技术摘要：
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因Bna‑miR169n的分离克隆和应用，本发明分离和应用一种包含基于Bna‑miR169n序列改造得到的核苷酸片段Bna‑MIM169n，该片段赋予甘蓝型油菜抗旱性增强的能力。本发明从甘蓝型油菜中分离Bna‑miR169n基  全部
背景技术：
油菜是我国重要的食用油来源。2017年全国油菜种植面积为6653千公顷，油菜籽 产量达到1327.41万吨，约占油料作物总播种面积和产量的40％(中华人民共和国农业和农 村部http://www.moa.gov.cn/sjpre/)。中国人民共和国农业农村部提出力争将2020年油 料作物种植的总面积稳定在1.9亿亩，其中油菜是可以满足自给的重要潜力作物(http:// www.moa.gov.cn/govpublic/ZZYGLS/202002/t20200210_6336809.htm？keywords＝％E6％ B2％B9％E8％8F％9C)，具有重要的经济地位。油菜是十字花科芸薹属成员，主要分为白菜 型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜。甘蓝型油菜起源于欧洲，其产量和品质与其他两个栽培 种相比具明显的优势，而且其具有高抗病、抗逆、适应性广等特征，因此被认为是具有最大 利用潜质的油料作物之一，也是目前中国栽培面积最广的油菜类型。油菜不仅能够用于生 产优质的食用油，而且也是高蛋白饲用饼粕的重要来源，且甘蓝型油菜的主要生命周期在 冬季和春季完成，不与水稻等粮食作物争地，具有较大利用潜质。然而，甘蓝型油菜在生长 过程中会受到各种生物和非生物胁迫的影响，这些不利的环境因素严重制约了甘蓝型油菜 的产量。到目前为止，甘蓝型油菜逆境应答的研究尚不深入，如何从根本上解决由于油菜逆 境胁迫而导致的产量降低也还未找到有效的方法。解析甘蓝型油菜逆境应答的调控机制、 改良油菜抗逆性是甘蓝型油菜理论研究和育种实践中重要的工作内容。
技术实现要素：
本发明提供一种基于Bna-miR169n、基因改造片段Bna-MIM169及其在控制甘蓝型 油菜抗旱性中的应用。利用qPCR手段分析了甘蓝型油菜中Bna-miR169n成熟序列在干旱胁 迫条件下的表达变化情况，结果显示在干旱条件下，Bna-miR169n的表达显著下降。本发明 分离和应用一种包含Bna-MIM169n的DNA片段，该片段赋予甘蓝型油菜提高叶片抗旱性的能 力。 为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为： 一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因，所述基因为Bna-miR169n，其核苷酸序列如序列 表SEQ  ID  NO：1所示； 或基于Bna-miR169n改造的Bna-MIM169n，其核苷酸序列如序列表SEQ  ID  NO：2所 示。 所述的Bna-miR169n的成熟序列如序列表SEQ  ID  NO:1所示，序列长度为21bp，基 4 CN 111593058 A 说　明　书 2/8 页 于Bna-miR169n成熟序列改造的Bna-MIM169n序列如序列表SEQ  ID  NO:2所示，序列长度为 24bp。 一种甘蓝型油菜抗旱调控基因。所述基因是如下(a1)-(a3)中任何一种的核苷酸 序列： (a1)SEQ  ID  NO:1或SEQ  ID  NO：2所示的核苷酸序列； (a2)在严格条件下与(a1)限定的核苷酸序列杂交且编码甘蓝型油菜抗旱性调控 相关蛋白的DNA分子； (a3)与(a1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少 具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者 至少具有99％同源性的甘蓝型油菜抗旱性调控相关DNA分子。 本发明的另一个目的是提供含有前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转 基因细胞系。 本发明还提供所述的控制甘蓝型油菜抗旱性基因在转基因甘蓝型油菜中的应用。 本发明的又一个目的是提供(b1)或(b2)或(b3)的应用： (b1)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系，在调控甘蓝型油菜抗旱性中的应用； (b2)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系，在培育甘蓝型油菜新品种中的应用； (b3)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞 系，在调控植物抗旱性中的应用。 本发明还提供一种培育提高植物抗旱性的转基因植物的方法，为提高目的植物中 所述核苷酸片段的含量或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性增加。 一种培育提高植物抗旱性的转基因植物的方法，采用前述方法培育得到转基因植 物；所述的转基因植物含有甘蓝型油菜干旱调控基因。 本发明还提供了一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因重组载体的构建方法，所述基因 为前述控制甘蓝型油菜抗旱性基因，所述方法包括以下步骤：将包含Bna-MIM169n基因片段 的克隆载体质粒经SpeI AscI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段，将此片段与 相应酶切的pMDC83骨架载体相连构建成Bna-miR169n基因的target  mimicry载体。 本发明还提供一种抗旱转基因植物的培育方法，对上述构建方法构建的载体进行 农杆菌转化，利用农杆菌介导法实现外源片段在甘蓝型油菜中的遗传转化，得到转基因植 物。 进一步的，所述遗传转化方法包括： 种子灭菌； 将种子接种于M0培养基上，温室避光培养； 将-70℃保种的农杆菌菌株活化，提前一天挑取单菌落接种于含有Kan和Gen抗性 的LB液体培养基摇菌，28℃摇床250rpm培养过夜至菌液浓度OD600＝0.3；25℃6000rpm离心 5min，弃上清，用DM液重悬两次并再次离心，弃上清； 将幼苗下胚轴切割为长度为1.0-1.5cm的小段，转移到配制好的DM侵染液中暂存， 将重悬好的农杆菌菌液加入DM侵染液中侵染10min；然后将外植体转移到M1培养基上，24℃ 5 CN 111593058 A 说　明　书 3/8 页 黑暗条件下共培养36h至48h； 将外植体从M1培养基上转入含250mg/L  Hyg的M2培养基中，25℃光照培养15～20d 后，将存在明显愈伤组织的外植体转移到含250mg/L  Hyg的M3培养基中，每隔15～20d继代 一次，直至出现绿色幼苗； 将具有明显生长点的幼苗移至M4培养基上，25℃光照培养2～4周直至生根； 炼苗和移栽。 本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜抗旱品种的方法，提取甘蓝型油菜基因组DNA， 检测前述控制甘蓝型油菜抗旱性基因的表达量。 进一步的，引物序列如SEQ  ID  NO:12所示。 携带有本发明Bna-MIM169n的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接 DNA转化、微注射、电击转化等常规生物技术方法导入植物细胞。 可使用包括本发明的Bna-MIM169n的表达载体转化宿主(包括甘蓝型油菜在内的 多种植物)，培育产量相对提高的植物品种。植物宿主还可以为水稻、烟草、大豆、番茄、小麦 等。 利用DNA回收试剂盒回收包含Bna-miR169n基因成熟序列的DNA片段，将IPSI上与 miR399结合的区域通过设计特定引物改造，利用酶切连接的方法，将此片段连入pMDC83骨 架载体，构建该基因的过量表达载体，命名为pMDC83-Bna-MIM169n。 利用电击转化法将pMDC83-Bna-MIM169n载体导入GV3101农杆菌。借助农杆菌侵染 介导的遗传转化方法将pMDC83-Bna-MIM169n转化甘蓝型油菜受体材料J9712，成功获得了 Bna-miR169n基因表达量相对于对照显著降低的转基因植株，观察发现，与对照植株相比， 过表达Bna-MIM169n的转基因甘蓝型油菜在自然干旱条件下，植株长势较好，说明Bna- MIM169n能够调控植物抗旱性。 有益效果 本发明以甘蓝型油菜为研究材料，通过分析甘蓝型油菜在正常条件下和干旱胁迫 条件下miRNA的表达水平，发现Bna-miR169n在正常条件下和干旱胁迫条件下显著差异表 达，可能在提高植物抗旱性中起重要作用。 甘蓝型油菜是我国食用油的主要来源之一，提高甘蓝型油菜的产量和抗逆性是目 前油菜育种工作的重要目标之一。本发明中，基于Bna-miR169n基因片段改造的Bna- MIM169n能够提高甘蓝型油菜的抗旱能力，说明Bna-miR169n基因参与了甘蓝型油菜的干旱 应答。因此，从甘蓝型油菜中分离Bna-miR169n基因，并鉴定其在增强甘蓝型油菜抗旱性方 面的生物学功能，对于培育抗逆性增强的甘蓝型油菜新品种具有十分重要的实践意义。 附图说明 图1  Bna-miR169n在甘蓝型油菜干旱条件下的表达情况； 图2  Bna-miR169n  target  mimicry载体(pMDC83-Bna-MIM169n)构建示意图； 图3  Bna-miR169n在pMDC83-Bna-MIM169n转基因阳性植株中的表达情况，CK为转 基因阴性植株；其余编号的植株为pMDC83-Bna-MIM169n转基因阳性甘蓝型油菜； 图4  Bna-MIM169n转基因甘蓝型油菜的抗旱性表型，其中CK为对照植株；Bna- MIM169n为Bna-miR169n的转基因甘蓝型油菜。 6 CN 111593058 A 说　明　书 4/8 页 图5  Bna-MIM169n转基因甘蓝型油菜干旱应答相关基因的表达水平。