中处理。在 本文所述任何方法的一些实施方案中，所述冷冻的细胞库包含约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/mL的细胞密度范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述解冻的细胞库 含有至少60％(例如，至少90％)的活细胞百分比。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中所述第一细胞培养物具有约1.0L 至约50L(例如，约5.0L至约10L)的体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c) 中所述第二细胞培养物具有约5L至约600L(例如，约10L至约300L)的体积范围。在本文所述 的任何方法的一些实施方案中，(e)中所述生产细胞培养物具有约50L至约20,000L(例如， 约100L至约10,000L)的体积范围。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(1)中所述第 四培养基具有约500mL至约20L(例如，约500mL至约10L)的体积范围。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中所述容器具有约1.5L至约100L(例 如，约1.5L至约50L)的内部体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c)中所述 灌注生物反应器具有约7.5L至约1,000L(例如，约50L至约1000L)的内部体积范围。在本文 所述任何方法的一些实施方案中，(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约25,000L(例 如，约150L至约10,000L)的内部体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(1)中 5 CN 111575225 A 说　明　书 3/44 页 所述容器具有约1L至约40L(例如，约1L至约20L)的内部体积范围。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c)中所述灌注培养使用配备有交替切 向流过滤装置的灌注生物反应器实施。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(e)中所述 初始细胞密度范围是约2.0x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL。在本文所述任何方法的一些 实施方案中，(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少10％(例如，至少20％)。 还提供的是产生重组蛋白质的方法，其包括：(a)将多个重组哺乳动物细胞在容器 内所包含的第一培养基中处理以提供第一细胞培养物；(b)分批培养所述第一细胞培养物 至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL；(c)将一定体积的(b)的第一 细胞培养物在灌注生物反应器内所包含的第二培养基中处理以提供具有初始细胞密度范 围为0.25x  106细胞/mL至约0.5x  106细胞/mL的第二细胞培养物；(d)灌注培养所述第二细 胞培养物至细胞密度范围为约5x  106细胞/mL至约60x  106细胞/mL；(e)将一定体积的(d)的 第二细胞培养物在生产生物反应器内所包含的第三培养基中处理以提供具有初始细胞密 度范围为约0.25x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL的生产细胞培养物；(f)在允许所述重组 哺乳动物细胞分泌重组蛋白质的条件下灌注培养生产细胞培养物；并(g)从所述生产细胞 培养物收获所述重组蛋白质。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中处理所述多个 重组哺乳动物细胞包括：将冷冻的细胞库解冻；并将一定体积的解冻的细胞库在所述第一 培养基中处理。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述冷冻的细胞库具有约10x  107 细胞/mL至约50x  107细胞/mL的细胞密度范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所 述解冻的细胞库含有至少60％(例如，至少90％)的活细胞百分比。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞 包括将一定体积的包含所述多个重组哺乳动物细胞的第三细胞培养物在所述第一培养基 中处理。本文所述任何方法的一些实施方案进一步包括：(1)将多个所述重组哺乳动物细胞 在容器内所包含的第四培养基中处理以提供所述第三细胞培养物；并(2)分批培养(1)中的 第三细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL，其中将一定 体积的(2)中的第三细胞培养物在(a)中的第一培养基中处理。在本文所述任何方法的一些 实施方案中，(a)中的容器和(1)中的容器之一或两者是可丢弃的单次使用的生物反应器 (例如，可丢弃的单次使用的生物反应器包括塑胶无菌袋)。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(1)中处理所述多个重组哺乳动物细胞 包括：将冷冻的细胞库解冻；并将一定体积的解冻的细胞库在所述第四培养基中处理。在本 文所述任何方法的一些实施方案中，所述冷冻的细胞库包含约1.0x  107细胞/mL至约50x  107细胞/mL(例如，约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/mL)的细胞密度范围。在本文所述任 何方法的一些实施方案中，所述解冻的细胞库含有至少60％(例如，至少90％)的活细胞百 分比。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中所述第一细胞培养物具有约1.0L 至约50L(例如，约5.0L-约10.0L)的体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c) 中所述第二细胞培养物具有约5L至约600L(例如，约10L至约300L)的体积范围。在本文所述 任何方法的一些实施方案中，(e)中所述生产细胞培养物具有约50L至约20,000L(例如，约 100L至约10,000L)的体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(1)中所述第四培 养基具有约500mL至约20L(例如，约500mL至约10L)的体积范围。 6 CN 111575225 A 说　明　书 4/44 页 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(a)中所述容器具有的内部体积范围约 1.5L至约100L(例如，约1.5L至约50L)。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c)中所述 灌注生物反应器具有约7.5L至约1,000L(例如，约50L至约1000L)的内部体积范围。在本文 所述任何方法的一些实施方案中，(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约25,000L(例 如，150L至约10,000L)的内部体积范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(1)中所 述容器具有约1L至约40L(例如，约1L至约20L)的内部体积范围。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(c)中所述灌注培养使用配备有交替切 向流过滤装置的灌注生物反应器实施。在本文所述任何方法的一些实施方案中，(e)中所述 初始细胞密度范围是约2.0x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL。在本文所述任何方法的一些 实施方案中，(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少10％(例如，至少20％)。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述稳态生产细胞密度为5x  106细胞/mL至约50x  106细胞/mL(例如，约15x106细胞/mL-约50x  106细胞/mL)。在本申请所述的任何方法的一些 实施方案中，(f)中所述灌注培养得到生产细胞培养物，其在约1日至约10日(例如，约2日- 约5日)的时间段中达到所述稳态生产细胞密度。 在本文所述任何方法的一些实施方案中，(g)中所述收获包括从所述生产生物反 应器去除(例如，连续去除)培养基。本文所述任何方法的一些实施方案进一步包括从去除 的培养基分离重组蛋白质。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述分离使用整合的 连续工艺实施。本文所述任何方法的一些实施方案进一步包括将分离的重组蛋白质配制入 药剂中。 如本文中所使用的，名词前的单词“一个”代表特定名词的一个或多个。例如，短语 “重组哺乳动物细胞”代表“一个或多个重组哺乳动物细胞”。 术语“哺乳动物细胞”意为来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、 大鼠、猪、牛或兔)的任何细胞。例如，哺乳动物细胞可为永生化的细胞。在一些实施方案中， 哺乳动物细胞是分化的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化的细胞。哺乳动物 细胞的非限制性实例在本文中描述。哺乳动物细胞的其他实例是本领域已知的。 术语“种子训练方法(seed  train  process)”是本领域已知的且意为一种多步方 法，通过所述方法将第一细胞培养物中的起始数目的细胞(例如，重组哺乳动物细胞)扩增 为N-1细胞培养物，其含有足够数目的细胞从而以大于0.25x106细胞/mL的初始细胞密度接 种通常的生产生物反应器。 术语“基本上不含”意为一种组合物(例如，液体培养基)，其至少或大约90％不含 (例如，至少或大约95％、96％、97％、98％或至少或大约99％不含，或约100％不含)特定的 物质(例如，哺乳动物细胞)。 术语“0.5x体积”意为约50％的体积。术语“0.6x体积”意为约60％的体积。同样地， 0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分别意为约70％、80％、90％或100％的体积。 术语“培养”或“细胞培养”意为在受控的一组物理条件下哺乳动物细胞(例如，重 组哺乳动物细胞)的维持或增殖。 术语“哺乳动物细胞的培养物”或“细胞培养物”意为含有多个哺乳动物细胞的液 体培养基，所述哺乳动物细胞在受控的一组物理条件下维持或增殖。 术语“液体培养基”或“培养基”意为含有足够营养物以允许细胞(例如，哺乳动物 7 CN 111575225 A 说　明　书 5/44 页 细胞)在体外生长或增殖的流体。例如，液体培养基可含有如下的一种或多种：氨基酸(例 如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物 素、钙、烟酰胺、吡哆醇(pyridoxine)、核黄素、胸苷、氰钴胺素、丙酮酸盐、硫辛酸、镁、葡萄 糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可含有来自哺乳动物的血 清。在一些实施方案中，液体培养基不含有来自哺乳动物的血清或另外的提取物(限定的 (defined)液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可含有痕量金属、哺乳动物生长激 素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另外的实例是基本培养基(例如，仅含有无机盐、 碳源和水的培养基)。液体培养基的非限制性实例在本文中描述。液体培养基的另外的实例 是本领域已知的且是商业上可得到的。液体培养基可含有任何密度的哺乳动物细胞。例如， 如本文中所使用的，从生产生物反应器去除的一定体积的液体培养基可基本上不含哺乳动 物细胞。 术语“不含源自动物的组分的液体培养基”意为一种液体培养基，其不含有任何源 自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)。 术语“不含血清的液体培养基”意为一种液体培养基，其不含有哺乳动物血清。 术语“含血清的液体培养基”意为一种液体培养基，其含有哺乳动物血清。 术语“化学上限定的液体培养基”是本领域的术语且意为一种液体培养基，其中所 有化学组分都是已知的。例如，化学上限定的液体培养基不含有胎牛血清、牛血清白蛋白或 人血清白蛋白，因为这些制备物通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。 术语“不含蛋白质的液体培养基”意为一种液体培养基，其不含有任何蛋白质(例 如，任何可检测到的蛋白质)。 术语“搅动”意为搅拌或以其他方式移动容器(例如，生物反应器)中液体培养基的 部分。实施搅动从而，例如，增加容器(例如，生物反应器)中的液体培养基中溶解的O2浓度。 搅动可使用任何本领域已知的方法实施，例如，工具(instrument)或搅拌桨(propeller)。 例如，搅动可通过将容器置于倾斜和/或旋转的平台上来实施。可用于实施容器(例如，生物 反应器)中液体培养基的部分的搅动的例示性装置和方法是本领域已知的。 术语“整合的方法”意为一种方法，其使用合作发挥功能以实现特定结果(例如，生 成从液体培养基分离的重组蛋白质)的结构元件来实施。 术语“连续方法”意为一种方法，其通过系统的至少一部分连续地给料流体。 术语“免疫球蛋白”意为含有免疫球蛋白蛋白质的至少15个氨基酸(例如，至少20、 30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列的多肽(例如，可变域序列、框架序列 或恒定域序列)。免疫球蛋白可包括例如轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸，例如，重链免 疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可为分离的抗体(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。 免疫球蛋白可为IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可为抗体片段，例 如，Fab片段、F(ab′)2片段或scFv片段。免疫球蛋白还可为双-特异性抗体或三-特异性抗 体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双功能抗体(d ia bod y) ， 或 (纳米抗体)。免疫球蛋白还可为含有至少一个免疫球蛋白域的工程化的蛋白 质(例如，融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性实例在本文中描述且免疫球蛋白的另外的实 例是本领域已知的。 8 CN 111575225 A 说　明　书 6/44 页 术语“蛋白质片段”或“多肽片段”意为多肽序列的一部分，其长度上为至少或大约 4个氨基酸，至少或大约5个氨基酸，至少或大约6个氨基酸，至少或大约7个氨基酸，至少或 大约8个氨基酸，至少或大约9个氨基酸，至少或大约10个氨基酸，至少或大约11个氨基酸， 至少或大约12个氨基酸，至少或大约13个氨基酸，至少或大约14个氨基酸，至少或大约15个 氨基酸，至少或大约16个氨基酸，至少或大约17个氨基酸，至少或大约18个氨基酸，至少或 大约19个氨基酸，或至少或大约20个氨基酸，或者长度上多于20个氨基酸。重组蛋白质片段 能够使用本文中所述的任何方法产生。 术语“工程化的蛋白质”意为一种多肽，其不由生物体(例如，哺乳动物)内存在的 内源核酸天然编码。工程化的蛋白质的实例包括酶(例如，具有一个或多个氨基酸取代、缺 失、插入或添加，其导致工程化的酶的催化活性和/或稳定性增加)、融合蛋白、抗体(例如， 二价抗体、三价抗体或双功能抗体)和含有至少一个重组支架(scaffolding)序列的抗原- 结合蛋白。 术语“多-柱层析系统”或“MCCS”意为总共两个或多个相互连接的或转换的层析柱 和/或层析膜的系统。多-柱层析系统的非限制性实例是周期逆流色谱系统(periodic  counter  current  chromatography  system)(PCC)，其含有总共两个或多个相互连接的或 转换的层析柱和/或层析膜。多-柱层析系统的另外的实例在本文中描述且为本领域已知 的。 术语“捕获”意为一个步骤，实施该步骤以将重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白) 与液体培养基或稀释的液体培养基中存在的一种或多种其他组分(例如，培养基蛋白质或 哺乳动物细胞中存在的或从其中分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA或其他蛋白 质))部分地纯化或分离(例如，按重量计至少或大约5％，例如，至少或大约10％、15％、 20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或 大约95％纯)、浓缩和稳定化。通常，使用结合重组蛋白质的树脂(例如，通过使用亲和层析) 实施捕获。用于从液体培养基或稀释的液体培养基捕获重组蛋白质的非限制性方法在本文 中描述且其他是本领域已知的。重组蛋白质可使用至少一个层析柱和/或层析膜(例如，本 文中描述的任何层析柱和/或层析膜)从液体培养基捕获。 术语“纯化”意为一个步骤，实施所述步骤以将重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋 白)与含有重组蛋白质的流体中存在的一种或多种其他杂质(例如，大量(bulk)杂质)或组 分(例如，液体培养基蛋白质或哺乳动物细胞中存在的或从其中分泌的一种或多种其他组 分(例如，DNA、RNA、其他蛋白质、内毒素、病毒等))分离。例如，纯化可在初始捕获步骤过程 中或其后实施。纯化可使用结合重组蛋白质或污染物的树脂、膜或任何其他固体支持物(例 如，通过使用亲和层析、疏水相互作用层析、阴离子或阳离子交换层析或分子筛层析)实施。 重组蛋白质可使用至少一个层析柱和/或层析膜(例如，本文中描述的任何层析柱或层析 膜)从含有所述重组蛋白质的流体纯化。 术语“精制(polishing)”是本领域的术语且意为一个步骤，实施该步骤以从含有 重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白)的流体去除残余的痕量或少量污染物或杂质，其接近 最终合意的纯度。例如，精制可通过将含有重组蛋白质的流体经过层析柱或膜吸收剂来实 施，所述层析柱或膜吸收剂选择性地结合靶重组蛋白质或含有重组蛋白质的流体中存在的 少量污染物或杂质。在这样的实例中，层析柱或膜吸收剂的洗脱液/滤液含有所述重组蛋白 9 CN 111575225 A 说　明　书 7/44 页 质。 术语“洗脱液/滤液”是本领域的术语且意为一种从层析柱或层析膜发出的流体， 其包含可检测量的重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白)。 术语“过滤”意为从液体(例如，液体培养基或本文中所述的任何系统或方法中存 在的流体)去除至少部分的(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)不合意的 生物污染物(例如，哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、病毒或分枝杆菌(mycobacteria)和/或 特定的物质(例如，沉淀的蛋白质)。 术语“分泌的蛋白质”或“分泌的重组蛋白质”意为一种蛋白质(例如，重组蛋白 质)，当其在哺乳动物细胞内翻译时其初始含有至少一个分泌信号序列，并且(至少部分)通 过所述哺乳动物细胞中分泌信号序列的酶切割至少部分分泌入胞外空间(例如，液体培养 基)。有技术的实施者会懂得“分泌的”蛋白质不需要从细胞完全解离才被认为是分泌的蛋 白质。 术语“灌注培养”是本领域的术语且意为在容器(例如，生物反应器)中培养细胞培 养物，其中在容器中培养细胞培养物包括周期地或连续地去除容器中存在的液体培养基 (例如，基本上不含细胞的液体培养基)，并且同时或稍后将基本上相同体积的替代液体培 养基添加至容器。在一些实例中，去除的液体培养基的体积和在培养期过程中随增加的时 间(例如，约24-小时时间，约1分钟-约24-小时的时间，或大于24小时的时间)添加的替代培 养基的体积(例如，基于日的培养基再进料速率(ref eed  ra te))存在增量变化 (incremental  change)(例如，增加或减少)。每日去除和替代的培养基的级分可取决于所 培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而变化。“RV”或“反应器体积”意为 在培养过程开始时存在的培养基的体积(例如，接种后存在的培养基的总体积)。 术语“容器”是本领域已知的且意为一种装置，其具有适于在受控的一组允许维持 或增殖所述细胞的物理条件下在液体培养基中培养多个细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的 内部体积。容器的非限制性实例为生物反应器(例如，本申请描述或本领域已知的任何例示 性生物反应器)。 术语“灌注生物反应器”是本领域已知的且意为一种生物反应器，其具有用于在液 体培养基中培养多个细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的内部体积，并具有用于周期地或连 续地去除生物反应器中的液体培养基的手段(means)(例如，出口、入口、泵或其他这样的装 置)且具有用于将基本上相同体积的替代液体培养基添加至生物反应器的手段(例如，出 口、入口、泵或其他这样的装置)。替代液体培养基的添加可以与从生物反应器去除液体培 养基在基本上相同的时间或其稍后来实施。用于从生物反应器去除液体培养基的手段和用 于添加替代液体培养基的手段可为单一装置或系统。 术语“生产生物反应器”是本领域的术语且意为一种大规模生物反应器(例如，具 有超过500L、1,000L、5,000L、10,000L、20,000L、50,000L或100,000L的内部体积)。例如，生 产生物反应器可为灌注生物反应器。 术语“稳态生产细胞密度”是本领域的术语且意为在灌注培养过程中随时间维持 的培养基中的活细胞(例如，活的重组哺乳动物细胞)的目标浓度。 术语“分批培养(物)”是本领域的术语且意为含有在液体培养基中的多个细胞(例 如，哺乳动物细胞)的容器(例如，生物反应器)，其中所述容器(例如，生物反应器)中存在的 10 CN 111575225 A 说　明　书 8/44 页 细胞的培养不包括将大量或显著量的新鲜液体培养基添加至细胞培养物且不包括在培养 过程中将大量或显著量的液体培养基从细胞培养物去除。 术语“补料-分批培养(物)”是本领域的术语且意为包括在液体培养基中的多个细 胞(例如，哺乳动物细胞)的容器(例如，生产生物反应器)，其中所述容器(例如，生产生物反 应器)中存在的细胞的培养包括将新鲜液体培养基周期地或连续地添加至所述容器而在培 养过程中不从所述容器大量地或显著地去除液体培养基。所述新鲜液体培养基可与培养开 始时容器中存在的液体培养基相同。在补料-分批培养的一些实例中，所述新鲜液体培养基 是培养开始时容器中存在的液体培养基的浓缩形式。在补料-分批培养的一些实例中，将新 鲜培养基作为干粉添加。 术语“单元操作”是本领域的术语且意为一个功能步骤，其可在从液体培养基分离 重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白质)的过程中实施。例如，单元操作可为过滤(例如，从含 有重组蛋白质的流体去除污染的细菌、酵母、病毒或分枝杆菌和/或特定的物质)、捕获、表 位标签去除(epitope  tag  removal)、纯化、保持或保存、精制、病毒灭活、调节含有所述重 组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH，以及去除不想要的盐。 “比生产速率(Specific  productivity  rate)”或“SPR”是本领域的术语且如本文 中所用的指每日每个哺乳动物细胞产生的重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白)的质量 (mass)或酶活性。重组抗体的SPR通常测量为质量/细胞/日。重组酶的SPR通常测量为单位/ 细胞/日或(单位/质量)/细胞/日。 “体积生产速率(Volume  productivity  rate)”或“VPR”是本领域的术语且如本文 中所用的指每日每体积的培养物(例如，每L的生物反应器、容器或管体积)产生的重组蛋白 质(例如，重组的治疗蛋白)的质量或酶活性。重组抗体的VPR通常测量为质量/L/日。重组酶 的VPR通常测量为单位/L/日或质量/L/日。 “滑动器(Skid)”是本领域的术语且如本文中所用的指三维固体结构，其可充当本 文中描述的系统的平台或支持物。如果滑动器包含一个或多个允许运动的结构(例如，轮、 辊等)，其可赋予所述系统或其部分运动性(mobility)。滑动器的非限制性实例在本文中描 述。滑动器的其他实例是本领域已知的。 除非以其他方式定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员所理解的相同的含义。本文描述用于本发明的方法和材料，也可使用本领域 已知的其他、合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅仅是说明性的，且不意欲为限制 性的。本文提及的所有出版物、专利申请案、专利、序列、数据库登录项和其他参考资料以参 考方式以它们的整体并入。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。 本发明的其他特征和优势会从如下详述的说明书和附图以及从请求项中显而易 见。 具体地，本发明涉及如下各项： 1.一种种子训练方法，其包括： (a)将多个重组哺乳动物细胞在容器内所包含的第一培养基中处理以提供第一细 胞培养物； (b)分批培养所述第一细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约 5.0x  106细胞/mL； 11 CN 111575225 A 说　明　书 9/44 页 (c)将一定体积的步骤(b)的第一细胞培养物在灌注生物反应器内所包含的第二 培养基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约0.5x  106细胞/mL 的第二细胞培养物； (d)灌注培养所述第二细胞培养物至细胞密度范围为约5x  106细胞/mL至约120x  106细胞/mL；并 (e)将一定体积的步骤(d)的第二细胞培养物在生产生物反应器内所包含的第三 培养基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL的 生产细胞培养物。 2.项1的方法，其中(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括： 将冷冻的细胞库解冻； 并将一定体积的解冻的细胞库在所述第一培养基中处理。 3.项2的方法，其中所述冷冻的细胞库包含约10x  107细胞/mL至约50x107细胞/mL 的细胞密度范围。 4.项3的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少60％的活细胞百分比。 5.项4的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少90％的活细胞百分比。 6.项1的方法，其中(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括将一定体积的包含 所述多个重组哺乳动物细胞的第三细胞培养物在所述第一培养基中处理。 7.项6的方法，其进一步包括： (1)将多个所述重组哺乳动物细胞在容器内所包含的第四培养基中处理以提供所 述第三细胞培养物； (2)分批培养(1)中的第三细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约 5.0x  106细胞/mL， 其中将一定体积的(2)中的第三细胞培养物在(a)中的第一培养基中处理。 8.项7的方法，其中(a)中的容器和(1)中的容器之一或两者是可丢弃的单次使用 的生物反应器。 9.项8的方法，其中所述可丢弃的单次使用的生物反应器包括塑胶无菌袋。 10.项9的方法，其中(1)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括： 将冷冻的细胞库解冻；并 将一定体积的解冻的细胞库在所述第四培养基中处理。 11.项10的方法，其中所述冷冻的细胞库包含约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/ mL的细胞密度范围。 12.项11的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少60％的活细胞百分比。 13.项12的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少90％的活细胞百分比。 14.项1的方法，其中(a)中所述第一细胞培养物具有约1.0L至约50L的体积范围。 15.项14的方法，其中(a)中所述第一细胞培养物具有约5.0L至约10.0L的体积范 围。 16.项1的方法，其中(c)中所述第二细胞培养物具有约5L至约600L的体积范围。 17.项16的方法，其中(c)中所述第二细胞培养物具有约10L至约300L的体积范围。 18.项1的方法，其中(e)中所述生产细胞培养物具有约50L至约20,000L的体积范 12 CN 111575225 A 说　明　书 10/44 页 围。 19.项18的方法，其中(e)中所述生产细胞培养物具有约100L至约10,000L的体积 范围。 20.项7的方法，其中(1)中所述第四培养基具有约500mL至约20L的体积范围。 21.项7的方法，其中(1)中所述第四培养基具有约500mL至约10L的体积范围。 22.项1的方法，其中(a)中所述容器具有约1.5L至约100L的内部体积范围。 23.项22的方法，其中(a)中所述容器具有约1.5L至约50L的内部体积范围。 24.项1的方法，其中(c)中所述灌注生物反应器具有约7.5L至约1,000L的内部体 积范围。 25.项24的方法，其中(c)中所述灌注生物反应器具有约50L至约1000L的内部体积 范围。 26.项1的方法，其中(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约25,000L的内部体 积范围。 27.项26的方法，其中(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约10,000L的内部 体积范围。 28.项7的方法，其中(1)中所述容器具有约1L至约40L的内部体积范围。 29.项28的方法，其中(1)中所述容器具有约1L至约20L的内部体积范围。 30.项1的方法，其中(c)中所述灌注培养使用配备有交替切向流过滤装置的灌注 生物反应器实施。 31 .项1的方法，其中(e)中所述初始细胞密度范围是约2.0x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL。 32.项1的方法，其中(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少10％。 33.项32的方法，其中(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少20％。 34.一种产生重组蛋白质的方法，其包括： (a)将多个重组哺乳动物细胞在容器内所包含的第一培养基中处理以提供第一细 胞培养物； (b)分批培养所述第一细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约 5.0x  106细胞/mL； (c)将一定体积的(b)的第一细胞培养物在灌注生物反应器内所包含的第二培养 基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约0.5x  106细胞/mL的第 二细胞培养物； (d)灌注培养所述第二细胞培养物至细胞密度范围为约5x  106细胞/mL至约60x  106细胞/mL； (e)将一定体积的(d)的第二细胞培养物在生产生物反应器内所包含的第三培养 基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL的生产 细胞培养物； (f)在允许所述重组哺乳动物细胞分泌重组蛋白质的条件下灌注培养生产细胞培 养物；和 (g)从所述生产细胞培养物收获所述重组蛋白质。 13 CN 111575225 A 说　明　书 11/44 页 35.项34的方法，其中(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括： 将冷冻的细胞库解冻； 并将一定体积的解冻的细胞库在所述第一培养基中处理。 36.项35的方法，其中所述冷冻的细胞库具有约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/ mL的细胞密度范围。 37.项36的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少60％的活细胞百分比。 38.项37的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少90％的活细胞百分比。 39.项34的方法，其中(a)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括将一定体积的包 含所述多个重组哺乳动物细胞的第三细胞培养物在所述第一培养基中处理。 40.项39的方法，其进一步包括： (1)将多个所述重组哺乳动物细胞在容器内所包含的第四培养基中处理以提供所 述第三细胞培养物； (2)分批培养(1)中的第三细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约 5.0x  106细胞/mL， 其中将一定体积的(2)中的第三细胞培养物在(a)中的第一培养基中处理。 41 .项40的方法，其中(a)中的容器和(1)中的容器之一或两者是可丢弃的单次使 用的生物反应器。 42.项41的方法，其中所述可丢弃的单次使用的生物反应器包括塑胶无菌袋。 43.项40的方法，其中(1)中处理所述多个重组哺乳动物细胞包括： 将冷冻的细胞库解冻；并 将一定体积的解冻的细胞库在所述第四培养基中处理。 44.项43的方法，其中所述冷冻的细胞库具有约1.0x  107细胞/mL至约50x  107细 胞/mL的细胞密度范围。 45.项44的方法，其中所述冷冻的细胞库具有约10x  107细胞/mL至约50x  107细胞/ mL的细胞密度范围。 46.项45的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少60％的活细胞百分比。 47.项46的方法，其中所述解冻的细胞库含有至少90％的活细胞百分比。 48.项34的方法，其中(a)中所述第一细胞培养物具有约1.0L至约50L的体积范围。 49.项48的方法，其中(a)中所述第一细胞培养物具有约5.0L至约10.0L的体积范 围。 50.项34的方法，其中(c)中所述第二细胞培养物具有约5L至约600L的体积范围。 51.项50的方法，其中(c)中所述第二细胞培养物具有约10L至约300L的体积范围。 52.项34的方法，其中(e)中所述生产细胞培养物具有约50L至约20,000L的体积范 围。 53.项52的方法，其中(e)中所述生产细胞培养物具有约100L至约10,000L的体积 范围。 54.项53的方法，其中(1)中所述第四培养基具有约500mL至约20L的体积范围。 55.项54的方法，其中(1)中所述第四培养基具有约500mL至约10L的体积范围。 56.项34的方法，其中(a)中所述容器具有约1.5L至约100L的内部体积范围。 14 CN 111575225 A 说　明　书 12/44 页 57.项56的方法，其中(a)中所述容器具有约1.5L至约50L的内部体积范围。 58.项34的方法，其中(c)中所述灌注生物反应器具有约7.5L至约1,000L的内部体 积范围。 59.项58的方法，其中(c)中所述灌注生物反应器具有约50L至约1000L的内部体积 范围。 60.项34的方法，其中(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约25,000L的内部 体积范围。 61 .项60的方法，其中(e)中所述生产生物反应器具有约150L至约10,000L的内部 体积范围。 62.项61的方法，其中(1)中所述容器具有约1L至约40L的内部体积范围。 63.项62的方法，其中(1)中所述容器具有约1L至约20L的内部体积范围。 64.项34的方法，其中(c)中所述灌注培养使用配备有交替切向流过滤装置的灌注 生物反应器实施。 65.项34的方法，其中(e)中所述初始细胞密度范围是约2.0x  106细胞/mL至约8x  106细胞/mL。 66.项34的方法，其中(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少10％。 67.项66的方法，其中(e)中所述初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少20％。 68.项66的方法，其中所述稳态生产细胞密度为5x  106细胞/mL至约50x  106细胞/ mL。 69.项68的方法，其中所述稳态生产细胞密度为15x  106细胞/mL至约50x  106细胞/ mL。 70.项34的方法，其中(f)中的灌注培养得到生产细胞培养物，其在约1日至约10日 的时间达到所述稳态生产细胞密度。 71 .项70的方法，其中(f)中的灌注培养得到生产细胞培养物，其在约2日至约5日 的时间达到所述稳态生产细胞密度。 72.项34的方法，其中(g)中的收获包括从所述生产生物反应器去除培养基。 73.项72的方法，其中将所述培养基从所述生产生物反应器连续去除。 74.项73的方法，其进一步包括从去除的培养基分离重组蛋白质。 75.项74的方法，其中所述分离使用整合及连续的方法实施。 76.项74的方法，其进一步包括将分离的重组蛋白质配制入药剂中。 附图简述 图1为显示常规种子训练方法的示意图(顶部)，其以接种500-L生产灌注生物反应 器结束；和本文提供的例示性种子训练方法的示意图(底部)，其以接种500-L生产灌注生物 反应器结束。 图2为显示常规种子训练方法的示意图(顶部)，其以接种10,000-L生产分批或补 料-分批生物反应器结束；和本文提供的例示性种子训练方法的示意图(底部)，其以接种 10,000-L生产分批或补料-分批生物反应器结束。 图3为显示本文所述的例示性种子训练方法的所有步骤中的活细胞密度的图：在 2-L可丢弃的单次使用的生物反应器中分批培养1-L第三细胞培养物，在20-L可丢弃的单次 15 CN 111575225 A 说　明　书 13/44 页 使用的生物反应器中分批培养7.5-L第一细胞培养物，和在15-L灌注生物反应器中灌注培 养10-L第二细胞培养物。 图4为本文所述的例示性种子训练方法中活细胞密度作为N-1灌注细胞培养物的 电容(capacitance)的函数图。 图5为用一定体积的具有25x  106细胞/mL(蓝线)、50x  106细胞/mL(绿线)或100x  106细胞/mL(红线)的活细胞密度的N-1细胞培养物接种以在旋转管(代表生产生物反应器) 中得到0.5x  106细胞/mL的起始活细胞密度的旋转管的活细胞密度(实线)和百分比细胞活 力(虚线)随时间的图。实线和虚线代表数据(n＝3)的均值。阴影面积代表±2标准偏差。 图6为用一定体积的具有25x  106细胞/mL(蓝线)、50x  106细胞/mL(绿线)或100x  106细胞/mL(红线)的活细胞密度的N-1细胞培养物接种以在旋转管(代表生产生物反应器) 中得到2.5x  106细胞/mL的起始活细胞密度的旋转管的活细胞密度(实线)和百分比细胞活 力(虚线)随时间的图。实线和虚线代表数据(n＝3)的均值。阴影面积代表±2标准偏差。 图7为用一定体积的具有25x  106细胞/mL(蓝线)、50x  106细胞/mL(绿线)或100x  106细胞/mL(红线)的活细胞密度的N-1细胞培养物接种以在旋转管(代表生产生物反应器) 中得到5.0x  106细胞/mL的起始活细胞密度的旋转管的活细胞密度(实线)和百分比细胞活 力(虚线)随时间的图。实线和虚线代表数据(n＝3)的均值。阴影面积代表±2标准偏差。 图8为与以来自50x  106活细胞/mL的N-1灌注生物反应器的5.0x  106活细胞/mL接 种的10-L生产生物反应器(n＝2)(绿线)相比，以来自2.5x  106活细胞/mL的N-1灌注生物反 应器的0.5x  106细胞/mL接种的10-L生产生物反应器(n＝2)(红线)的活细胞密度随时间的 图。虚线代表用于生产生物反应器的稳态操作的目标活细胞密度。实线代表数据(n＝2)的 均值。阴影面积代表±2标准偏差。 图9为显示与以来自50x  106细胞/mL的N-1生物反应器的5.0x  106活细胞/mL接种 的10-L生产生物反应器(绿点)相比，以来自2.5x  106活细胞/mL的N-1灌注生物反应器的 0.5x  106活细胞/mL接种的10-L生产生物反应器(红点)的累积产品活性(单位/L)作为积分 的(integral)活细胞浓度的函数的图。所述点代表数据(n＝2)的均值，而误差棒代表±2标 准偏差。 发明详述 本文提供的是种子训练方法，其包括如下步骤：(a)将多个重组哺乳动物细胞在容 器内所包括的第一培养基中处理以提供第一细胞培养物；(b)分批培养所述第一细胞培养 物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL至约5.0x  106细胞/mL；(c)将一定体积的步骤(b) 的第一细胞培养物在灌注生物反应器内所包括的第二培养基中处理以提供具有初始细胞 密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约0.50x  106细胞/mL的第二细胞培养物；(d)灌注培养所 述第二细胞培养物至细胞密度范围为约5.0x  106细胞/mL至约120x  106细胞/mL；并(e)将一 定体积的步骤(d)的第二细胞培养物在生产生物反应器内所包括的第三培养基中处理以提 供具有初始细胞密度范围为约0.25x  106细胞/mL至约8.0x  106细胞/mL的生产细胞培养物。 本文描述的种子训练方法提供多种益处。在第一个方面，本种子训练方法与常规 的种子训练方法相比在提供生产细胞培养物(例如，减少小规模扩增阶段的数目)之前需要 较少的培养步骤(去除1至2个不同的培养步骤)，这又提供了较少的细胞培养的人工操纵和 减少的污染所述生产细胞培养物的风险。本文描述的种子训练方法可在12日中达到具有高 16 CN 111575225 A 说　明　书 14/44 页 的活细胞密度，例如，多至100x  106活细胞/mL的N-1细胞培养物(用于接种所述生产细胞培 养物的第二细胞培养物)而不折损所述生产细胞培养物中的培养物生长特性。使用本文描 述的种子训练方法在N-1培养物(第二细胞培养物)中实现的高的活细胞密度允许生产生物 反应器中生产细胞培养物中的更高的初始细胞密度。例如，本种子训练方法可用于达到约 0.50x  106活细胞/mL-10x  106活细胞/mL的初始细胞密度，这又导致生产细胞培养物达到所 述稳态生产细胞密度的时间量减少(例如，减少4-6日)。生产细胞培养物达到所述稳态生产 细胞密度的此时间量减少可提供50-日生产培养运行的总体生产力(productivity)增加 10％。本文提供的种子训练方法还可得到具有比由其他种子训练方法得到的生产细胞培养 物更高的体积生产速率和比生产速率的生产细胞培养物。 种子训练方法 本文提供的是种子训练方法，其相对于其他种子训练方法提供几种优势。这些种 子训练方法的非限制性方面在本文中描述，并可以任何组合使用。 提供第一细胞培养物 本文描述的种子训练方法包括(a)将多个重组哺乳动物细胞(例如，本文所述的或 本领域已知的任何重组哺乳动物细胞)在容器内所包括的第一培养基中处理以提供第一细 胞培养物的步骤。在一些实例中，在第一培养基中处理的多个重组哺乳动物细胞可为约 4.5x  107个细胞-约450x  107个细胞(例如，约9.0x  107个细胞-约450x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约450x  107个细胞，约45x  107个细胞-约450x  107个细胞，约67.5x  107个细胞- 约450x  107个细胞，约90x  107个细胞-约450x  107个细胞，约112.5x  107个细胞-约450x  107 个细胞，约135x  107个细胞-约450x  107个细胞，约157.5x  107个细胞-约450x  107个细胞， 约180x  107-约450x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约405x  107个细胞，约9.0x  107个细胞- 约405x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约405x  107个细胞，约45x  107-约405x  107个细胞， 约67.5x  107个细胞-约405x  107个细胞，约90x  107-约405x  107个细胞，约112.5x  107-约 405x  107个细胞，约135x  107个细胞-约405x  107个细胞，约157.5x  107个细胞-约405x  107 个细胞，约180x  107个细胞-约405x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约360x  107个细胞，约 9.0x  107个细胞-约360x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约360x  107个细胞，约45x  107个 细胞-约360x  107个细胞，约67.5x  107个细胞-约360x  107个细胞，约90x  107个细胞-约 360x  107个细胞，约112.5x  107个细胞-约360x  107个细胞，约135x  107个细胞-约360x  107 个细胞，约157.5x  107个细胞-约360x  107个细胞，约180x  107个细胞-约360x  107个细胞， 约4.5x  107个细胞-约315x  107个细胞，约9.0x  107个细胞-约315x  107个细胞/mL，约22.5x  107个细胞-约315x  107个细胞，约45x  107个细胞-约315x  107个细胞，约67.5x  107个细胞- 约315x  107个细胞，约90x  107个细胞-约315x  107个细胞，约112.5x  107个细胞至约315x  107个细胞，约135x107个细胞-约315x  107个细胞，约157.5x  107个细胞-约315x  107个细胞， 约180x  107个细胞-约315x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约270x  107个细胞，约9.0x  107 个细胞-约270x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约270x  107个细胞，约45x  107个细胞-约 270x  107个细胞，约67.5x  107个细胞-约270x  107个细胞，约90x  107个细胞-约270x  107个 细胞，约112.5x  107个细胞-约270x  107个细胞，约135x  107个细胞-约270x  107个细胞，约 157.5x  107个细胞-约270x  107个细胞，约180x  107个细胞-约270x  107个细胞，约4.5x  107 个细胞-约225x  107个细胞，约9.0x  107个细胞-约225x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约 17 CN 111575225 A 说　明　书 15/44 页 225x  107个细胞，约45x  107个细胞-约225x  107个细胞，约67.5x107个细胞-约225x  107个细 胞，约90x  107个细胞-约225x  107个细胞，约112.5x  107个细胞-约225x  107个细胞，135x  107个细胞-约225x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约180x  107个细胞，约9.0x  107个细胞- 约180x  107个细胞，约22.5x  107-约180x  107个细胞，约45x  107个细胞-约180x  107个细胞， 约67.5x  107-约180x  107个细胞，约90x  107-约180x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约135x  107个细胞，约9.0x  107-约135x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约135x  107个细胞，约45x  107个细胞-约135x  107个细胞，约4.5x  107个细胞-约90x  107个细胞，约9.0x  107个细胞-约 90x  107个细胞，约22.5x  107个细胞-约90x  107个细胞，或约45x  107-约90x  107个细胞)并 可取决于容器内所含的第一培养基的体积而变化。例如，在第一液体培养基中处理的多个 细胞可足以在第一细胞培养物中得到约0.10x  106细胞/mL-约0.80x  106细胞/mL(例如，约 0.10x  106细胞/mL-约0.75x  106细胞/mL，约0.10x  106细胞/mL-约0.70x  106细胞/mL，约 0.10x  106细胞/mL-约0.65x  106细胞/mL，约0.10x106细胞/mL-约0.60x  106细胞/mL，约 0.10x  106细胞/mL-约0.55x  106细胞/mL，约0.10x  106细胞/mL-约0.50x  106细胞/mL，约 0.10x  106细胞/mL-约0.45x  106细胞/mL，约0.10x  106细胞/mL-约0.40x  106细胞/mL，约 0.10x  106细胞/mL-约0.35x  106细胞/mL，约0.10x  106细胞/mL-约0.30x  106细胞/mL，约 0.15x  106细胞/mL-约0.80x  106细胞/mL，约0.15x  106细胞/mL-约0.75x  106细胞/mL，约 0.15x  106细胞/mL-约0.70x  106细胞/mL，约0.15x  106细胞/mL-约0.65x  106细胞/mL，约 0.15x  106细胞/mL-约0.60x  106细胞/mL，约0.15x106细胞/mL-约0.55x  106细胞/mL，约 0.15x  106细胞/mL-约0.50x  106细胞/mL，约0.15x  106细胞/mL-约0.45x  106细胞/mL，约 0.15x  106细胞/mL-约0.40x  106细胞/mL，约0.15x  106细胞/mL-约0.35x  106细胞/mL，约 0.20x  106细胞/mL-约0.80x  106细胞/mL，约0.20x  106细胞/mL-约0.75x  106细胞/mL，约 0.20x  106细胞/mL-约0.70x  106细胞/mL，约0.20x  106细胞/mL-约0.65x  106细胞/mL，约 0.20x  106细胞/mL-约0.60x  106细胞/mL，约0.20x  106细胞/mL-约0.55x  106细胞/mL，约 0.20x  106细胞/mL-约0.50x  106细胞/mL，约0.20x106细胞/mL-约0.45x  106细胞/mL，约 0.20x  106细胞/mL-约0.40x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.75x  106细胞/mL，约 0.25x  106细胞/mL-约0.70x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.65x  106细胞/mL，约 0.25x  106细胞/mL-约0.60x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.55x  106细胞/mL，约 0.25x  106细胞/mL-约0.50x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.45x  106细胞/mL，约 0.25x  106细胞/mL-约0.40x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.35x  106细胞/mL，约 0.30x  106细胞/mL-约0.80x  106细胞/mL，约0.30x106细胞/mL-约0.75x  106细胞/mL，约 0.30x  106细胞/mL-约0.70x  106细胞/mL，约0.30x  106细胞/mL-约0.65x  106细胞/mL，约 0.30x  106细胞/mL-约0.60x  106细胞/mL，约0.30x  106细胞/mL-约0.55x  106细胞/mL，约 0.30x  106细胞/mL-约0.50x  106细胞/mL，约0.30x  106细胞/mL-约0.45x  106细胞/mL，或约 0.30x  106-约0.40x  106细胞/mL)的初始细胞密度。 如本领域中可知的，步骤(a)中的容器可具有多种不同的体积。例如，步骤(a)中包 括第一培养基的容器可具有约0.50L至约200L(例如，约0.50L-约180L，约0.50L-约160L，约 0.50L-约140L，约0.50L-约120L，约0.50L-约100L，约0.50L-约90L，约0.50L-约80L，约 0.50L-约70L，约0.50L-约60L，约0.50L-约50L，约0.50L-约40L，约0.50L-约30L，约0.50L- 约20L，约0.50L-约10L，约0.50L-约5.0L，约1.0L-约200L，约1.0L-约180L，约1.0L-约160L， 18 CN 111575225 A 说　明　书 16/44 页 约1.0L-约140L，约1.0L-约120L，约1.0L-约100L，约1.0L-约90L，约1.0L-约80L，约1.0L-约 70L，约1.0L-约60L，约1.0L-约50L，约1.0L-约40L，约1.0L-约30L，约1.0L-约20L，约1.0L- 约10L，约1.0L-约5.0L，约1.5L-约200L，约1.5L-约180L，约1.5L-约160L，约1.5L-约140L， 约1.5L-约120L，约1.5L-约100L，约1.5L-约90L，约1.5L-约80L，约1.5L-约70L，约1.5L-约 60L，约1.5L-约50L，约1.5L-约40L，约1.5L-约30L，约1.5L-约20L，约1.5L-约10L，约1.5L- 约5.0L，约2.0L-约200L，约2.0L-约180L，约2.0L-约160L，约2.0L-约140L，约2.0L-约120L， 约2.0L-约100L，约2.0L-约90L，约2.0L-约80L，约2.0L-约70L，约2.0L-约60L，约2.0L-约 50L，约2.0L-约40L，约2.0L-约30L，约2.0L-约20L，约2.0L-约10L，约2.0L-约5.0L，约2.5L- 约200L，约2.5L-约180L，约2.5L-约160L，约2.5L-约140L，约2.5L-约120L，约2.5L-约100L， 约2.5L-约90L，约2.5L-约80L，约2.5L-约70L，约2.5L-约60L，约2.5L-约50L，约2.5L-约 50L，约2.5L-约40L，约2.5L-约30L，约2.5L-约20L，约2.5L-约10L，约2.5L-约5.0L，约5.0L- 约200L，约5.0L-约180L，约5.0L-约160L，约5.0L-约140L，约5.0L-约120L，约5.0L-约100L， 约5.0L-约90L，约5.0L-约80L，约5.0L-约70L，约5.0L-约60L，约5.0L-约50L，约5.0L-约 40L，约5.0L-约30L，约5.0L-约20L，或约5.0L-约10L)的内部体积。 如本领域中可知的，所述含有第一细胞培养物的容器可为本领域中用于培养哺乳 动物细胞的目的的任何装置(例如，烧瓶(例如，旋转瓶/摇瓶(spin  flask))、摇管或生物反 应器)。所述容器可包括用于搅动的内部手段/工具(例如，搅拌桨)或所述容器可外部搅动 (例如，通过使用旋转和/或倾斜平台)。所述容器可由不锈钢或塑胶(例如，塑胶无菌袋)制 成。在一些实施方案中，所述容器可为可丢弃的单次使用的生物反应器(例如，MilliporeTM Cellready  3L可丢弃的生物反应器、Pierre  Guerin  ATM1  NucleoTM  20L可丢弃 的生物反应器、Sartorius  Cultibag  STRTM  50L可丢弃的生物反应器、Sartorius  Cultibag  RMTM  20L、Sartorius  Cultibag  OrbitalTM  50L、GE  Wave生物反应器2/ 10System  5L、GE  Wave生物反应器20/50System  25L、GE  Wave生物反应器200System  200L 或GE  Wave生物反应器500/1000System  500L)。所述容器的内表面可具有至少一个涂层(例 如，明胶、胶原、多聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的至少一个涂层)，和如本领域中已 知的用于将O2、CO2和N2喷射入第一液体培养基的一个或多个端口(port)。所述容器可配备 有一个或多个传感器探针。当所述容器由非刚性塑胶材料(例如，塑胶无菌袋)组成时，所述 容器可连接至围绕并支持该容器的外部支持物。 所述第一细胞培养物可具有多种不同的体积，例如，第一细胞培养物可具有约 0.30L-约100L(例如，约0.30L-约90L，约0.30L-约80L，约0.30L-约70L，约0.30L-约60L，约 0.30L-约50L，约0.30L-约40L，约0.30L-约30L，约0.30L-约20L，约0.30L-约10L，约0.30L- 约5.0L，约0.50L-约100L，约0.50L-约90L，约0.50L-约80L，约0.50L-约70L，约0.50L-约 60L，约0.50L-约50L，约0.50L-约40L，约0.50L-约30L，约0.50L-约20L，约0.50L-约10L，约 0.50L-约5.0L，约1.0L-约100L，约1.0L-约90L，约1.0L-约80L，约1.0L-约70L，约1.0L-约 60L，约1.0L-约50L，约1.0L-约40L，约1.0L-约30L，约1.0L-约20L，约1.0L-约10L，约1.0L- 约5.0L，约1.5L-约100L，约1.5L-约90L，约1.5L-约80L，约1.5L-约70L，约1.5L-约60L，约 1.5L-约50L，约1.5L-约40L，约1.5L-约30L，约1.5L-约20L，约1.5L-约10L，约1.5L-约5.0L， 约2.0L-约100L，约2.0L-约90L，约2.0L-约80L，约2.0L-约70L，约2.0L-约60L，约2.0L-约 50L，约2.0L-约40L，约2.0L-约30L，约2.0L-约20L，约2.0L-约10L，约2.0L-约5.0L，约2.5L- 19 CN 111575225 A 说　明　书 17/44 页 约100L，约2.5L-约90L，约2.5L-约80L，约2.5L-约70L，约2.5L-约60L，约2.5L-约50L，约 2.5L-约40L，约2.5L-约30L，约2.5L-约20L，约2.5L-约10L，约2.5L-约5.0L，约5.0L-约 100L，约5.0L-约90L，约5.0L-约80L，约5.0L-约70L，约5.0L-约60L，约5.0L-约50L，约5.0L- 约40L，约5.0L-约30L，约5.0L-约20L，或约5.0L-约10L)的体积。 如本领域中可知的，存在可在容器内所含的第一培养基处理多个细胞的多种方 式。例如，处理所述多个重组哺乳动物细胞可包括将冷冻的细胞库解冻(例如，本文所述或 本领域已知的任何例示性冷冻的细胞库)并将一定体积的解冻的细胞库在所述第一培养基 中处理(例如，无菌移液)的步骤。冷冻的细胞库可具有例如，约1.0x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL(例如，约2.0x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约5.0x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约10x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约15x  107细胞/mL-约100x  107细胞/ mL，约20x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约25x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约30x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约35x  107细胞/mL-约100x  107细胞/mL，约40x  107细胞/ mL-约100x  107细胞/mL，约1.0x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约2.0x  107细胞/mL-约 90x  107细胞/mL，约5.0x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约10x  107细胞/mL-约90x  107细 胞/mL，约15x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约20x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约 25x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约30x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约35x  107细 胞/mL-约90x  107细胞/mL，约40x  107细胞/mL-约90x  107细胞/mL，约1.0x  107细胞/mL-约 80x  107细胞/mL，约2.0x  107细胞/mL-约80x  107细胞/mL，约5.0x  107细胞/mL-约80x  107细 胞/mL，约10x  107-约80x  107细胞/mL，约15x  107细胞/mL-约80x  107细胞/mL，约20x  107细 胞/mL-约80x  107细胞/mL，约25x  107细胞/mL-约80x  107细胞/mL，约30x  107细胞/mL-约 80x  107细胞/mL，约35x  107细胞/mL-约80x  107细胞/mL，约40x  107细胞/mL-约80x  107细 胞/mL，约1.0x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约2.0x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约 5.0x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约10x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约15x  107细 胞/mL-约70x  107细胞/mL，约20x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约25x  107细胞/mL-约 70x  107细胞/mL，约30x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约35x  107细胞/mL-约70x  107细 胞/mL，约40x  107细胞/mL-约70x  107细胞/mL，约1.0x  107细胞/mL-约60x  107细胞/mL，约 2.0x  107细胞/mL-约60x  107细胞/mL，约5.0x  107-约60x  107细胞/mL，约10x  107细胞/mL- 约60x  107细胞/mL，约15x  107细胞/mL-约60x  107细胞/mL，约20x  107细胞/mL-约60x  107细 胞/mL，约25x  107细胞/mL-约60x  107细胞/mL，约30x  107-约60x  107细胞/mL，约35x  107细 胞/mL-约60x  107细胞/mL，约40x  107细胞/mL-约60x  107细胞/mL，约1.0x  107细胞/mL-约 50x  107细胞/mL，约2.0x  107细胞/mL-约50x  107细胞/mL，约5.0x  107细胞/mL-约50x  107细 胞/mL，约10x  107细胞/mL-约50x  107细胞/mL，约15x  107细胞/mL-约50x  107细胞/mL，约 20x  107细胞/mL-约50x  107细胞/mL，约25x  107细胞/mL-约50x  107细胞/mL，或约30x  107细 胞/mL-约50x  107细胞/mL)的细胞密度范围。用于产生所述冷冻的细胞库的方法是本领域 中已知的(参见，例如，2013年3月15日提交的美国临时专利申请系列号61/793,021；2014年 3月14日提交的美国专利申请系列号14/212,607；和2014年3月14日提交的国际申请号PCT/ US2014/027757)。如本领域中已知的，可例如通过将冷冻的细胞库暴露于加热元件(除暴露 于室温外)，例如，水浴或块状加热器(例如，设定在30℃或37℃)来实施冷冻的细胞库的解 冻。在一些实例中，所述解冻可实施1秒-1分钟，1秒-55秒，1秒-50秒，1秒-45秒，1秒-40秒，1 20 CN 111575225 A 说　明　书 18/44 页 秒-35秒，1秒-30秒，1秒-25秒，或1秒-20秒的时间)。冷冻的细胞库还可通过将所述冷冻的 细胞库暴露于室温(例如，约25℃)来解冻。解冻的细胞库可含有例如至少60％(例如，至少 65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％)的活细胞 百分比。例如，解冻的细胞库可含有60％-约98％(例如，约60％-约95％，约60％-约90％，约 60％-约85％，约60％-约80％，约60％-约75％，约60％-约70％，约65％-约98％，约65％-约 95％，约65％-约90％，约65％-约85％，约65％-约80％，约65％-约75％，约70％-约98％，约 70％-约95％，约70％-约90％，约70％-约85％，约70％-约80％，约80％-约98％，约80％-约 95％，约80％-约90％，约85％-约98％，约85％-约95％，约90％-约98％，或约90％-约95％) 的活细胞百分比。 在一些实例中，在第一培养基中处理多个重组哺乳动物细胞以生成所述第一细胞 培养物可包括将一定体积的包含所述多个重组哺乳动物细胞的第三细胞培养物在所述第 一培养基中处理的步骤。例如，在第一培养基中处理的所述第三培养物的体积可为，例如， 0.10mL-约10L(例如，约0.10mL-约8.0L，约0.10mL-约6.0L，约0.10mL-约4.0L，约0.10mL-约 2.0L，约0.10mL-约1.0L，约0.10mL-约800mL，约0.10mL-约600mL，约0.10mL-约400mL，约 0.10mL-约200mL，约0.10mL-约100mL，约0.10mL-约50mL，约0.10mL-约25mL，约0.10mL-约 10mL，约0.50mL-约10L，约0.50mL-约8.0L，约0.50mL-约6.0L，约0.50mL-约4.0L，约0.50mL- 约2.0L，约0.50mL-约1.0L，约0.50mL-约1.0L，约0.50mL-约800mL，约0.50mL-约600mL，约 0.50mL-约400mL，约0.50mL-约200mL，约0.50mL-约100mL，约0.50mL-约50mL，约0.50mL-约 50mL，约0.50mL-约25mL，约1.0mL-约10L，约1.0mL-约8.0L，约1.0mL-约6.0L，约1.0mL-约 4.0L，约1.0mL-约2.0L，约1.0mL-约1.0L，约1.0mL-约800mL，约1.0mL-约600mL，约1.0mL-约 400mL，约1.0mL-约200mL，约0.10mL-约100mL，约1.0mL-约50mL，约1.0mL-约25mL，约2.0mL- 约10L，约2.0mL-约8.0L，约2.0mL-约6.0L，约2.0mL-约4.0L，约2.0mL-约2.0L，约2.0mL-约 1.0L，约2.0mL-约800mL，约2.0mL-约600mL，约2.0mL-约400mL，约2.0mL-约200mL，约2.0mL- 约100mL，约2.0mL-约50mL，约2.0mL-约25mL，约5.0mL-约10L，约5.0mL-约8.0L，约5.0mL-约 6.0L，约5.0mL-约4.0L，约5.0mL-约2.0L，约5.0mL-约1.0L，约5.0mL-约800mL，约5.0mL-约 600mL，约5.0mL-约400mL，约5.0mL-约200mL，约5.0mL-约100mL，约5.0mL-约50mL，约5.0mL- 约25.0mL，约10.0mL-约10L，约10.0mL-约8.0L，约10.0mL-约6.0L，约10.0mL-约4.0L，约 10.0mL-约2.0L，约10.0mL-约1.0L，约10.0mL-约800mL，约10.0mL-约600mL，约10.0mL-约 400mL，约10.0mL-约200mL，约10.0mL-约100mL，约10.0mL-约50mL，或约10.0mL-约25.0mL)。 在第一培养基中处理的所述第三培养物的细胞密度可为本文所述的任何例示性细胞密度 或细胞密度范围。如本领域的技术人员可知的，足以生成具有约0.10x  106细胞/mL至约 0.80x  106细胞/mL(或对于上述第一细胞培养物列出的初始细胞密度的任何其他例示性范 围)的初始细胞密度的第一细胞培养物的第三培养物的体积可由第三细胞培养物的细胞密 度和容器中存在的第一液体培养基的体积(在将第三细胞培养物在第一培养基中处理之 前)确定。 使用第三细胞培养物的一些实施方案可包括如下步骤：(1)将多个所述重组哺乳 动物细胞在容器内所包括的第四培养基中处理以提供所述第三细胞培养物，和(2)分批培 养(1)中的第三细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL-约15.0x  106细胞/mL(例 如，约1.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约10.0x  106细胞/mL， 21 CN 111575225 A 说　明　书 19/44 页 约1.0x  106细胞/mL-约7.5x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约2.5x  106细胞/mL，约1.5x  106细胞/mL-约15.0x  106细胞/mL，约1.5x  106细 胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约1.5x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约1.5x  106细胞/mL- 约7.5x  106细胞/mL，约1.5x  106细胞/mL-约5.0x106细胞/mL，约1.5x  106细胞/mL-约2.5x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约15x106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/ mL，约2.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约7.5x  106细胞/mL，约 2.0x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约2.5x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约15x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约2.5x  106细 胞/mL-约10x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约7.5x106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约 5.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约15x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约7.5x  106细胞/ mL，约7.5x  106细胞/mL-约15x  106细胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约 7.5x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约15x  106细胞/mL，或约10x  106 细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL)，其中将一定体积的(2)中的第三细胞培养物在第一培养基 中处理以生成第一细胞培养物。在第四培养基中处理的多个细胞可为，例如，约0.10x  107 细胞-约20x  107细胞(例如，约0.10x  107细胞-约15x  107细胞，约0.10x  107细胞-约10x  107 细胞，约0.10x  107细胞-约5.0x  107细胞，约0.10x  107细胞-约2.0x  107细胞，约0.10x  107 细胞-约1.0x  107细胞，约0.10x  107细胞-约0.50x  107细胞，约0.20x  107细胞-约20x  107细 胞，约0.20x  107细胞-约15x  107细胞，约0.20x  107细胞-约10x  107细胞，约0.20x  107细胞- 约5.0x  107细胞，约0.20x  107细胞-约2.0x  107细胞，约0.20x  107细胞至约1.0x  107细胞， 约0.20x  107细胞-约0.50x  107细胞，约0.40x  107细胞-约20x  107细胞，约0.40x  107细胞- 约15x  107细胞，约0.40x  107细胞至约10x  107细胞，约0.40x  107细胞-约5.0x107细胞，约 0.40x  107细胞-约2.0x  107细胞，约0.40x  107细胞-约1.0x  107细胞，约0.60x  107细胞-约 20x  107细胞，约0.60x  107细胞-约15x  107细胞，约0.60x  107细胞-约10x  107细胞，约0.60x  107细胞-约5x  107细胞，约0.60x  107细胞-约2x  107细胞，约0.60x  107细胞-约1x  107细胞， 约0.80x  107细胞-约1.0x  107细胞，约1.0x  107细胞-约20x  107细胞，约1.0x  107细胞-约 15x  107细胞，约1.0x  107细胞-约10x  107细胞，约1.0x  107细胞-约5.0x  107细胞，约1.0x  107细胞-约2.0x  107细胞，约5.0x  107细胞-约20x  107细胞，约5.0x  107细胞-约15x  107细 胞，或约5.0x  107细胞-约10x  107细胞)并可取决于所述容器中含有的第四培养基的体积而 变化。例如，在第三液体培养基中处理的多个细胞可足以在第三细胞培养物中得到约0.10x  106细胞/mL至约0.80x  106细胞/mL的初始细胞密度(例如，上述对于第一细胞培养物列出的 初始细胞密度的任何例示性初始细胞密度或初始细胞密度范围)。 在一些实施方案中，在第四培养基中处理多个重组哺乳动物细胞以生成第三细胞 培养物的步骤可包括将冷冻的细胞库解冻和将一定体积的解冻的细胞库在所述第四培养 基中处理的步骤。在所述实施方案中，所述冷冻的细胞库可具有对于本文所述冷冻的细胞 库的任何细胞密度或细胞密度范围。所述冷冻的细胞库可使用本文所述或本领域已知的任 何方法来解冻。所得的解冻的细胞库可具有对于本文所述的解冻的细胞库的任何活细胞百 分比或任何活细胞百分比范围。 含有第三细胞培养物的容器的内部体积可为，例如，约0.20L-约30L(例如，约 22 CN 111575225 A 说　明　书 20/44 页 0 .20L-约20L，约0.20L-约10L，约0.20L-约5.0L，约0.20L-约2.5L，约0.50L-约30L，约 0.50L-约20L，约0.50L-约10L，约0.50L-约5.0L，约0.50L-约2.5L，约1.0L-约30L，约1.0L- 约20L，约1.0L-约10L，约1.0L-约5.0L，约1.0L-约2.5L，约2.0L-约30L，约2.0L-约20L，约 2.0L-约10L，约2.0L-约5.0L，约5.0L-约30L，约5.0L-约20L，约5.0L-约10L，约10L-约30L， 或约10L-约20L)。第四培养基可具有例如，约0.10L至约20L的体积(例如，约0.10L-约20L， 约0.10L-约15L，约0.10L-约10L，约0.10L-约5.0L，约0.20L-约20L，约0.20L-约15L，约 0.20L-约10L，约0.20L-约5.0L，约0.50L-约20L，约0.50L-约15L，约0.50L-约10L，约0.50L- 约5.0L，约1.0L-约20L，约1.0L-约15L，约1.0L-约10L，约1.0L-约5.0L，约1.5L-约20L，约 1.5L-约15L，约1.5L-约10L，约1.5L-约5.0L，约2.0L-约25L，约2.0L-约20L，约2.0L-约15L， 约2.0L-约10L，约2.0L-约5.0L，约5.0L-约20L，约5.0L-约15L，约5.0L-约10L，约10L-约 20L，或约10L-约15L)。 如本领域中可知的，含有所述第三细胞培养物的容器可为本领域用于培养哺乳动 物细胞的目的的任何装置(例如，烧瓶(例如，旋转瓶/摇瓶)、摇管或生物反应器)。所述容器 可包括用于搅动的内部手段/工具(例如，搅拌桨)或所述容器可外部搅动(例如，通过使用 旋转和/或倾斜平台)。所述容器可由不锈钢或塑胶(例如，塑胶无菌袋)制成。在一些实施方 案中，所述容器可为可丢弃的单次使用的生物反应器(例如，任何本文所述的可丢弃的单次 使用的生物反应器)。灌注生物反应器的内表面可具有至少一个涂层(例如，明胶、胶原、多 聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的至少一个涂层)，和如本领域中已知的用于将O2、CO2 和N2喷射入第三液体培养基的一个或多个端口。所述容器可配备有一个或多个传感器探 针。当所述容器由非刚性塑胶材料(例如，塑胶无菌袋)组成时，所述容器可由外部结构围绕 和支持。 本文中所述的每个处理步骤可使用无菌移液器(例如，组织培养罩(tissue  culture  hood)中的无菌移液)实施。 所述第一细胞培养物的分批培养 在步骤(a)中提供所述第一细胞培养物之后，本文所述的种子训练方法包括(b)分 批培养所述第一细胞培养物至细胞密度范围为约1.0x  106细胞/mL-约20.0x  106细胞/mL (例如，约1.0x  106细胞/mL-约17.5x  106细胞/mL，约1.0x106细胞/mL-约15.0x  106细胞/ mL，约1.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约10.0x  106细胞/mL， 约1.0x  106细胞/mL-约7.5x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约2.5x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约20.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细 胞/mL-约17.5x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约15.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/ mL-约12.5x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约10.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL- 约7.5x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约 20.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约17.5x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约 15.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约 10.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约7.5x  106细胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约20.0x  106细胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约17.5x  106细胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约15.0x  106细 胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约7.5x  106细胞/mL-约10.0x  106细胞/ mL,10.0x  106细胞/mL-约20.0x  106细胞/mL，约10.0x  106细胞/mL-约17.5x  106细胞/mL， 23 CN 111575225 A 说　明　书 21/44 页 约10.0x  106细胞/mL-约15.0x  106细胞/mL，约10.0x  106细胞/mL-约12.5x  106细胞/mL，约 12.5x106细胞/mL-约20.0x  106细胞/mL，约12.5x  106细胞/mL-约17.5x  106细胞/mL，或约 12.5x  106细胞/mL-约15.0x  106细胞/mL)的步骤。用于确定细胞密度的多种不同的方法是 本领域中已知的(例如，使用光显微镜和血细胞计数器或使用自动细胞计数器，如，例如， 自动细胞计数器(Lif e  T e c h n o l o g i e s)、 (N e x c e l o m  Bioscience)、Luna  TM自动细胞计数器(Logos  Biosystems)或 细胞活力分析仪)。 所述第一细胞培养物的分批培养不包括将大量或显著量的液体培养基添加至所 述第一细胞培养物，且不包括在培养过程中将大量或显著量的所述第一培养基去除。所述 分批培养可使用本文所述的任何例示性温度和/或CO2气体暴露来实施。所述分批培养可使 用本领域已知的任何O2和/或N2气体暴露来实施。所述分批培养还可包括本文所述的任何类 型的搅动。如本领域的技术人员可知的，分批培养所述第一细胞培养物以达到约1.0x  106 细胞/mL至约20.0x  106细胞/mL(或本文所述的任何其他细胞密度或细胞密度范围)的目标 细胞密度的时间长度会取决于所述重组哺乳动物细胞的生长速率和第一细胞培养物的初 始细胞密度。例如，可将所述第一细胞培养物培养约1日-约9日(例如，约1日-约8日，约1日- 约7日，约1日-约6日，约1日-约5日，约1日-约4日，约1日-约3日，约2日-约9日，约2日-约8 日，约2日-约7日，约2日-约6日，约2日-约5日，约2日-约4日，约3日-约9日，约3日-约8日，约 3日-约7日，约3日-约6日，约3日-约5日，约4日-约9日，约4日-约8日，约4日-约7日，约4日- 约6日，约5日-约9日，约5日-约8日，约5日-约7日，约6日-约9日，约6日-约8日，或约7日-约9 日)的时间。可用于本方法的分批培养的其他例示性参数在本文中描述。 提供第二细胞培养物 本文所述的种子训练方法进一步包括(c)将一定体积的步骤(b)的第一细胞培养 物在灌注生物反应器内所包括的第二培养基中处理以提供具有初始细胞密度范围为约 0.10x  106细胞/mL至约0.8x  106细胞/mL(例如，对于上述第一细胞培养物所述的任何初始 细胞密度或初始细胞密度范围)的第二细胞培养物的步骤。如本领域的技术人员可知的，在 第二培养基中处理以达到对于所述第二细胞培养物约0.10x  106细胞/mL-约0.80x  106细 胞/mL的初始细胞密度范围的第一细胞培养物的适当体积可由所述第一细胞培养物的细胞 密度和第二培养基的体积确定。在第二培养基中处理的第一细胞培养物的体积可为，例如， 0.30L-约100L(例如，约0.30L-约90L，约0.30L-约80L，约0.30L-约70L，约0.30L-约60L，约 0.30L-约50L，约0.30L-约40L，约0.30L-约30L，约0.30L-约20L，约0.30L-约10L，约1.0L-约 100L，约1.0L-约90L，约1.0L-约80L，约1.0L-约70L，约1.0L-约60L，约1.0L-约50L，约1.0L- 约40L，约1.0L-约30L，约1.0L-约20L，约1.0L-约10L，约2.5L-约100L，约2.5L-约90L，约 2.5L-约80L，约2.5L-约70L，约2.5L-约60L，约2.5L-约50L，约2.5L-约40L，约2.5L-约30L， 约2.5L-约20L，约2.5L-约10L，约5.0L-约100L，约5.0L-约90L，约5.0L-约80L，约5.0L-约 70L，约5.0L-约60L，约5.0L-约50L，约5.0L-约40L，约5.0L-约30L，约5.0L-约20L，约5.0L- 约10L，约15L-约100L，约15L-约90L，约15L-约80L，约15L-约70L，约15L-约70L，约15L-约 60L，约15L-约50L，约15L-约40L，约15L-约30L，约15L-约20L，约20L-约100L，约20L-约90L， 约20L-约80L，约20L-约70L，约20L-约60L，约20L-约50L，约20L-约40L，约30L-约100L，约 30L-约90L，约30L-约80L，约30L-约70L，约30L-约60L，约30L-约50L，约40L-约100L，约40L- 24 CN 111575225 A 说　明　书 22/44 页 约90L，约40L-约80L，约40L-约70L，约40L-约60L，约50L-约100L，约50L-约90L，约50L-约 80L，约50L-约70L，约60L-约100L，约60L-约90L，约60L-约80L，约70L-约100L，约70L-约 90L，或约80L-约100L)。 第二细胞培养物的体积可为，例如，2.0L-800L(例如，约2.0L-约750L，约2.0L-约 700L，约2.0L-约650L，约2.0L-约600L，约2.0L-约550L，约2.0L-约550L，约2.0L-约500L，约 2.0L-约450L，约2.0L-约400L，约2.0L-约350L，约2.0L-约300L，约2.0L-约250L，约2.0L-约 200L，约2.0L-约150L，约2.0L-约100L，约2.0L-约50L，约2.0L-约25L，约5.0L-约800L，约 5.0L-约750L，约5.0L-约700L，约5.0L-约650L，约5.0L-约600L，约5.0L-约550L，约5.0L-约 500L，约5.0L-约450L，约5.0L-约400L，约5.0L-约350L，约5.0L-约300L，约5.0L-约250L，约 5.0L-约200L，约5.0L-约150L，约5.0L-约100L，约5.0L-约50L，约5.0L-约25L，约10L-约 800L，约10L-约750L，约10L-约700L，约10L-约650L，约10L-约600L，约10L-约550L，约10L- 约500L，约10L-约450L，约10L-约400L，约10L-约350L，约10L-约300L，约10L-约300L，约 10L-约250L，约10L-约200L，约10L-约150L，约10L-约100L，约10L-约50L，约10L-约25L，约 15L-约800L，约15L-约750L，约15L-约700L，约15L-约600L，约15L-约550L，约15L-约500L， 约15L-约450L，约15L-约400L，约15L-约350L，约15L-约300L，约15L-约250L，约15L-约 200L，约15L-约150L，约15L-约100L，约15L-约50L，约15L-约25L，约20L-约800L，约20L-约 750L，约20L-约700L，约20L-约650L，约20L-约600L，约20L-约550L，约20L-约500L，约20L- 约450L，约20L-约400L，约20L-约350L，约20L-约300L，约20L-约250L，约20L-约200L，约 20L-约150L，约20L-约100L，约20L-约50L，约25L-约800L，约25L-约750L，约25L-约700L，约 25L-约650L，约25L-约600L，约25L-约550L，约25L-约500L，约25L-约450L，约25L-约400L， 约25L-约350L，约25L-约300L，约25L-约250L，约25L-约200L，约25L-约150L，约25L-约 100L，约25L-约50L，约50L-约800L，约50L-约750L，约50L-约700L，约50L-约650L，约50L-约 600L，约50L-约550L，约50L-约500L，约50L-约450L，约50L-约400L，约50L-约350L，约50L- 约300L，约50L-约250L，约50L-约200L，约50L-约150L，约50L-约100L，约75L-约800L，约 75L-约750L，约75L-约700L，约75L-约650L，约75L-约600L，约75L-约550L，约75L-约500L， 约75L-约450L，约75L-约400L，约75L-约350L，约75L-约300L，约75L-约250L，约75L-约 200L，约75L-约150L，约75L-约100L，约100L-约800L，约100L-约750L，约100L-约700L，约 100L-约650L，约100L-约600L，约100L-约550L，约100L-约500L，约100L-约450L，约100L-约 400L，约100L-约350L，约100L-约300L，约100L-约250L，约100L-约200L，约100L-约150L，约 150L-约800L，约150L-约750L，约150L-约700L，约150L-约650L，约150L-约600L，约150L-约 550L，约150L-约500L，约150L-约450L，约150L-约400L，约150L-约350L，约150L-约300L，约 150L-约250L，约150L-约200L，约200L-约800L，约200L-约750L，约200L-约700L，约200L-约 650L，约200L-约600L，约200L-约550L，约200L-约500L，约200L-约450L，约200L-约400L，约 200L-约350L，约200L-约300L，约200L-约250L，约250L-约800L，约250L-约750L，约250L-约 700L，约250L-约650L，约250L-约600L，约250L-约550L，约250L-约500L，约250L-约450L，约 250L-约400L，约250L-约350L，约250L-约300L，约300L-约800L，约300L-约750L，约300L-约 700L，约300L-约650L，约300L-约600L，约300L-约550L，约300L-约500L，约300L-约450L，约 300L-约400L，约300L-约350L，约350L-约800L，约350L-约750L，约350L-约700L，约350L-约 650L，约350L-约600L，约350L-约550L，约350L-约500L，约350L-约450L，约350L-约400L，约 25 CN 111575225 A 说　明　书 23/44 页 400L-约800L，约400L-约750L，约400L-约700L，约400L-约650L，约400L-约600L，约400L-约 550L，约400L-约500L，约400L-约450L，约450L-约800L，约450L-约750L，约450L-约700L，约 450L-约650L，约450L-约600L，约450L-约550L，约450L-约500L，约500L-约800L，约500L-约 750L，约500L-约700L，约500L-约650L，约500L-约600L，约500L-约650L，约550L-约800L，约 550L-约750L，约550L-约700L，约550L-约650L，约550L-约600L，约600L-约800L，约600L-约 750L，约600L-约700L，约600L-约650L，约650L-约800L，约650L-约750L，约650L-约700L，约 700L-约800L，约700L-约750L，或约750L-约800L)。 灌注生物反应器可为本文所述或本领域已知的任何例示性灌注生物反应器。例 如，灌注生物反应器可由不锈钢或塑胶制成(例如，塑胶无菌袋)。灌注生物反应器的内表面 可具有至少一个涂层(例如，明胶、胶原、多聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的至少一 个涂层)，和如本领域中已知的用于将O2、CO2和N2喷射入液体培养基的一个或多个端口，和 用于搅动液体培养基的搅拌机构。所述灌注生物反应器还可配备有能够将一定体积的第二 液体培养基从生物反应器去除的机械装置，和任选的在将第二液体培养基转移出生物反应 器的过程中将细胞从第二液体培养基去除的机械装置内的过滤器(例如，交替的切向流 (ATF)、切向流过滤(TFF)系统，或美国临时专利申请号61/878,502中所述的过滤系统)。所 述生物反应器还可配备有一个或多个泵，和容纳去除的第二培养基和待灌注入所述灌注生 物反应器的新培养基的一个或多个储库(reservoir)。 灌注生物反应器可具有例如约5.0L-约2,000L(例如，约5.0L-约1,900L，约5.0L- 约1,800L，约5.0L-约1,700L，约5.0L-约1,600L，约5.0L-约1,500L，约5.0L-约1,400L，约 5.0L-约1,300L，约5.0L-约1,200L，约5.0L-约1,100L，约5.0L-约1,000L，约5.0L-约900L， 约5.0L-约800L，约5.0L-约700L，约5.0L-约600L，约5.0L-约500L，约5.0L-约400L，约5.0L- 约300L，约5.0L-约200L，约5.0L-约100L，约5.0L-约50L，约100L-约2,000L，约100L-约1, 900L，约100L-约1,800L，约100L-约1,700L，约100L-约1,600L，约100L-约1,500L，约100L- 约1,400L，约100L-约1,300L，约100L-约1,200L，约100L-约1,100L，约100L-约1,000L，约 100L-约900L，约100L-约800L，约100L-约700L，约100L-约600L，约100L-约500L，约100L-约 400L，约100L-约300L，约100L-约200L，约150L-约2,000L，约150L-约1,900L，约150L-约1, 800L，约150L-约1,700L，约150L-约1,600L，约150L-约1,500L，约150L-约1,400L，约150L- 约1,300L，约150L-约1,300L，约150L-约1,200L，约150L-约1,100L，约150L-约1,000L，约 150L-约900L，约150L-约800L，约150L-约700L，约150L-约600L，约150L-约500L，约150L-约 400L，约150L-约300L，约150L-约200L，约200L-约2,000L，约200L-约1,900L，约200L-约1, 800L，约200L-约1,700L，约200L-约1,600L，约200L-约1,500L，约200L-约1,400L，约200L- 约1,300L，约200L-约1,200L，约200L-约1,100L，约200L-约1,000L，约200L-约900L，约 200L-约800L，约200L-约700L，约200L-约600L，约200L-约500L，约200L-约400L，约200L-约 300L，约300L-约2,000L，约300L-约1,900L，约300L-约1,800L，约300L-约1,700L，约300L- 约1,600L，约300L-约1,500L，约300L-约1,400L，约300L-约1,300L，约300L-约1,200L，约 300L-约1,100L，约300L-约1,000L，约300L-约900L，约300L-约800L，约300L-约700L，约 300L-约600L，约300L-约500L，约300L-约400L，约400L-约2,000L，约400L-约1,900L，约 400L-约1,800L，约400L-约1,800L，约400L-约1,700L，约400L-约1,600L，约400L-约1, 500L，约400L-约1,400L，约400L-约1,300L，约400L-约1,200L，约400L-约1,100L，约400L- 26 CN 111575225 A 说　明　书 24/44 页 约1,000L，约400L-约900L，约400L-约800L，约400L-约700L，约400L-约600L，约400L-约 500L，约500L-约2,000L，约500L-约1,900L，约500L-约1,800L，约500L-约1,700L，约500L- 约1,600L，约500L-约1,500L，约500L-约1,400L，约500L-约1,300L，约500L-约1,200L，约 500L-约1,100L，约500L-约1,000L，约500L-约900L，约500L-约800L，约500L-约700L，约 500L-约600L，约600L-约2,000L，约600L-约1,900L，约600L-约1,800L，约600L-约1,700L， 约600L-约1,600L，约600L-约1,500L，约600L-约1,400L，约600L-约1,300L，约600L-约1, 200L，约600L-约1,100L，约600L-约1,000L，约600L-约900L，约600L-约800L，约600L-约 700L，约700L-约2,000L，约700L-约1,900L，700L-约1,800L，约700L-约1,700L，约700L-约 1,600L，约700L-约1,500L，约700L-约1,400L，约700L-约1,300L，约700L-约1,200L，约 700L-约1,100L，约700L-约1,000L，约700L-约900L，约700L-约800L，800L-约2,000L，约 800L-约1,900L，约800L-约1,800L，约800L-约1,700L，约800L-约1,600L，约800L-约1, 500L，约800L-约1,400L，约800L-约1,300L，约800L-约1,200L，约800L-约1,100L，约800L- 约1,000L，约800L-约900L，约1,000L至约2,000L，约1,000L至约1,750L，约1,000L至约1, 500L，约1,000L至约1,250L，约1,250L至约2,000L，约1,250L至约1,750L，约1,250L至约1, 500L，约1,500L至约2,000L，约1,500L至约1,750L，或约1,750L至约2,000L)的内部体积。 第二细胞培养物的灌注培养 本文所述的种子训练方法进一步包括(d)灌注培养所述第二细胞培养物至约5.0x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL(例如，约5.0x  106细胞/mL-约130x106细胞/mL，约5.0x  106 细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/ mL-约100x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约 80x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约70x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约60x  106细 胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约40x  106细胞/mL，约 5.0x  106细胞/mL-约30x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约20x  106细胞/mL，约5.0x  106 细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL- 约130x  106细胞/mL，约10x106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约110x  106 细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL， 约10x  106细胞/mL-约80x  106细胞/mL，约10x  106-约70x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL- 约60x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约40x  106细 胞/mL，约10x  106细胞/mL-约30x  106细胞/mL，约10x  106细胞/mL-约20x  106细胞/mL，约 15x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约15x106细 胞/mL-约120x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约 100x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约80x  106细 胞/mL，约15x  106细胞/mL-约70x106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约60x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约40x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL- 约30x  106细胞/mL，约15x  106细胞/mL-约20x  106细胞/mL，约20x106细胞/mL-约140x  106细 胞/mL，约20x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约 20x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约20x  106细 胞/mL-约90x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约80x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约 70x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约60x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约50x  106细 27 CN 111575225 A 说　明　书 25/44 页 胞/mL，约20x  106细胞/mL-约40x  106细胞/mL，约20x  106细胞/mL-约30x  106细胞/mL，约 25x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约25x  106细 胞/mL-约120x106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约 100x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约80x  106细 胞/mL，约25x  106细胞/mL-约70x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约60x  106细胞/mL，约 25x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约25x  106细胞/mL-约40x  106细胞/mL，约25x  106细 胞/mL-约30x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约 130x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约110x  106 细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL， 约30x  106细胞/mL-约80x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约70x  106细胞/mL，约30x  106细 胞/mL-约60x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约30x  106细胞/mL-约 40x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约130x  106细 胞/mL，约40x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约40x106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约 40x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约40x  106细 胞/mL至约80x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约70x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约 60x  106细胞/mL，约40x  106细胞/mL-约50x  106细胞/mL，约50x  106细胞/mL-约140x  106细 胞/mL，约50x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约50x106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约 50x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约50x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约50x  106细 胞/mL-约90x  106细胞/mL，约50x  106细胞/mL-约80x  106细胞/mL，约50x  106细胞/mL-约 70x106细胞/mL，约50x  106细胞/mL-约60x  106细胞/mL，约60x  106细胞/mL-约140x  106细 胞/mL，约60x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约60x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约 60x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约60x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约60x  106细 胞/mL-约90x  106细胞/mL，约60x  106细胞/mL-约80x  106细胞/mL，约60x  106细胞/mL-约 70x  106细胞/mL，约70x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约70x  106细胞/mL-约130x  106细 胞/mL，约70x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约70x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约 70x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约70x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约70x  106细 胞/mL-约80x  106细胞/mL，约80x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约80x  106细胞/mL-约 130x106细胞/mL，约80x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约80x  106细胞/mL-约110x  106细 胞/mL，约80x  106细胞/mL-约100x  106细胞/mL，约80x  106细胞/mL-约90x  106细胞/mL，约 90x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约90x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约90x  106细 胞/mL-约120x  106细胞/mL，约90x  106细胞/mL-约110x  106细胞/mL，约90x  106细胞/mL-约 100x106细胞/mL，约100x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约100x  106细胞/mL-约130x  106 细胞/mL，约100x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约100x  106细胞/mL-约110x  106细胞/ mL，约110x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约110x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约 110x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，约110x  106细胞/mL-约120x  106细胞/mL，约120x  106细胞/mL-约140x  106细胞/mL，约120x  106细胞/mL-约130x  106细胞/mL，或约130x106细 胞/mL-约140x  106细胞/mL)的细胞密度的步骤。 [0200] 灌注培养是本领域已知的且该步骤包括从灌注生物反应器去除(例如，连续地或 周期地去除)一定体积的液体培养基(例如，所述灌注生物反应器中的一定体积的第二液体 28 CN 111575225 A 说　明　书 26/44 页 培养基，其基本上不含细胞)，和在大约相同的时间或基本上相同的时间将一定体积的替代 培养基添加至所述灌注生物反应器。去除和添加可同时或连续或两者组合实施。此外，去除 和添加可(例如，以去除和替代灌注生物反应器体积或培养开始时液体培养基的初始体积 (例如，第二液体培养基体积的体积)的0.1％至800％(例如，1％-700％，1％-600％，1％- 500％，1％-400％，1％-350％，1％-300％，1％-250％，1％-100％，100％-200％，5％- 150％，10％-50％，15％-40％，8％-80％，和4％-30％)的体积的速率在任何给出的时间(例 如，在24-小时时间，在约1小时至约24小时的增加的时间，在多于24小时的增加的时间))连 续实施，或者周期地实施(例如，每三天一次(once  every  third  day)、每隔一天一次(once  every  other  day)、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)，或其任何组合。 当周期性实施时，去除或替代的体积(例如，约24-小时时间内，约1小时至约24小时的增加 的时间内，或多于24小时的增加的时间内)可为灌注生物反应器体积或培养开始时生物反 应器中的液体培养基的体积(例如，第二液体培养基体积)的0.1％至800％(例如，1％- 700％，1％-600％，1％-500％，1％-400％，1％-300％，1％-200％，1％-100％，100％- 200％，5％-150％，10％-50％，15％-40％，8％-80％，和4％-30％)。在一些情况中，去除的 液体培养基的体积和添加的替代液体培养基(例如，新鲜液体培养基)的体积可在培养期的 整个或部分中在每个24-小时时间(或，可替换地，在约1小时至约24小时的增加的时间或多 于24小时的增加的时间)保持大约相同。如本领域中已知的，去除液体培养基的体积的速率 (体积/时间单位)和添加替代液体培养基(例如，新鲜的第二液体培养基)的速率(体积/时 间单位)可变化。去除所述体积的液体培养基的速率(体积/时间单位)和添加所述体积的替 代液体培养基(例如，新鲜的液体培养基)的速率(体积/时间单位)可大约相同或不同。 [0201] 可替换地，去除的和添加的体积可在培养期过程中在每24-小时时间(或可替换 地，1小时至约24小时的增加的时间或多于24小时的增加的时间)变化(例如，逐渐增加)。例 如，去除的液体培养基的体积和添加的替代液体培养基(例如，添加的新鲜的液体培养基) 的体积可在培养期中在每24-小时时间(或可替换地，约1小时至约24小时以上的增加的时 间或多于24小时的增加的时间)内增加(例如，逐渐或通过交错增量(staggered  increments))在培养期中体积从培养起始时存在的生物反应器体积或液体培养基的体积 (例如，第二培养基体积)的0.5％至约20％增加至培养起始时存在的生物反应器体积或液 体培养基的体积(例如，第二培养基体积)的约25％至约300％。 [0202] 有技术的实施者可知去除的液体培养基和添加的替代液体培养基(例如，添加的 新鲜液体培养基)可为相同类型的培养基(例如，无血清的或无血清的、无蛋白的化学限定 的培养基)。在另外的情况中，去除的液体培养基和添加的替代液体培养基(例如，添加的新 鲜液体培养基)可为不同的。 [0203] 所述体积的液体培养基可例如，使用机械系统和/或通过将所述体积渗流(seep) 或重力流动通过具有可排除所述体积中存在的哺乳动物细胞的截留分子量的无菌膜来去 除。 [0204] 可将所述体积的替代液体培养基(例如，新鲜的第二液体培养基)以自动的方式 (例如，通过灌注泵)添加至生物反应器。在一些情况中，去除所述体积的液体培养基(例如， 基本上不含哺乳动物细胞的一定体积的第二液体培养基)和添加所述体积的替代液体培养 基(例如，新鲜液体培养基)不发生在用哺乳动物细胞接种所述灌注生物反应器的至少1小 29 CN 111575225 A 说　明　书 27/44 页 时内(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10 小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时 内、96小时内，或96小时之后)。 [0205] 如本领域的技术人员可知的，灌注培养所述第二细胞培养物以实现约5x106细胞/ mL至约140x  106细胞/mL(或本文所述的任何其他细胞密度或细胞密度范围)的目标细胞密 度的时间长度会取决于重组哺乳动物细胞的生长速率和第二细胞培养物的初始细胞密度。 例如，可将第二培养物灌注培养约1日-约9日(例如，上述对于分批培养列出的任何例示性 时间范围)的时间。可用于本方法的灌注培养的其他例示性参数在本文中描述。 [0206] 提供生产细胞培养物 [0207] 本申请所述的种子训练方法进一步包括(e)将一定体积的步骤(d)的所述第二细 胞培养物在生产生物反应器内所包括的第三培养基中处理以提供具有约0.25x  106细胞/ mL至约10x  106细胞/mL(例如，约0.25x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，0.25x  106细胞/ mL-约8.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL- 约6.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约 4.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约3.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约2.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约1.0x  106细胞/mL，约0.25x  106细胞/mL-约0.75x  106 细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/ mL，0.50x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约 0.50x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约 0.50x  106细胞/mL-约4.0x  106细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约3.0x  106细胞/mL，约 0.50x  106细胞/mL-约2.0x  106细胞/mL，约0.50x  106细胞/mL-约1.0x  106细胞/mL，约 0.75x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细 胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/ mL-约4.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约3.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL- 约2.0x  106细胞/mL，约0.75x  106细胞/mL-约1.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细 胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL， 约1.0x  106细胞/mL-约5.0x106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约4.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约3.0x  106细胞/mL，约1.0x  106细胞/mL-约2.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细 胞/mL-约10x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL- 约8.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约5.0x106细胞/mL，约2.0x  106细胞/mL-约4.0x  106细胞/ mL，约2.0x  106细胞/mL至约3.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约 2.5x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细 胞/mL-约5.0x  106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL-约4.0x106细胞/mL，约2.5x  106细胞/mL- 约3.0x  106细胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约7.0x  106细 30 CN 111575225 A 说　明　书 28/44 页 胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约3.0x  106细胞/mL-约5.0x  106细胞/mL， 约3.0x  106细胞/mL-约4.0x  106细胞/mL，约4.0x  106细胞/mL-约10x106细胞/mL，约4.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约4.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约4.0x  106细 胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约4.0x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约4.0x  106细胞/mL- 约5.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约5.0x  106细胞/mL-约7.0x106细胞/ mL，约5.0x  106细胞/mL-约6.0x  106细胞/mL，约6.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约 6.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，约6.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约6.0x  106细胞/mL-约7.0x  106细胞/mL，约7.0x  106细胞/mL-约10x  106细胞/mL，约7.0x  106细胞/ mL-约9.0x  106细胞/mL，约7.0x  106细胞/mL-约8.0x  106细胞/mL，约8.0x  106细胞/mL-约 10x106细胞/mL，约8.0x  106细胞/mL-约9.0x  106细胞/mL，或约9.0x  106细胞/mL-约10x  106 细胞/mL)的初始细胞密度范围的生产细胞培养物的步骤。在一些实施方案中，生产细胞培 养物的初始细胞密度为稳态生产细胞密度的至少约8％(例如，至少约10％、至少约12％、至 少约14％、至少约16％、至少约18％、至少约20％、至少约22％、至少约24％、至少约26％、至 少约28％、至少约30％、至少约32％、至少约34％、至少约36％、至少约38％、至少约40％或 至少约50％)。例如，生产细胞培养物的初始细胞密度可为稳态生产细胞密度的约4.0％-约 30％(例如，约4.0％-约28％，约4.0％-约26％，约4.0％-约24％，约4.0％-约22％，约 4.0％-约20％，约4.0％-约18％，约4.0％-约16％，约4.0％-约14％，约4.0％-约12％，约 4.0％-约10％，约4.0％-约8.0％，约4.0％-约6.0％，约5.0％-约30％，约5.0％-约28％，约 5.0％-约26％，约5.0％-约24％，约5.0％-约22％，约5.0％-约20％，约5.0％-约18％，约 5.0％-约16％，约5.0％-约14％，约5.0％-约12％，约5.0％-约10％，约5.0％-约8.0％，约 10％-约30％，约10％-约28％，约10％-约26％，约10％-约24％，约10％-约22％，约10％-约 20％，约10％-约18％，约10％-约16％，约10％-约14％，约10％-约12％，约15％-约30％，约 15％-约28％，约15％-约26％，约15％-约24％，约15％-约22％，约15％-约20％，约15％-约 18％，约20％-约30％，约20％-约28％，约20％-约26％，约20％-约24％，约20％-约22％，约 25％-约30％，或约25％-约28％)。如本领域的技术人员可知的，在第三培养基中处理以达 到对于生产细胞培养物约0.25x  106细胞/mL至约10x  106细胞/mL的初始细胞密度范围的第 二细胞培养物的适当体积可由所述第二细胞培养物的细胞密度和生产生物反应器中第三 培养基的体积来确定。例如，在第三细胞培养基中处理的第二细胞培养物的体积可为，例 如，2.0L-800L(例如，本申请所述的第二细胞培养物的体积的任何例示性范围)。 [0208] 第三细胞培养物具有，例如，约50L至约20,000L(例如，约50L-约17,500L，约50L- 约15,000L，约50L-约12,500L，约50L-约10,000L，约50L-约7,500L，约50L-约5,000L，约 50L-约2,500L，约50L-约1,000L，约50L-约750L，约50L-约500L，约50L-约200L，约50L-约 100L，约100L-约20,000L，约100L-约17,500L，约100L-约15,000L，约100L-约12,500L，约 100L-约10,000L，约100L-约7,500L，约100L-约5,000L，约100L-约2,500L，约100L-约1, 000L，约100L-约750L，约100L-约500L，约100L-约250L，约200L-约20,000L，约200L-约17, 500L，约200L-约15,000L，约200L-约12,500L，约200L-约10,000L，约200L-约7,500L，约 200L-约5,000L，约200L-约2,500L，约200L-约1,000L，约200L-约750L，约200L-约500L，约 200L-约250L，约500L-约20,000L，约500L-约17,500L，约500L-约15,000L，约500L-约12, 31 CN 111575225 A 说　明　书 29/44 页 500L，约500L-约10,000L，约500L-约7,500L，约500L-约5,000L，约500L-约2,500L，约500L- 约1,000L，约500L-约750L，约750L-约20,000L，约750L-约17,500L，约750L-约15,000L，约 750L-约12,500L，约750L-约10,000L，约750L-约7,500L，约750L-约5,000L，约750L-约2, 500L，约750L-约1,000L，约1,000L-约20,000L，约1,000L-约17,500L，约1,000L-约15, 000L，约1,000L-约12,500L，约1,000L-约10,000L，约1,000L-约7,500L，约1,000L-约5, 000L，约1,000L-约2,500L，约2,500L-约20,000L，约2,500L-约17,500L，约2,500L-约15, 000L，约2,500L-约12,500L，约2,500L-约10,000L，约2,500L-约7,500L，约2,500L-约5, 000L，约5,000L-约20,000L，约5,000L-约17,500L，约5,000L-约15,000L，约5,000L-约12, 500L，约5,000L-约10,000L，约5,000L-约7,500L，约7,500L-约20,000L，约7,500L-约17, 500L，约7,500L-约15,000L，约7,500L-约12,500L，约7,500L-约10,000L，约10,000L-约20, 000L，约10,000L-约17,500L，约10,000L-约15,000L，约10,000L-约12,500L，约12,500L-约 20,000L，约12,500L-约17,500L，约12,500L-约15,000L，约15,000L-约20,000L，约15, 000L-约17,500L，或约17,500L-约20,000L)的体积。 [0209] 用于这些方法的生产生物反应器可具有，例如，100L-约25,000L(例如，约100L-约 22,500L，约100L-约20,000L，约100L-约17,500L，约100L-约15,000L，约100L-约12,500L， 约100L-约10,000L，约100L-约7,500L，约100L-约5,000L，约100L-约2,500L，约100L-约1, 000L，约100L-约500L，约100L-约250L，约200L-约25,000L，约200L-约22,500L，约200L-约 20,000L，约200L-约17,500L，约200L-约15,000L，约200L-约12,500L，约200L-约10,000L， 约200L-约7,500L，约200L-约5,000L，约200L-约2,500L，约200L-约1,000L，约200L-约 750L，约200L-约500L，约200L-约250L，约约500L-约25,000L，约500L-约22,500L，约500L- 约20,000L，约500L-约17,500L，约500L-约15,000L，约500L-约12,500L，约500L-约10, 000L，约500L-约7,500L，约500L-约5,000L，约500L-约2,500L，约500L-约1,000L，约500L- 约750L，约1,000L-约25,000L，约1,000L-约22,500L，约1,000L-约20,000L，约1,000L-约 17,500L，约1,000L-约15,000L，约1,000L-约12,500L，约1,000L-约10,000L，约1,000L-约 7,500L，约1,000L-约5,000L，约1,000L-约2,500L，约5,000L-约25,000L，约5,000L-约22, 500L，约5,000L-约20,000L，约5,000L-约17,500L，约5,000L-约15,000L，约5,000L-约12, 500L，约5,000L-约10,000L，约5,000L-约7,500L，约7,500L-约25,000L，约7,500L-约22, 500L，约7,500L-约20,000L，约7,500L-约17,500L，约7,500L-约15,000L，约7,500L-约12, 500L，约7,500L-约10,000L，约10,000L-约25,000L，约10,000L-约22,500L，约10,000L-约 20,000L，约10,000L-约17,500L，约10,000L-约15,000L，约10,000L-约12,500L，约12, 500L-约25,000L，约12,500L-约22,500L，约12,500L-约20,000L，约12,500L-约17,500L，约 12,500L-约15,000L，约15,000L-约25,000L，约15,000L-约22,500L，约15,000L-约20, 000L，约15,000L-约17,500L，约17,500L-约25,000L，约17,500L-约22,500L，约17,500L-约 20,000L，约20,000L-约25,000L，约20,000L-约22,500L，或约22,500L-约25,000L)的内部 体积。 [0210] 生产生物反应器可为本领域中已知的任何合适的生物反应器(例如，大规模灌注 生物反应器、分批生物反应器或补料-分批生物反应器)。例如，合适的生产生物反应器可从 Xcellerex、Thermo  Fisher和GE  Healthcare得到。例如，大规模生产生物反应器(例如，灌 注、分批或补料-分批生物反应器)由Holloway  American(Springfield ,MO)制造并在 32 CN 111575225 A 说　明　书 30/44 页 Cotter  Brothers  Corporation(Danvers,MA)组装于生物反应器滑动器上。 [0211] 哺乳动物细胞 [0212] 重组哺乳动物细胞可为人、小鼠、仓鼠或猴细胞。例如，重组哺乳动物细胞可为细 胞系，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHO  DG44细胞、CHO-K1s细胞、C02.31选殖细胞、 A14.13选殖细胞、C02.57选殖细胞和F05.43选殖细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如，NS/0)、B- 细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如，HEK  293E和HEK  293F)、非洲绿猴肾上 皮细胞(Vero)细胞或Madin-Darby  Canine(Cocker  Spaniel)肾上皮细胞(MDCK)细胞。 [0213] 可使用多种分子生物学和分子遗传学中已知的方法将编码重组蛋白质的核酸引 入哺乳动物细胞以产生重组哺乳动物细胞。非限制性实例包括转染(例如，脂转染)、转导 (例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况中，将编码重组蛋白质的 核酸稳定地整合入重组哺乳动物细胞的染色体(瞬时转染)，而在其他重组哺乳动物细胞 中，所述核酸是被整合的。可替换地或此外，编码重组蛋白质的核酸可存在于质粒中和/或 哺乳动物人工染色体(例如，人的人工染色体)中。可替换地或此外，可使用病毒载体(例如， 慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)将所述核酸引入哺乳动物细胞。可将所述核酸可操作地 连接于启动子序列(例如，强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子或诱导型启动子)。 如果需要，包括核酸的载体可还包括可选择标记(例如，赋予哺乳动物细胞潮霉素、嘌呤霉 素或新霉素抗性的基因)。 [0214] 液体培养基 [0215] 液体培养基(培养基)是本领域中已知的。可对液体培养基补充哺乳动物血清(例 如，胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因 子)。本文所述的任何液体培养基可选自下组：不含动物来源组分的液体培养基、无血清液 体培养基、含血清液体培养基、化学限定的液体培养基和无蛋白液体培养基。化学限定的液 体培养基、不含动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基和含血清液体培养基的非 限制性实例是商业上可得到的。 [0216] 液体培养基通常包括能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如，二 十个氨基酸的基本组加半胱氨酸)、维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物、游离脂 肪酸和/或痕量元素。如果需要，所述液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可补 充，例如，哺乳动物激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液 (例如，钙、镁和磷酸盐)、核苷和碱基(例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤)、蛋白质和组织水解物， 和/或这些添加剂的任何组合。 [0217] 多种不同的可用于在本文所述的任何方法的任何步骤中培养细胞(例如，哺乳动 物细胞)的液体培养基是本领域中已知的。也可用于本方法的培养基组分包括但不限于化 学限定的(CD)水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两个以上氨基酸)和CD生长因子。液体组织 培养基和培养基组分的另外的实例是本领域中已知的。 [0218] 可将从重组哺乳动物细胞培养物获得的液体培养基过滤或澄清以获得基本上不 含细胞和/或病毒的液体培养基。用于过滤或澄清液体培养基以去除细胞的方法是本领域 中已知的(例如，0.2-μm过滤，使用交替切向流(ATF  TM)系统、切向流过滤(TFF)系统，或美国 临时专利申请号61/878,502中所述的任何系统的过滤)。还可使用离心和去除作为基本上 不含细胞的液体培养基的上清液，或通过允许细胞沉降至含有液体培养基的容纳器(例如， 33 CN 111575225 A 说　明　书 31/44 页 容器)的重力底部并去除远离沉降的重组哺乳动物细胞的液体培养基(基本上不含细胞的 液体培养基)而将重组细胞从液体培养基去除。在一些实施方案中，所述第一培养基、第二 培养基、第三培养基和第四培养基中的一个或多个(例如，两个、三个或全部)是相同的。 [0219] 用于本申请所述的任何方法中的任何步骤中的液体培养基可为本文所述或本领 域已知的任何形式的液体培养基。在用于分离本文所述的重组蛋白质的任何例示性方法 中，可通过添加第二流体(例如，缓冲液)在将其补料入第一MCCS(例如，第一PCCS)之前来稀 释从生产细胞培养物获得的液体培养基。 [0220] 含有重组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白)的基本上不含细胞的液体培养基在分离 所述重组蛋白质之前(例如，在将液体培养基补料入第一MCCS(例如，第一PCCS)之前)可被 储存(例如，在低于约15℃(例如，低于约10℃，低于约4℃，低于约0℃，低于约-20℃，低于 约-50℃，低于约-70℃或低于约-80℃)的温度)至少1日(例如，至少约2日，至少约5日，至少 约10日，至少约15日，至少约20日，或至少约30日))。可替换地，在一些实例中，将含有基本 上不含细胞的重组蛋白质的液体培养基补料入用于分离重组蛋白质的系统(例如，补料入 直接来自生产生物反应器的第一MCCS(例如，第一PCCS)(例如，补料入在过滤或澄清步骤后 直接来自生产生物反应器的第一MCCS(例如，第一PCCS)。 [0221] 重组蛋白质 [0222] 重组蛋白质可为重组的治疗蛋白。可通过本文提供的方法生产的重组的治疗蛋白 的非限制性实例包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如，本 文所述的任何抗体片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、 或 )、蛋白质(例如，人红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)或免疫 原性或抗原性蛋白质或蛋白片段(例如，用于疫苗的蛋白质)。重组的治疗蛋白可为含有至 少一个多功能重组蛋白质支架的工程化的抗原结合多肽(参见，例如，Gebauer等,Current  Opin.Chem.Biol.13:245-255,2009；和美国专利申请公开号2012/0164066中所述的重组的 抗原结合蛋白(其在此以参考方式整体并入本文))。作为抗体的重组的治疗蛋白的非限制 性实例包括：帕尼单抗(panitumuma b)、奥马珠单抗(omalizuma b)、阿巴伏单抗 (abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、actoxumab、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗 (adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、afutuzumab、阿珠单抗(alacizumab)、阿珠单 抗、阿仑单抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫单抗(altumomab)、amatuximab、 amatuximab、anatumomab、anrukinzumab、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗 (arcitumomab)、atinumab、托珠单抗(tocilizumab)、basilizimab、贝妥莫单抗 (bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝西索单抗 (besilesomab)、bezlotoxumab、比西单抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、塞妥珠单 抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、cixutumumab、达利珠单抗(daclizumab)、地 诺单抗(denosumab)、densumab、依库珠单抗(eculizumab)、依决单抗(edrecolomab)、依法 利珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄妥索单抗 (ertumaxomab)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)、figitumumab、戈利木单抗(golimumab)、替 伊莫单抗(ibritumomab  tiuxetan)、伊戈伏单抗(igovomab)、imgatuzumab、英夫利昔单抗 (infliximab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、英妥珠单抗(inotuzumab)、拉贝珠单抗 34 CN 111575225 A 说　明　书 32/44 页 (labetuzumab)、lebrikizumab、moxetumomab、那他珠单抗(natalizumab)、obinutuzumab、 奥戈伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单 抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗 (tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、tralokinumab、tucotuzumab、曲妥珠单抗 (trastuzumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)和zatuximab。可通 过本方法产生的重组治疗抗体的另外的实例是本领域中已知的。可通过本申请所述的方法 产生的重组治疗蛋白的另外的非限制性实例包括：阿葡糖苷酶α(alglucosidase  alfa)、拉 罗尼酶(laronidase)、阿巴西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黄体素α(lutropin  alfa)、抗血友病因子(antihemophilic  factor)、阿加糖酶β(agalsidase  beta)、干扰素β- 1a、达贝泊汀α(darbepoetin  alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、依那西普(etanercept)、凝 血因子IX(coagulation  factor  IX)、卵泡刺激激素(follicle  stimulating  hormone)、干 扰素β-1a、伊米苷酶(imiglucerase)、阿法链道酶(dornase  alfa)、依泊汀α(epoetin  alfa)、胰岛素或胰岛素类似物、美卡舍明(mecasermin)、因子VIII、因子VIIa、抗凝血酶Ⅲ、 蛋白C、人白蛋白、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、 白细胞介素-11、拉罗尼酶、Idursuphase、加硫酶(galsulphase)、α1-蛋白酶抑制剂、乳糖 酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原激活剂、促甲状腺素α(例如， )和阿替普酶 (alteplase)。可通过本方法产生的重组蛋白质的另外的实例包括酸性α-葡糖苷酶、阿葡糖 苷酶α(例如， 和 )、α-L-艾杜糖醛酸酶(例如， )、 艾杜糖醛酸硫酸酯酶(iduronate  sulfatase)、乙酰肝素N-硫酸酯酶(heparan  N- sulfatase)、半乳糖-6-硫化酶(galactose-6-sulfatase)、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸 糖苷酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-N-乙酰基半乳糖胺酶、酸性脂肪酶、溶酶体酸性神 经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、β-葡糖苷酶(例如， 和 )、半乳糖神经酰 胺酶、α-半乳糖苷酶-A(例如， )、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸 酶、己糖胺酶A(hexosaminidase  A)和己糖胺酶B。 [0223] 分泌的、可溶的重组蛋白质可通过从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除液体培养基 或以其他方式将液体培养基与细胞(例如，哺乳动物细胞)物理分离而从液体培养基回收。 用于从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除液体培养基的多种不同方法是本领域中已知的，包 括，例如，离心、过滤、移液和/或抽吸(aspiration)。然后可使用多种生物化学技术，包括多 种类型的层析术(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析、疏水相互作用层析或阴离 子交换层析)和/或过滤(例如，分子量截留过滤)将分泌的重组治疗蛋白质回收并与液体培 养基分离。 [0224] 培养参数 [0225] 本文所述的任何分批或灌注培养步骤可在约31℃至约40℃的温度实施。有技术的 实施者可知所述温度可在培养步骤过程中在特定的时间点变化，例如，以小时或日为基础。 例如，所述温度可在用所述细胞(例如，重组哺乳动物细胞)初始接种容器(例如，生物反应 器)之后约一日、二日、三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、十一日、十二日、十四 日、十五日、十六日、十七日、十八日、十九日或约二十日或以上变化或转变(例如，增加或降 低)。例如，所述温度可向上转变(例如，多至或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 35 CN 111575225 A 说　明　书 33/44 页 0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或多至或大约20℃的变化)。例如，所述温度可向下转变 (例如，多至或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或者多至或约20℃的变化)。 [0226] 本文所述的任何灌注或分批培养步骤可进一步包括将容器、灌注生物反应器或生 产生物反应器中的液体培养基暴露于含有至多或大约15％CO2(例如，至多或大约14％CO2、 12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2，或至多或大约1％CO2)的 气氛。所述容器、灌注生物反应器或生产生物反应器可在受控的加湿的气氛中温育细胞培 养物(例如，以大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度 或100％的湿度)。所述灌注和生产生物反应器还可装备有能够将一定体积的液体培养基从 生物反应器去除的机械装置和任选的所述机械装置内在将液体培养基转移出生物反应器 的过程中将细胞从液体培养基去除的过滤器(例如，ATF系统)。 [0227] 本文所述的任何容器、灌注生物反应器或生产生物反应器的内表面可具有至少一 个涂层(例如，明胶、胶原、多聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的至少一个涂层)，和如 本领域中已知的用于将O2、CO2和N2喷射入液体培养基的一个或多个端口，用于搅动液体培 养基的搅拌机构，和一个或多个传感器(例如，溶解的O2和溶解的CO2传感器)。 [0228] 制备重组蛋白质的方法 [0229] 还提供产生重组蛋白质的方法，其包括上述的任何例示性种子训练方法和另外的 步骤(f)在允许所述重组哺乳动物细胞分泌重组蛋白质的条件下灌注培养生产细胞培养 物；并从所述生产细胞培养物收获所述重组蛋白质。 [0230] 产生重组蛋白质的其他方法包括本文提供的任何例示性种子训练方法和另外的 步骤(f)在允许所述重组细胞分泌重组蛋白质的条件下分批或补料分批培养生产细胞培养 物；并从所述生产细胞培养物收获所述重组蛋白质。 [0231] 生产细胞培养物的灌注培养可使用本文所述或本领域已知的任何例示性灌注培 养方法实施。例如，生成生产细胞培养物(在将所述第二细胞培养物在第三培养基中处理之 后)至生产细胞培养物达到所述稳态生产细胞密度的时间之间的期间为约1.5日-约5.0日 (例如，约1.5日-约4.0日，约1.5日-约3.5日，约1.5日-约3.0日，约1.5日-约2.5日，约1.5 日-2.0日，约2.0日-约5.0日，约2.0日-约4.5日，约2.0日-约4.0日，约2.0日-约3.5日，约 2.0日-约3.0日，约2.0日-约2.5日，约2.5日-约5日，约2.5日-约4.5日，约2.5日-约4.0日， 约2.5日-约3.5日，约2.5日-约3.0日，约3.0日-约5.0日，约3.0日-约4.5日，约3.0日-约4.0 日，约3.0日-约3.5日，约3.5日-约5.0日，约3.5日-约4.5日，约3.5日-约4.0日，约4.0日-约 5.0日，约4.0日-约4.5日，或约4.5日-约5.0日)。生产细胞培养物的灌注培养可持续例如 5.0日-200日(例如，5.0日-190日，5.0日-180日，5.0日-170日，5.0日-160日，5.0日-150日， 5.0日-140日，5.0日-130日，5.0日-120日，5.0日-110日，5.0日-110日，5.0日-100日，5.0 日-90日，5.0日-80日，5.0日-70日，5.0日-60日，5.0日-50日，5.0日-40日，5.0日-30日，5.0 日-20日，5.0日-10日，10日-200日，10日-190日，10日-180日，10日-170日，10日-160日，10 日-150日，10日-140日，10日-130日，10日-120日，10日-110日，10日-100日，10日-90日，10 日-80日，10日-70日，10日-60日，10日-50日，10日-40日，10日-30日，10日-20日，20日-200 36 CN 111575225 A 说　明　书 34/44 页 日，20日-190日，20日-180日，20日-170日，20日-160日，20日-150日，20日-140日，20日-130 日，20日-120日，20日-110日，20日-100日，20日-90日，20日-80日，20日-70日，20日-60日， 20日-50日，20日-40日，30日-200日，30日-190日，30日-180日，30日-170日，30日-160日，30 日-150日，30日-140日，30日-130日，30日-120日，30日-110日，30日-100日，30日-90日，30 日-80日，30日-70日，30日-60日，30日-50日，30日-40日，40日-200日，40日-190日，40日- 180日，40日-170日，40日-160日，40日-150日，40日-140日，40日-130日，40日-120日，40日- 110日，40日-100日，40日-90日，40日-80日，40日-70日，40日-60日，40日-50日，50日-200 日，50日-190日，50日-180日，50日-170日，50日-160日，50日-150日，50日-140日，50日-130 日，50日-120日，50日-110日，50日-100日，50日-90日，50日-80日，50日-70日，50日-60日， 75日-200日，75日-175日，75日-150日，50日-125日，50日-100日，50日-75日，75日-200日， 75日-175日，75日-200日，75日-175日，75日-150日，75日-125日，75日-100日，100日-200 日，100日-175日，100日-150日，100日-125日，125日-200日，125日-175日，125日-150日， 150日-200日，150日-175日，或175日-200日)的时间。 [0232] 可通过连续的或周期的去除(例如，以与灌注培养过程中相同或变化的频率)将培 养基从生产生物反应器去除。可人工(例如，通过移液)或通过泵系统(例如，交替切向流 (ATF)过滤系统或切向流体过滤)去除培养基。 [0233] 分离重组蛋白质 [0234] 本文所述的产生重组蛋白质的方法可进一步包括从去除自生产生物反应器(在灌 注培养过程中)的培养基分离重组蛋白质的步骤。从去除自生产生物反应器的培养基分离 重组蛋白质的步骤可包括选自下组的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或七 个)单元操作的实施：捕获、纯化、精制、病毒灭活、调节包括重组蛋白质的流体的pH和/或离 子浓度，和过滤。例如，分离重组蛋白质的一个或多个单元操作可通过将含有重组蛋白质的 流体经过一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)多柱层析系统(MCCS)来实施。从培养 基分离重组蛋白质的步骤可使用集成的和连续的工艺/方法(例如，美国临时专利申请号 61/775,060、美国临时专利申请号61/856,390、美国专利申请系列号14/195,481、国际专利 申请号PCT/US2014/019909和美国临时专利申请号61/928,906中所述的例示性方法，每篇 的整体内容通过提述并入本文)来实施。例示性方法可包括提供包括基本上不含细胞的重 组蛋白质(例如，重组的治疗蛋白)的液体培养基(例如，从生产生物反应器去除并通过ATF 系统过滤的液体培养基)。一些方法包括将液体培养基(例如，从生产生物反应器去除并通 过ATF系统过滤的液体培养基)连续进料入包括至少一个层析柱的多柱层析系统(MCCS)，其 中这些方法是整合的并从液体培养基连续运行至来自MCCS的洗脱物，其为分离的重组蛋白 质。一些方法包括将液体培养基(例如，从生产生物反应器去除并通过ATF系统过滤的液体 培养基)连续进料入第一MCCS(MCCS1)，使用MCCS1从液体培养基捕获重组蛋白质，产生来自 MCCS1的洗脱物，其包括重组蛋白质，和将所述洗脱物连续进料入第二MCCS(MCCS2)，和随后 (从MCCS2)洗脱重组蛋白质由此产生分离的重组蛋白质，其中所述方法是整合的并从液体 培养基连续运行至分离的重组蛋白质。一些实施方案进一步包括将分离的重组蛋白质配制 成药剂的步骤。 [0235] 可用于任何这些方法的MCCS的非限制性方面(MCCS、MCCS1和/或MCCS2)在美国临 时专利申请号61/775,060、美国临时专利申请号61/856,390、美国专利申请系列号14/195, 37 CN 111575225 A 说　明　书 35/44 页 481、国际专利申请号PCT/US2014/019909和美国临时专利申请号61/928,906(各以参考方 式并入本文)中描述。这些例示性方法的多个其他方面在下文描述并可无限制的在本文提 供的方法中以任何组合使用。所提供的方法的例示性方面描述如下，然而本领域技术人员 可知：可将另外的步骤添加至本文所述的方法而且可使用其他材料以实施本文所述的方法 的任何步骤。 [0236] 本文所述的例示性方法可包括使用MCCS或两个或更多(例如，两个、三个、四个、五 个或六个)多柱层析系统(MCCS)(例如，MCCS1和MCCS2)。MCCS可包括两个或更多层析柱，两 个或更多层析膜，或至少一个层析柱与至少一个层析膜的组合。在非限制性实例中，MCCS (例如，本文的任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)可包括四个层析柱，三个层析柱和层 析膜，三个层析柱，两个层析柱，两个层析膜，和两个层析柱和一个层析膜。本领域技术人员 可预见层析柱和/或层析膜的组合的其他实例可无限制地用于MCCS(例如，本文所述任何方 法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)。MCCS中存在的个体层析柱和/或层析膜可为相同的(例如， 具有相同的形状、体积、树脂、捕获机制和单元操作)，或可为不同的(例如，具有一种或多种 不同的形状、体积、树脂、捕获机制和/或单元操作)。MCCS(例如，本文所述任何方法中的 MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中存在的单独的层析柱和/或层析膜可实施相同的单元操作(例 如，捕获、纯化或精制的单元操作)或不同的单元操作(例如，不同的单元操作，其选自例如 下组：捕获、纯化、精制、灭活病毒、调节包括重组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH、和过 滤)。例如，在本文所述方法的实例中，MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱和/或层析膜实施 捕获重组蛋白质的单元操作。 [0237] 用于本文所述的任何方法的MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个 层析柱可具有基本上相同的树脂体积或可具有不同的树脂体积。在使用本文所述的任何方 法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中，可采用一种或多种(例如，三、四、五、六、七、八、 九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二、二十三 或二十四种)不同类型的缓冲液。如本领域中已知的，用于本文所述的方法中的MCCS、MCCS1 和/或MCCS2中一种或多种类型的缓冲液会依赖于MCCS、MCCS1和/或MCCS2的层析柱和/或层 析膜中存在的树脂、重组蛋白质的生物物理性质和通过MCCS、MCCS1和/或MCCS2的特定的层 析柱和/或层析膜实施的单元操作(例如，本文所述的任何例示性单元操作)。在使用本文所 述任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中采用的缓冲液的体积和类型还可由本领 域技术人员确定(例如，下面更详细地讨论)。例如，可选择在使用本文所述任何方法中的 MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中采用的缓冲液的体积和类型以优化分离的重组蛋白质的 一个或多个下述方面：重组蛋白质的总体收率、重组蛋白质的活性、重组蛋白质的纯度水平 和从包括重组蛋白质的流体(例如，液体培养基)去除生物污染物(例如，不存在活性病毒、 分枝杆菌、酵母、细菌或哺乳动物细胞)。 [0238] 所述MCCS、MCCS1和/或MCCS2可为周期性逆流层析系统(PCCS)。PCCS可，例如，包括 两个或多个层析柱(例如，三个柱或四个柱)，其经切换以允许从所述两个或多个层析柱连 续洗脱重组蛋白质。PCCS可包括两个或多个层析柱，两个或多个层析膜，或至少一个层析柱 和至少一个层析膜。柱操作(循环)通常由加载、洗涤、洗脱和再生步骤组成。在PCCS中，将多 个柱用于以循环方式分离地和连续地运行相同步骤。由于柱串联(in  series)操作，来自一 个柱的流过物(flow  through)和洗涤物(wash)被另一个柱捕获。PCCS的此独特的特征允许 38 CN 111575225 A 说　明　书 36/44 页 将树脂加载接近于其静态结合容量(static  binding  capacity)而非动态结合容量 (dynamic  binding  capacity)，如分批模式层析过程中通常的。作为连续循环和洗脱的结 果，将进入PCCS的流体连续处理，并连续产生包括重组蛋白质的洗脱液。 [0239] 采用柱切换策略以在PCCS循环中从一个步骤前进至另一个步骤。可用于PCCS的柱 切换的实例在美国临时专利申请号61/775,060,、美国临时专利申请号61/856,390、美国专 利申请系列号14/195,481、国际专利申请号PCT/US2014/019909和美国临时专利申请号61/ 928,906中描述。在PCCS中，PCCS中存在的每个层析柱和/或层析膜上重组蛋白质的停留时 间(RT)可被减少而无需增加柱/膜大小，因为来自第一柱/膜的穿透物(breakthrough)可在 PCCS中的另一个柱/膜上被捕获。可设计连续的方法系统以通过使用等式V＝D*RT变化所述 柱/膜体积(V)和RT而以任何灌注速率(D)处理液体培养基。 [0240] 可通过用于本文所述任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2实施的一个或多个单 元操作包括，例如，捕获所述重组蛋白质、使包括所述重组蛋白质的流体中存在的病毒灭 活、纯化所述重组蛋白质、精制所述重组蛋白质、保持包括所述重组蛋白质的流体(例如，使 用本文所述的任何例示性破碎罐(break  tank))、从包括所述重组蛋白质的流体过滤或去 除颗粒材料和/或细胞，和调节包括所述重组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH。在一些实 施方案中，MCCS或MCCS1包括至少一个层析柱和/或层析膜，其实施捕获所述重组蛋白质的 单元操作。所述捕获的单元操作可使用(例如，利用捕获机制的)至少一个层析柱和/或层析 树脂实施。捕获机制的非限制性实例包括结合蛋白A的捕获机制、结合抗体或抗体片段的捕 获机制、结合底物的捕获机制、结合适体(aptamer)的捕获机制、结合标签的捕获机制(例 如，基于聚-His标签的捕获机制)和结合辅因子的捕获机制。捕获还可使用树脂实施，所述 树脂可用于实施阳离子交换或阴离子交换层析、分子筛层析或疏水相互作用层析。可用于 捕获重组蛋白质的非限制性树脂在本文中描述。可用于捕获重组蛋白质的树脂的另外的实 例是本领域中已知的。 [0241] 将包括重组蛋白质的流体中存在的病毒灭活的单元操作可使用MCCS、MCCS1和/或 MCCS2来实施(例如，其包括，例如，层析柱、层析膜或保持罐(holding  tank)，其能够将包括 重组蛋白质的流体在约3.0-5.0(例如，约3.5至约4.5、约3.5至约4.25、约3.5至约4.0、约 3.5至约3.8，或约3.75)的pH温育至少30分钟的时间(例如，约30分钟至1.5小时的时间，约 30分钟至1.25小时的时间，约0.75小时至1.25小时的时间，或约1小时的时间))。 [0242] 纯化重组蛋白质的单元操作可使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或 MCCS2)来实施，所述一个或多个MCCS包括，例如，包括(例如，利用捕获系统的)树脂的层析 柱或层析膜。捕获机制的非限制性实例包括结合蛋白A的捕获机制、结合抗体或抗体片段的 捕获机制、结合底物的捕获机制、结合适体的捕获机制、结合标签的捕获机制(例如，基于 聚-His标签的捕获机制)和结合辅因子的捕获机制。纯化还可使用树脂实施，所述树脂可用 于实施阳离子交换或阴离子交换层析、分子筛层析或疏水相互作用层析。可用于纯化重组 蛋白质的非限制性树脂在本文中描述。可用于纯化重组蛋白质的树脂的另外的实例是本领 域中已知的。 [0243] 精制重组蛋白质的单元操作可使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或 MCCS2)来实施，所述一个或多个MCCS包括，例如，包括(例如，可用于实施阳离子交换、阴离 子交换、分子筛层析或疏水相互作用层析的)树脂的层析柱或层析膜。可用于精制重组蛋白 39 CN 111575225 A 说　明　书 37/44 页 质的非限制性树脂在本文中描述。可用于精制重组蛋白质的树脂的另外的实例是本领域中 已知的。 [0244] 过滤包括所述重组蛋白质的流体的单元操作可使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或 MCCS2)来实施，所述MCCS包括，例如，包括分子筛树脂的滤器，或层析柱或层析膜。如本领域 中已知的，多种亚微米滤器(例如，具有小于1μm，小于0.5μm，小于0.3μm,约0.2μm，小于0.2μ m，小于100nm，小于80nm，小于60nm，小于40nm，小于20nm，或小于10nm的孔径的滤器)是本领 域中可用的，其能够去除任何沉淀的材料和/或细胞(例如，沉淀的、未折叠的蛋白质；沉淀 的、不想要的宿主细胞蛋白；沉淀的脂质；细菌；酵母细胞；真菌细胞；分枝杆菌；和/或哺乳 动物细胞)。已知具有约0.2μm或小于0.2μm的孔径以从包括重组蛋白质的流体有效地去除 细菌的滤器。如本领域中已知的，包括分子筛树脂的层析柱或层析膜还可用于MCCS(例如， MCCS、MCCS1和/或MCCS2)以实施过滤包括重组蛋白质的流体的单元操作。 [0245] 调节包括所述重组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH的单元操作可使用MCCS(例 如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)来实施，所述MCCS包括和利用缓冲液调节库(例如，线上(in- line)缓冲液调节库)，其将新的缓冲溶液添加入包括重组蛋白质的流体(例如，在MCCS、 MCCS1和/或MCCS2内的柱之间，或在倒数第二MCCS(例如，MCCS1)中的最后一个柱之后且在 将包括重组蛋白质的流体加料入下一个MCCS(例如，MCCS2)的第一个柱之前。 [0246] 在本文所述的例示性方法中，MCCS、MCCS1和/或MCCS2可实施两个或多个单元操 作。例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2可各实施至少如下的单元操作：捕获重组蛋白质和灭活包 括重组蛋白质的流体中存在的病毒；捕获重组蛋白质，灭活包括重组蛋白质的流体中存在 的病毒，和调节包括重组蛋白质的液体的离子浓度和/或pH；纯化重组蛋白质和精制重组蛋 白质；纯化重组蛋白质，精制重组蛋白质，和过滤包括所述重组蛋白质的流体或从包括所述 重组蛋白质的流体去除沉淀物和/或特定的物质；和纯化重组蛋白质，精制重组蛋白质，过 滤包括所述重组蛋白质的流体或从包括所述重组蛋白质的流体去除沉淀物和/或颗粒物 质，和调节包括重组蛋白质的液体的离子浓度和/或pH。 [0247] 在本文所述的例示性方法中，从液体培养基捕获重组蛋白质使用MCCS或MCCS1实 施。如本领域中可知的，为了实现重组蛋白质的捕获，MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或 至少一个层析膜必须包括利用捕获机制(例如，本文所述的任何例示性捕获机制)的树脂， 或包括能够实施阳离子交换、阴离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。例如，如果 重组蛋白质是抗体或抗体片段，捕获系统可为结合蛋白A的捕获机制或结合抗原的捕获机 制(其中通过重组抗体或抗体片段特异性识别捕获抗原)。如果重组蛋白质是酶，捕获机制 可使用特异性结合所述酶以捕获重组酶的抗体或抗体片段，捕获重组酶的所述酶的底物， 捕获重组酶的所述酶的辅因子，或者，如果重组酶包括标签，可施用特异性结合重组酶中存 在的标签的蛋白质、金属螯合物或抗体(或抗体片段)。可用于捕获重组蛋白质的非限制性 树脂在本文中所描述，且可用于捕获重组蛋白质的另外的树脂是本领域中已知的。利用结 合蛋白A的捕获机制的树脂的一个非限制性实例是MabSelect  SuRe树脂(GE  Healthcare, Piscataway ,NJ)、JSR  LifeSciences  Amsphere  ProA  JWT203(Sunnyvale ,CA)和Kaneka  KanCap  A(Osaka,Japan)。 [0248] 在本文所述的一些例示性方法中，MCCS或MCCS1可包括在低pH(例如，4.6以下、4.4 以下、4.2以下、4.0以下、3.8以下、3.6以下、3.4以下、3.2以下，或3.0以下的pH)将包括所述 40 CN 111575225 A 说　明　书 38/44 页 重组蛋白质的流体保留例如，约1分钟至1.5小时(例如，约1小时)并灭活包括所述重组蛋白 质的流体中存在的病毒的储库。如本领域技术人员可知的，多种其他手段可用于实施灭活 病毒的单元操作。例如，UV照射包括所述重组蛋白质的流体也可用于实施灭活病毒的单元 操作。 [0249] MCCS或MCCS1可包括PCCS，其包括四个层析柱，其中四个层析柱中至少三个实施从 液体培养基捕获重组蛋白质的单元操作(例如，使用包括至少一个层析柱的任何的MCCS，所 述层析柱包括能够实施捕获(例如，本文所述的任一者)的单元操作的树脂)。在这些实例 中，四柱的PCC可实施灭活包括重组蛋白质的流体中的病毒的单元操作(例如，可用于实现 包括所述重组蛋白质的流体的病毒灭活的本文所述的任何例示性柱)。 [0250] 本文所述的例示性方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2可用于实施纯化和精制重组 蛋白质的单元操作。例如，MCCS2可用于实施纯化和精制重组蛋白质的操作且来自MCCS2的 洗脱物是分离的重组蛋白质。MCCS、MCCS1和/或MCCS2可包括至少一个(例如，两个、三个或 四个)可用于实施纯化重组蛋白质的单元操作的层析柱或层析膜，和至少一个(例如，两个、 三个或四个)可用于实施精制重组蛋白质的单元操作的层析柱或层析膜。 [0251] 可用于实施纯化重组蛋白质的单元操作的至少一个层析柱或层析膜可包括利用 捕获机制的树脂(例如，本文所述或本领域已知的任何捕获机制)，或可用于实施阴离子交 换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。可用于实施精制重组蛋白质的单元操 作的至少一个层析柱或层析膜可包括可用于实施阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水 相互作用层析的树脂(例如，本文所述或本领域已知的用于实施阴离子交换、阳离子交换、 分子筛或疏水相互作用层析的任何例示性树脂)。用于实施精制的单元操作的一个或多个 层析柱和/或层析膜可包括选择性结合或保留包括所述重组蛋白质的流体中存在的杂质的 树脂。 [0252] 在本文所述的例示性方法的一些实例中，MCCS2包括PCCS，所述PCCS包括三个层析 柱和一个层析膜，例如，其中PCCS中的三个层析柱实施纯化重组蛋白质的单元操作(例如， 使用可用于实施纯化蛋白质的单元操作的至少一个层析柱)和PCCS中的层析膜实施精制重 组蛋白质的单元操作。在这些实例中，可用于实施精制重组蛋白质的单元操作的PCCS中的 层析膜可为本申请所述的可用于实施精制重组蛋白质的单元操作的任何例示性层析膜。本 文所述的任何柱切换方法可用于确定此实例中PCCS中的前三个层析柱和层析膜何时可被 切换。 [0253] 例示性重组蛋白质分离系统 [0254] 用于实施本文所述的方法且包括MCCS或MCCS1和MCCS2的生物制造系统的实例在 美国临时专利申请系列号、美国临时专利申请号61/775,060、美国临时专利申请号61/856, 390、美国专利申请系列号14/195,481、国际专利申请号PCT/US2014/019909和美国临时专 利申请号61/928,906(以参考方式并入)中描述。整个系统可包括，例如，总共四、五、六、七、 八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个层析柱。例如，MCCS、 MCCS1和/或MCCS2可包括(或可各自包括)二、三、四、五、六、七、八、九、十个层析柱。 [0255] 例如，有用的系统可包括MCCS1，其包括入口；和MCCS2，其包括出口；或MCCS，其包 括入口和出口。在一些实施方案中，MCCS1和MCCS2是相互流体连通的。这些系统还可经配置 使得流体可经入口进入，通过MCCS1和MCCS2，并从出口流出制造系统。 41 CN 111575225 A 说　明　书 39/44 页 [0256] 在这些例示性系统中，MCCS或MCCS1可包括入口，通过所述入口流体(例如，来自生 产生物反应器基本上不含细胞的液体培养基)可分别进入MCCS或MCCS1。入口可为本领域已 知用于所述目的的任何结构。它可包括，例如，螺纹(threading)、肋条(ribbing)或密封物 (seal)，其允许被插入流体管道，使得在将流体管道插入入口后流体会通过入口进入MCCS 或MCCS1而无流体显著渗漏出入口。可用于本系统的非限制性入口是已知的，且可由本领域 技术人员所理解。 [0257] MCCS或MCCS1可包括至少两个层析柱、至少两个层析膜，或至少一个层析柱和至少 一个层析膜，和入口。MCCS或MCCS1可为本文所述的任何例示性MCCS，或具有一个或多个本 文所述的MCCS的任何例示性特征(以任何组合)。MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜 可具有一个或多个本申请所述或本领域已知的任何例示性形状、大小、体积(柱床体积)和/ 或单元操作。 [0258] MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜可包括一种或多种本文所述或本领域 已知的任何例示性树脂。例如，MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中所 包括的树脂可为利用捕获机制(例如，结合蛋白A的捕获机制、结合蛋白G的捕获机制、结合 抗体或抗体片段的捕获机制、结合底物的捕获机制、结合辅因子的捕获机制、结合适体的捕 获机制和/或结合标签的捕获机制)的树脂。MCCS或MCCS1的一个或多个层析柱和/或层析膜 中所包括的树脂可为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂或疏水相互作用树脂， 或它们的任何组合。可用于纯化重组蛋白质的树脂的另外的实例是本领域已知的，并可包 括于MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中。MCCS或MCCS1中存在的层析 柱和/或层析膜可包括相同和/或不同的树脂(例如，本文所述或本领域已知的用于重组蛋 白质纯化的任何树脂)。 [0259] MCCS或MCCS1中存在的两个或多个层析柱和/或层析树脂可实施一个或多个单元 操作(例如，捕获重组蛋白质，纯化重组蛋白质，精制重组蛋白质，灭活病毒，调节包括所述 重组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH，或过滤包括重组蛋白质的流体)。在非限制性实例 中，MCCS或MCCS1可实施从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白质和灭活包括重组蛋白质 的流体中存在的病毒的单元操作。MCCS或MCCS1可实施本文所述或本领域已知的两个或多 个单元操作的任何组合。 [0260] MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜可通过切换机构(例如，柱 切换机构)相互连接或相互移动。MCCS或MCCS1还可包括一个或多个(例如，两个、三个、四个 或五个)泵(例如，自动的，例如，自动的蠕动泵)。柱切换事件可通过检测重组蛋白质的水 平，液体(例如，缓冲液)的特定体积，或逝去的特定时间触发，所述重组蛋白质的水平通过 对应于经过MCCS或MCCS1的流体(例如，进入MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析 膜的输入物和/或来自MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜的洗脱物)中一定 水平的重组蛋白质的UV吸光度来检测。柱切换(column  switching)通常意为一种机构，通 过该机构允许MCCS或MCCS1中至少两个不同的层析柱和/或层析膜(例如，MCCS或MCCS1中存 在的两个或多个不同的层析柱和/或层析膜)在方法的至少部分的过程中以基本上相同的 时间经过不同的步骤(例如，平衡、加载、洗脱或洗涤)。 [0261] MCCS或MCCS1可为周期性逆流层析系统(Periodic  Counter-Current  Chromatography  system；PCCS)。例如，作为MCCS或MCCS1的PCCS(即，分别为PCCS或PCCS1) 42 CN 111575225 A 说　明　书 40/44 页 可包括四个层析柱，其中前三个柱实施从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白质的单元 操作，而PCCS的第四个柱实施灭活包括重组蛋白质的流体中的病毒的单元操作。作为MCCS 或MCCS1的PCCS可利用柱切换机构。PCC系统可利用改变的 系统(GE  Healthcare , Piscataway,NJ)，其能够运行多至，例如，四、五、六、七或八个柱，或更多。 [0262] 本文所述的例示性系统中的第二MCCS(MCCS2)可包括至少两个层析柱、至少两个 层析膜，或者至少一个层析柱和至少一个层析膜，和出口。MCCS2可为本文所述的任何例示 性MCCS，或可具有本文所述的MCCS的任何例示性特征中的一个或多个(以任何组合)。MCCS2 中存在的层析柱和/或层析膜可具有如下的一个或多个：本文所述的任何形状、大小、体积 (柱床体积)和/或单元操作。层析柱和/或层析膜可包括本文所述或本领域已知的任何例示 性树脂。例如，MCCS2中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中所包括的树脂可为利用捕 获机制(例如，结合蛋白A的捕获机制、结合蛋白G的捕获机制、结合抗体或抗体片段的捕获 机制、结合底物的捕获机制、结合辅因子的捕获机制、结合标签的捕获机制和/或结合适体 的捕获机制)的树脂。有用的树脂包括，例如，阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树 脂和疏水相互作用树脂。树脂的另外的实例是本领域中已知的。MCCS2中存在的层析柱和/ 或层析膜可包括相同和/或不同的树脂(例如，本文所述或本领域已知用于重组蛋白质纯化 的任何树脂)。 [0263] MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可实施一个或多个单元操作(例如，本文所述 的任何单元操作或本文所述单元操作的任何组合)。在非限制性实例中，MCCS2可实施从流 体纯化重组蛋白质和精制包括重组蛋白质的流体中存在的重组蛋白质的单元操作。在其他 非限制性实例中，MCCS2可实施纯化流体中存在的重组蛋白质，精制流体中存在的重组蛋白 质，和过滤包括重组蛋白质的流体的单元操作。在另一个实例中，MCCS2可实施纯化流体中 存在的重组蛋白质，精制流体中存在的重组蛋白质，过滤包括重组蛋白质的流体和调节包 括重组蛋白质的流体的离子浓度和/或pH的单元操作。MCCS2可实施本文所述或本领域已知 的两个或多个单元操作的任何组合。 [0264] MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可通过切换机构(例如，柱切换机构)相互连接 或相互移动。MCCS2还可包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)泵(例如，自动的， 例如，自动的蠕动泵)。柱切换事件可通过检测重组蛋白质的水平，液体(例如，缓冲液)的特 定体积，或逝去的特定时间触发，所述重组蛋白质的水平通过对应于经过MCCS2的流体(例 如，进入MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜的输入物和/或来自MCCS2中的一个或多 个层析柱和/或层析膜的洗脱物)中一定水平的重组蛋白质的UV吸光度来检测。 [0265] MCCS2可为周期性逆流层析系统(PCCS2)。例如，PCCS2可包括三个层析柱，其实施 从流体纯化重组蛋白质的单元操作，和层析膜，其实施精制流体中存在的重组蛋白质的单 元操作。例如，实施从流体纯化重组蛋白质的单元操作的三个柱可包括，例如，阳离子交换 树脂，且实施精制的单元操作的层析膜可包括阳离子交换树脂。PCCS2可利用柱切换机构。 PCCS2可利用改变的 系统(GE  Healthcare ,Piscataway ,NJ)，其能够运行多至，例 如，四、五、六、七或八个柱，或更多。 [0266] MCCS2可包括出口，通过该出口分离的重组蛋白质可离开系统。出口可包括，例如， 螺纹、肋条或密封物，其允许被插入流体管道或经设计以保持或存储分离的重组蛋白质的 小瓶。出口可包括可用于密封所述出口上降低生物负荷小瓶(reduced  bioburden  vial)或 43 CN 111575225 A 说　明　书 41/44 页 其他这样的存储容器的表面，从而允许分离的重组蛋白质直接流入降低生物负荷小瓶或存 储容器。可用于本系统的非限制性出口是已知的，且可由本领域技术人员所理解。 [0267] 配制分离的重组蛋白质 [0268] 可施用本领域已知的方法将分离的重组蛋白质进一步配制成药剂。药剂经配制而 与它们意欲的施用路径(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹膜内)相容。药剂可 包括无菌稀释剂(例如，无菌的水或盐水)，固定油(fixed  oil)，聚乙二醇、甘油、丙二醇或 其它合成溶剂，抗菌剂或抗真菌剂，如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血 酸、硫柳汞等，抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂，如乙二胺四乙酸，缓冲剂如乙 酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和等渗剂，如糖(例如、右旋糖)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇) 或盐(例如，氯化钠)，或其任何组合。脂质体悬浮液也可用作药学可接受的载体(参见，例 如，美国专利号4,522,811)。药剂的制备可配制并封闭于安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶 中。当需要时(如在，例如，注射制剂中)，可通过例如，使用涂覆物(coating)如卵磷脂，或表 面活性剂来维持适当的流动性。分离的重组蛋白质的吸收可通过包括可延迟吸收的作用剂 (例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。可替换地，控制释放可通过植入物(implants)和微囊化 的递送系统来实现，其可包括生物可降解的、生物相容的聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯 (ethylene  vinyl  acetate)、聚酐(polyanhydrides)、聚乙醇酸、胶原(collagen)、聚原酸 酯(polyorthoesters)和聚乳酸；Alza  Corporation和Nova  Pharmaceutical,Inc.)。 [0269] 包括任何分离的重组蛋白质中的一种或多种的药剂可经配制用于胃肠外(例如， 静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹膜内)以剂量单位形式(即，含有预定量的活性蛋白 的物理上分散的单位以便于施用和剂量的均匀性)施用。 [0270] 药剂的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物(例如，猴)中的标准药学方 法确定。能够，例如，确定LD50(对于群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗 上有效的剂量)：治疗指数为LD50:ED50的比值。呈现高治疗指数的药剂是较佳的。当药剂呈 现不合意的副作用时，应小心以使潜在的损害最小化(即，降低不想要的副作用)。毒性和治 疗功效可通过其他标准药学方法确定。 [0271] 从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可用于配制供用于受试者(例如，人)的 任何给定的分离的重组蛋白质的适当剂量。本文所述的任何药剂的有效性和给药(dosing) 可通过保健专业人士或兽医专业人士使用本领域已知的方法确定。一些因素可影响有效治 疗受试者所需的剂量和时机(例如，疾病或病症的严重程度，先前的治疗，受试者的年龄和/ 或总体健康，和其他疾病的存在)。 [0272] 在如下实施例中进一步描述本发明，所述实施例并不限制权利要求中所述的本发 明的范围。 实施例 [0273] 实施例1.两步骤例示性种子训练方法 [0274] 实施实验以开发改进的种子训练方法。本文提供的例示性种子训练方法示于图1 和2。与常规的种子训练方法相比，本申请提供的例示性种子训练方法消除了两个中间的旋 动培养(spinner  culture)步骤。图1和2中所示的例示性种子训练方法代替了旋动培养(例 如，用图1和2中的Wave生物反应器(2-L和20-L)替代了图1和2中的125-mL至10-L旋动培 44 CN 111575225 A 说　明　书 42/44 页 养)。图1和2中用Wave生物反应器替代多个旋动培养减少层流罩中所需操纵的数目，并因此 通过允许在封闭的系统中操作而改进操作的成功率。在N-1灌注培养步骤使用灌注培养(例 如，图1和2中具有ATF过滤装置的50-L灌注生物反应器)也允许达到≥50x  106活细胞/mL的 培养细胞密度。N-1灌注培养步骤中达到的高活细胞密度允许500-L生产生物反应器中5x  106活细胞/mL的接种密度，这显著高于通过常规种子训练方法(图1)达到的生产生物反应 器中的初始细胞密度。由本种子训练方法提供的更高的生产生物反应器接种密度有助于将 生产生物反应器生长期减少约5日，对于操作50日的生产生物反应器节省了制造工厂时间 (manufacturing  plant  time)。用于测试图1和2中所示的例示性种子训练方法的生产力的 材料和方法在下面描述。 [0275] 材料与方法 [0276] 细胞系和介质 [0277] 所有实验使用补充4mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的商业上可得到 的、化学限定的细胞培养基(Life  Technologies,Grand  Island,NY)和产生重组人酶的CHO 细胞系实施。 [0278] 2-L和20-L  Wave生物反应器中的分批种子训练培养 [0279] 将高密度(HD)细胞库小瓶(10x  107活细胞/mL，4.5mL/小瓶)以1-L工作体积融解 于2-L  Wave细胞袋(cell  bag)(GE  Healthcare,Piscataway,NJ)。当2-L  Wave细胞袋中的 活细胞密度达到3.0x  106活细胞/mL时，将培养物以7.5-L工作体积扩充至20-L  Wave细胞 袋。将Wave生物反应器系统(Model  20/50EHTD)(GE  Healthcare)用作2-L和20-L  Wave细胞 袋两者的摇动平台。将培养维持在37℃的温度、16RPM摇动速度和7°摇动角度。将20％O2和 5％CO2的气体混合物以0.25slpm的流速添加至顶部空间。 [0280] 种子训练N-1灌注培养 [0281] 将配备有ATF4灌注装置(Refine  Technology,Pine  Brook,NJ)的15-L玻璃灌注生 物反应器(Broadley-James  Corporation,Irvine,CA)用于模拟种子训练培养N-1阶段(如 图1中所示的50-L生物反应器)。通过20μm烧结喷雾器(sintered  sparger)添加氧气以控制 40％的溶氧并通过1-mm钻孔喷雾器添加氮气以控制120mm  Hg以下的溶解的CO2水平。通过 添加0.5M碳酸钠将生物反应器培养pH维持6.85以上。添加10％消泡溶液(FoamAway ,Life  Technologies,Grand  Island,NY)以根据需要控制泡沫水平。 [0282] 以0.5x  106活细胞/mL接种10-L工作体积的15-L生物反应器并以分批模式操作培 养直至第2日灌注开始时。使用在线电容传感器(Aber  Instruments,Aberystwyth,UK)和可 编程逻辑控制器(DeltaV)将灌注速率初始控制在0.2nL/细胞/日的细胞-比灌注速率 (CSPR)。在活细胞密度达到20x  106细胞/mL之后，将灌注速率以4倍生物反应器体积每日 (RV/日)封顶(capped)。 [0283] 用于接种密度评估的50-mL旋管分批再补料模型 [0284] 当其细胞密度达到25x  106活细胞/mL、50x  106活细胞/mL和100x  106活细胞/mL时 从种子训练N-1生物反应器移出培养物的等分试样，并随后在10mL的工作体积中以三种不 同的接种密度一式三份接种入50-mL旋管(TPP  Techno  Plastic  Products  AG , Trasadingen,Switzerland)：0.5x  106活细胞/mL、2.5x  106活细胞/mL或5.0x  106活细胞/ mL。再补料一日实施一次，因为连续灌注不可能在此规模实施。通过从温育器移出旋管，以 45 CN 111575225 A 说　明　书 43/44 页 1100RPM离心细胞5分钟，移出上清液然后添加新鲜培养基以重悬细胞在第1日开始实施再 补料。再补料策略经设计以在不同的接种密度条件下提供相同的CSPR。将所有旋管以37℃ 的温度、160RPM的摇动速率、相对于台面(benchtop)45度的摇动角度、80％相对湿度和5％ 的CO2浓度维持在Multitron  II震荡温育器(HT  Infors,Bottmingen,Switzerland)中。 [0285] 生产生物反应器 [0286] 为了模拟图1中显示的500-L生产生物反应器，使用具有20μm烧结喷雾器以控制 40％的溶氧的ATF4灌注装置(Refine  Technology,Pine  Brook,NJ)，以灌注模式操作工作 体积为10L的15-L生物反应器(Broadley-James  Corporation,Irvine,CA)并通过1-mm钻孔 喷雾器添加氮气以控制120mmHg以下的溶解的CO2水平。通过添加0.5M碳酸钠将pH保持在 6.85以上。通过蠕动泵添加10％消泡溶液(FoamAway,Life  Technologies,Grand  Island , NY)以控制泡沫水平。 [0287] 从以分批模式操作的种子容器以低密度(0.5x  106活细胞/mL)接种一组生产生物 反应器。灌注在第1日以0.5RV/日开始并每日增加0.5RV/日直至达到2RV/日灌注速率。当密 度达到50x  106活细胞/mL时，从N-1  15-L灌注种子容器以高密度(5.0x  106活细胞/mL)接种 另一组生产反应器。由于高接种密度，在接种后立即以2RV/日开始灌注。对于所有生产生物 反应器，使用在线电容传感器和抽动泵(bleed  pump)将活细胞密度控制在40x  106活细胞/ mL。所有生产生物反应器操作50日。 [0288] 分析方法 [0289] 使用ViCell  XR细胞活力分析仪(Beckman  Coulter,Brea,CA)确定活细胞密度。使 用RAPIDLab  Blood气体分析仪(Siemans,Tarrytown,NY)测量离线pH和pCO2。通过专有的光 度酶活性测定法测量蛋白质生产力。 [0290] 结果和讨论 [0291] 图3显示这些实施例中所述的例示性种子训练方法的活细胞密度生长概貌，包括 分批Wave培养和N-1灌注培养。分批2-L和20-L  Wave培养物的持续时间分别为8日和5日。将 N-1灌注生物反应器操作12日并达到110x  106活细胞/mL的最终活细胞密度和>98％的细胞 活力。活细胞密度在第9日达到50x  106细胞/mL，其为以5x  106活细胞/mL(来自50-L  N-1生 物反应器)接种500-L生物反应器所需的细胞密度。 [0292] 对于N-1生物反应器，灌注在第2日起始并使用在线电容探针控制以随着细胞密度 增加而自动增加补料速率从而维持0.2nL/细胞/日的CSPR。此灌注速率控制策略的成功取 决于电容探针准确估计活细胞密度的能力。此策略仅使用至第7日，因为灌注速率以4RV/日 封顶，但探针能够准确估计整个运行中至第12日达到110x  106活细胞/mL时的密度(图4)。 [0293] 使用小规模旋管模型以评估N-1细胞密度对于生产生物反应器中细胞生长的影 响。当细胞密度分别为25x  106活细胞/mL、50x  106活细胞/mL或100x  106活细胞/mL时，从N- 1生物反应器去除培养物的样品。将这些分成三个等分试样，用新鲜培养基稀释至0.5x  106 活细胞/mL、2.5x  106活细胞/mL或5x  106活细胞/mL，然后一式三份接种入旋管(作为灌注生 产生物反应器的模型(modeling))。当培养物分成它们各自的接种密度时，由于达到的稀释 度直到第1日才实施每日再补料。基于旋管的接种密度调节再补料速率以允许每个接种密 度条件在相应的细胞密度经历相同的CSPR。 [0294] 细胞计数和活力概貌示于图5-7并经绘制以使在每个接种密度可在N-1密度条件 46 CN 111575225 A 说　明　书 44/44 页 之间进行比较。因为旋管模型中的最大灌注速率为1RV/日，因此培养物仅生长至20x  106活 细胞/mL以使CSPR匹配于灌注生物反应器模型。对于测试的所有三种接种密度，在不同的N- 1密度条件之间没有可观察到的生长差异。 [0295] 为了研究N-1密度和接种密度对于生产生物反应器细胞生长和生产力的作用，将 生物反应器以来自50x  106个活细胞/mL的N-1生物反应器的5.0x106活细胞/mL接种，并与以 来自2.5x  106活细胞/mL的N-1生物反应器的0.5x  106个活细胞/mL接种的生物反应器相比 较。两种条件的细胞生长是可比较的，如图8中所示。对于两种接种条件在50日运行中细胞 活力保持90％以上。图9显示累积的生产力对积分的(integrated)活细胞密度(作图)并指 示不同条件之间类似的比生产速率。最值得注意的是，40x  106活细胞/mL的稳态细胞密度 (图8)和纯化所需的效价对于高接种密度条件早达到4-5日。 [0296] 本文所述的例示性种子训练方法具有经济的和操作的两种优势。例如，对于50-日 运行，以5.0x  106细胞/mL接种500-L灌注生产生物反应器使生长期持续时间减少4-5日，使 生产力增加10％。此外，N-1灌注生物反应器能够达到100x  106活细胞/mL，并可理论上以 10x  106活细胞/mL接种500-L生物反应器，进一步减少生长期持续时间(例如，总共减少5-6 日)。 [0297] 本文所述的例示性种子训练方法还可用于接种以分批或补料分批模式操作的生 产生物反应器。对于使用500-L生物反应器的21-日补料分批细胞培养方法，5.0x  106活细 胞/mL的接种密度可使生产生物反应器持续时间减少25％。总之，这可允许每年额外的5-6 批，使制造生产力增加25％-30％。 [0298] 在大多数情况中，分批和补料-分批(fed-batch)方法通常使用比用于灌注方法的 那些大得多的生产生物反应器，这需要大规模不锈钢生物反应器中的几个种子训练培养阶 段。图2显示用于接种10,000-L生物反应器的常规种子训练方法的实施例，与使用具有ATF 灌注装置的50-L  N-1生物反应器的种子训练方法相比。使用本文所述的例示性种子训练方 法，50-100x  106活细胞/mL的50-L  N-1生物反应器能够以0.25x  106活细胞/mL至0.50x  106 活细胞/mL接种10,000-L生物反应器，从而消除两个中间的种子训练细胞培养阶段。 [0299] 此实施例中所述的数据证明涉及HD细胞储库(cell  banking)、可丢弃的单次使用 的生物反应器技术和N-1生物反应器阶段的灌注培养的例示性种子训练方法。本文提供的 种子训练方法通过减少小规模培养阶段的数目降低了常规种子训练方法的复杂性。此实施 例中所述的数据显示在N-1阶段使用灌注培养可在12日实现多至100x  106活细胞/mL的活 细胞密度而无损进一步扩增步骤后的培养生长特性。基于这些数据，本文所述的例示性种 子训练方法可用于以5x  106活细胞/mL的细胞密度接种500-L生产生物反应器以将至稳态 细胞密度的时间减少4-5日并在50日运行的总生产力方面提供10％的增加。对于需要较大 的(如10,000-L)生产生物反应器的分批或补料分批方法，本文提供的种子训练方法可通过 在N-1阶段使用单个50-L灌注生物反应器而从扩增过程消除1-2个阶段。 47 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 1/6 页 图1 48 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 2/6 页 图2 49 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 3/6 页 图3 图4 50 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 4/6 页 图5 图6 51 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 5/6 页 图7 图8 52 CN 111575225 A 说　明　书　附　图 6/6 页 图9 53