技术摘要：
本发明涉及利用β‑1,6‑葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明首先提供了一种利用对龙胆二糖具有转糖基活性的β‑1,6‑葡聚糖酶TcBgn，其可在加酶量较低的情况下将葡萄糖转化为低聚龙胆糖，且转化率高，可显著降低生产成本。  全部
背景技术：
低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1，6糖苷键连接形成的功能性低聚糖，包括龙胆二糖和 少量的三、四糖。低聚龙胆糖不被人体肠道消化吸收，但却有利于双歧杆菌和乳酸菌的繁殖 和生长，适合糖尿病等人群食用，其高保湿性能有利于保持食品中的水分，可防止淀粉老 化；同时低聚龙胆糖耐热性高，适用于需要高温处理的食品；其成分中的龙胆三糖具有独特 的、柔和的柔和的提神苦味，具有良好的保健效果。目前，低聚龙胆糖被广泛运用于巧克力、 冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。 低聚龙胆糖酶法生产相关研究主要集中在利用β-葡萄糖苷酶以葡萄糖为底物通 过逆水解缩合作用形成产物，但目前报道的β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖生产过程中主要存 在三个问题，一是低聚龙胆糖产率低，二是产物中只含有龙胆二糖，未检测到龙胆三糖及更 高聚合度的低聚龙胆糖组分，三是用酶成本高。研究资料显示，龙胆三糖和龙胆四糖具有比 龙胆二糖更好的促双歧杆菌益生活性。 β-1,6-葡聚糖酶(EC  3.2.1.75)是一种可水解β-1,6葡聚糖的糖苷水解酶，水解终 产物为龙胆二糖。然而，部分研究显示，自然界中还存在部分β-1,6-葡聚糖酶对龙胆二糖具 有微弱的水解活性，可利用龙胆二糖为底物转苷合成龙胆三糖甚至四糖。如Fujimoto等以 聚合度为2～6的低聚龙胆糖为底物测试β-葡聚糖酶时发现，随着聚合度的降低，酶对底物 的水解活力也会随之下降，假定对六糖的水解活力为100％，那么对于二糖则不到1％，而只 有对二糖具备一定水解活力的酶，才能够以龙胆二糖为底物合成更高聚合度的低聚龙胆 糖。由此可见，在目前的生产和研究中，对于如何制备聚合度更高的龙胆三糖仍然是一个亟 待解决的问题。
技术实现要素：
为解决目前存在的问题，本发明提出一种利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的 方法及其应用，提高低聚龙胆糖的转化率和产物中龙胆三糖的占比，提升产品品质。 本发明的第一个目的是提供一种利用β-1 ,6-葡聚糖酶单酶法制备低聚龙胆糖的 方法。 在本发明的一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖为底物。 在本发明的一种实施方式中，所述β-1 ,6-葡聚糖酶是来源于解纤维素蓝状菌 Talaromycescellulolyticus的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn，其氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 在本发明的一种实施方式中，以70～90％的葡萄糖为底物，β-1 ,6-葡聚糖酶加酶 量为400～1600U/g葡萄糖，在pH  3.5～4.5、温度40～50℃下进行酶反应，反应48～96h。 本发明的第二个目的是提供一种利用β-葡萄糖苷酶和β-1 ,6-葡聚糖酶协同制备 3 CN 111593034 A 说　明　书 2/6 页 低聚龙胆糖的方法。 在本发明的一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖为底物。 在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶和β-1,6-葡聚糖酶均来源于解纤 维素蓝状菌Talaromycescellulolyticus；所述β-葡萄糖苷酶为β-葡萄糖苷酶TcBgl3A；所 述β-1,6-葡聚糖酶为β-1,6-葡聚糖酶TcBgn；β-1,6-葡聚糖酶TcBgn的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1；β-葡萄糖苷酶TcBgl3A的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 在本发明的一种实施方式中，以70～90％葡萄糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为 200～600U/g葡萄糖，同时β-1,6-葡聚糖酶加酶量为400～800U/g葡萄糖，在pH  4.0～5.0、 温度50～60℃下反应36～60h。 在本发明的一种实施方式中，所述低聚龙胆糖包括龙胆二糖和龙胆三糖。 本发明第三个目的是提供一种提高龙胆三糖产量的方法，所述方法以葡萄糖为底 物。 在本发明的一种实施方式中，加入氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示的β-1 ,6-葡聚 糖酶。 在本发明的一种实施方式中，加入氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示的β-1 ,6-葡聚 糖酶，和氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示的β-葡萄糖苷酶。 本发明的第四个目的是提供表达所述β-1,6-葡聚糖酶的基因工程菌，所述基因工 程菌以毕赤酵母为宿主，表达氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示的β-1,6-葡聚糖酶。 本发明的第五个目的是提供一种构建所述基因工程菌的方法，所述方法是将核苷 酸序列为SEQ  ID  NO.3的编码β-1,6-葡聚糖酶的基因连接到表达载体pPIC9K上，得到重组 质粒；将重组质粒转化至毕赤酵母KM71中，得到表达β-1,6-葡聚糖酶的基因工程菌。 本发明的第六个目的是提供一种生产β-1,6-葡聚糖酶的方法，所述方法包括：(1) 分批发酵阶段：将种子液以8％-12％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-30℃、初始转速 180-220rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32％、pH  4.5-5.5；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升 至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、pH  4.5-5.5。 在本发明的一种实施方式中，当菌体OD600在150～200，添加体积比为1～1.5％的 甲醇、在25～30℃下诱导产酶，同时控制溶氧28-32％、pH  4.5-5.5，诱导96-144h。 本发明还保护所述利用β-1,6-葡聚糖酶单酶法制备低聚龙胆糖的方法，或利用β- 葡萄糖苷酶和β-1 ,6-葡聚糖酶协同制备低聚龙胆糖的方法，或提高龙胆三糖产量的方法， 或表达所述β-1,6-葡聚糖酶的基因工程菌，或生产β-1,6-葡聚糖酶的方法在制备低聚龙胆 糖中的应用。 本发明的有益效果： 目前已报道以葡萄糖为底物酶法制备低聚龙胆糖最高水平为，绿色木霉 Trichoderma  viride来源的β-葡萄糖苷酶在80％葡萄糖的底物浓度下，加酶量为900U/g葡 萄糖，制备低聚龙胆糖转化率为16.25％。 本发明所提供的β-1 ,6-葡聚糖酶TcBgn能以葡萄糖为底物单酶制备低聚龙胆糖， 在加酶量400～800U/g葡萄糖时，低聚龙胆糖转化率可达19.21％～19.84％；在最佳反应条 件下，以80％葡萄糖为底物制备低聚龙胆糖转化率可达到19.96％，高于目前已知报道以葡 4 CN 111593034 A 说　明　书 3/6 页 萄糖为底物单酶制备低聚龙胆糖的最高转化率，并且，三糖的比例可达1.35％～1.93％。 本发明还提出了一种利用β-1 ,6-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双酶复配制备低聚龙 胆糖的方法，以上述β-1,6-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶构建协同反应体系，在最佳反应条件 下，以80％葡萄糖为底物，低聚龙胆糖转化率最高可达到23.83％，且产品组分中龙胆三糖 含量明显增加，三糖比例可达2.97％～4.00％，为目前报道中以葡萄糖为底物制备得到的 最高产率，极大提升了产品品质。 附图说明 图1是单酶法或双酶法制备低聚龙胆糖的方法示意图。 图2是重组β-葡萄糖苷酶TcBgl3A在3.6L罐发酵上清酶活曲线和SDS-PAGE电泳图。 图3是重组β-1,6葡聚糖酶TcBgn在3.6L罐发酵上清酶活曲线和SDS-PAGE电泳图； 图4是温度和pH对重组β-葡萄糖苷酶TcBgl3A酶活性的影响。 图5是温度和pH对重组β-1,6葡聚糖酶TcBgn酶活性的影响。