技术摘要：
本发明公开了一种翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因组序列及其构建方法，以及翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因及其编码蛋白。其中AMHY基因组序列如SEQ ID NO：1所示，AMHY基因序列如SEQ ID NO：4所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，还公开了基于翘嘴鳜A  全部
背景技术：
性别特异分子标记是实现鱼类单性育种及阐述其性别决定分子机制的重要前提。 近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，越来越多鱼类的性别特异分子标记被鉴定出来， 如 大 黄 鱼 ( L a r i m i c h t h y s c r o c e a ) 、乌 鳢 ( C h a n n a a r g u s ) 、鲢 鱼 (Hypophthalmichthysnobilis)和鳙鱼(Hypophthalmichthys  molitrix)等。然而，尽管利 用高通量测序方法在多种鱼中找到性别特异分子标记，然而其中大多数鱼类的性别决定基 因仍未可知，增加了鱼类性别决定分子机制的解读难度。 抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian  hormone,AMH)，是TGF-β超家族成员，与缪勒氏 管的发育密切相关。哺乳动物的雄性发育过程中amh能诱导缪勒氏管退化，阻止其生殖器官 向雌性的发育，促进中肾管发育成雄性生殖器官。硬骨鱼类没有缪勒氏管，但近年来，已在 多种鱼类中的研究表明amh基因参与性别决定与分化过程。并且在银汉鱼和白斑狗鱼中均 发现两个amh基因，一个存在于常染色体，另一个复制基因amhy存在于Y染色体。并且对amhy 进行敲除或敲降后，雄鱼均会性逆转成雌鱼，说明amhy是这两种鱼性别决定基因。此外，在 罗非鱼中也发现amhy的存在，并且研究表明amhy/amhrII在罗非鱼性别决定中起决定性作 用。 翘嘴鳜(Siniperca  chuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)，鳜科(Sinipercidae)， 鳜属(Siniperca)，俗称桂花鱼，其英文名译为满洲鱼(Mandarin  Fish)，在我国具有悠久的 食用史。翘嘴鳜肉质鲜美，营养丰富且无肌间刺，是淡水鱼类珍品，深受消费者喜爱。翘嘴鳜 的生长过程呈性别二态性，同龄商品鱼，雌鱼的体重比雄鱼重约10-20％，因此实现翘嘴鳜 全雌养殖具有更高的经济效益。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因组序列 及其构建方法，以及翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因及其编码蛋白和构建方法。 本发明的第二个目的在于提供基于翘嘴鳜AMHY基因的雄性分子标记引物，以及利 用该引物鉴定翘嘴鳜鱼鉴定的方法。 本发明的第三个目的在于提供上述翘嘴鳜AMHY基因、编码蛋白和引物在翘嘴鳜鱼 全雌性育种方面的应用。 本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种翘嘴鳜雄性特异抗 缪勒氏管激素AMHY基因组序列，所述AMHY基因组序列如SEQ  ID  NO：1所示。 优选的，所述翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因组序列的构建方法，包括 以下步骤： 3 CN 111593055 A 说　明　书 2/6 页 (1)鳜鱼DNA样品制备； (2)测序文库构建和高通量测序； (3)Y染色体特异DNA片段的富集：主要包括雄鱼基因组组装，通过雌雄比对和深度 分析获得雄鱼Y染色体候选DNA片段，然后对雄性Y染色体特异DNA进行注释，得到AMHY基因 组序列。 本发明提供的翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因，所述AMHY基因的核苷酸 序列如SEQ  ID  NO：4所示；即翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因组序列的蛋白编码 基因的核苷酸序列。 所述AMHY基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID  NO：5所示。 所述翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因的构建方法，包括以下步骤： (1)翘嘴鳜雄性性腺总RNA提取； (2)以步骤(1)中的RNA为模板，oligo  dT为引物，进行cDNA链的合成； (3)以cDNA为模板，以SEQ  ID  NO：2和SEQ  ID  NO：3所示的序列为引物，通过PCR，得 到翘嘴鳜雄性特异抗缪勒氏管激素AMHY基因。 本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于翘嘴鳜AMHY基 因的雄性分子标记引物，所述引物包括上游引物AMHY-F和下游引物AMHY-R，其中上游引物 AMHY-F的核苷酸序列如SEQ  ID  NO：6所示，下游引物AMHY-R的核苷酸序列如SEQ  ID  NO：7所 示。 本发明提供的翘嘴鳜鱼性别鉴定的方法，包括以下步骤： (1)设计并合成上述的雄性分子标记引物； (2)提取翘嘴鳜鱼DNA； (3)以步骤(2)中的DNA为模板，采用上述的引物进行PCR扩增，反应结束后，进行电 泳检测，若结果显示两条DNA特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼为雄性，若电泳结果显示 只有一条特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼为雌性。 优选的，步骤(2)中DNA采用柱式离心法提取。 优选的，步骤(3)中PCR扩增时，20μL  PCR反应体系中包含DNA50  ng，上、下游引物 各0.8μL，2×Taq  MasterMix  10μL，其余用ddH2O补充。 优选的，PCR反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72 ℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。 优选的，步骤(3)中进行电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳 检测扩增片段的长度。 优选的，步骤(3)电泳结果显示雌鱼单一扩增雄鱼双带扩增，在雄鱼中扩增出的特 异性条带的分子大小为803bp和427bp，在雌鱼中扩增出的条带大小为803bp。 本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的AMHY基因、所述 AMHY基因的编码蛋白以及上述的雄性分子标记引物在翘嘴鳜鱼全雌性育种方面的应用。 与现有技术相比，本发明具有如下优点： (1)本发明基于雌雄翘嘴鳜的基因组高通量测序数据，利用基因组组装和比对等 分析方法，快速、准确的筛选出翘嘴鳜雄性特异AMH基因组序列，并首次克隆获得其全长编 码区序列，该基因为雄鱼特有基因，参与雄性性别决定过程。 4 CN 111593055 A 说　明　书 3/6 页 (2)本发明方法建立了一种利用翘嘴鳜雄性特异AMH基因进行翘嘴鳜鱼性别鉴定 的方法，利用一对特异性引物对，完成一个PCR反应就可以鉴别翘嘴鳜鱼性别，相较于通过 测交判别父本性别的方式，效率高，耗时短，节省资源。 (3)本发明开发的雄性分子标记引物可实现翘嘴鳜性别的快速准确鉴定，开发的 性别鉴定方法简短，效率高。 附图说明 图1为实施例1中Y染色体候选片段获取示意图； 图2为实施例1中AMHY和AMH基因组序列外显子(exon)和内含子(intron)分布图； 图3为实施例1中AMHY和AMH蛋白编码区比对结果； 图4为实施例2中仅在雄性样本中检测到两条扩增片段，在雌性样本中只检测到一 条扩增片段的PCR产物电泳图； 图5为实施例2中引物AMHYF/R的雌雄个体(80尾)检测PCR产物电泳图。