技术摘要：
本发明公开了一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒及检测方法。本发明的技术方案为：检测方法主要步骤为：1.选取公开的微型基因条形码序列为引物，以提取自待测样品中的DNA为模板进行PCR扩增；2.对PCR扩增产物直接进行高分辨熔解；3.采用My  全部
背景技术：
DNA条形码是一段较短的标准DNA序列，是物种的一种身份识别系统。自2003年加 拿大科研人员Hebert等人提出用线粒体细胞色素c氧化酶（COI）作为DNA条形码来进行识别 物种身份后，关于DNA条形码的分析和研究开始发展和扩大。DNA条形码的识别主要依据物 种的种内保守性和种间多样性。由于DNA条形码不受形态学方法限定，操作简单，近年来在 动物，植物，微生物方面取得了广泛应用。经过筛选和研究分析，植物条形码多采用rbcL和 matK区域序列，动物条形码一般为线粒体细胞色素c氧化酶（COI）。在分析深加工产品和短 片段的目标基因时，长片段的DNA条形码（~650bp）应用受到限制。本发明采用的微型基因条 码大小为192bp，更适合各种原材料及其加工产品的分析，同时具有更高的分辨率。在实际 应用中基因条形码需要结合PCR以及测序来完成，通过PCR富集和筛选靶目标，测序获得PCR 扩增产物的序列信息，经过在线数据库（BOLD/NCBI）的分析比对，最终确定分析对象的身份 信息。但由于测序价格高且耗时长，使得条形码方法无法得到广泛应用。本发明提出HRM分 析结合DNA条形码的检测方法。 HRM是一种实时PCR结合饱和染料和高分辨率仪器来检测样本荧光信号的方法，通 过分析采集的荧光信息和熔解曲线，来进行基因筛选和分型。对于70-300bp的基因序列， HRM可以实现单核苷酸多态性，短序列的插入和缺失的检测，具有很高的灵敏度。相比较于 普通熔解曲线而言，熔解曲线形状和位置重复性好，检测结果更加准确。DNA条形码结合HRM 可以实现闭管检测和鉴定多个目标序列，具有操作简单，检测范围广，检测速度快，灵敏度 高，高通量的优点。
技术实现要素：
本发明的目的是要提供一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源 性成分的试剂盒及检测方法，为微型基因条码结合HRM在掺假鉴定方面提供了方向和参考 数据，包括PCR反应体系参数，扩增程序和高分辨熔解程序，在发展真实性鉴定和原产地溯 源领域具有广阔的应用前景。 为实现以上目的，本发明采用以下技术方案： 一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的检测方法，具体包括 以下步骤： （1）根据样品中的不同动物源性成分的可能存在情况，确定需要鉴别的各动物源性成 分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，在NCBI查找微型基因条形码对应的DNA序列， 使用u-Melt软件在线拟合高分辨熔解曲线，判断是否可以达到区分目的，若可能存在的动 3 CN 111549145 A 说　明　书 2/5 页 物源性成分种类在GB/T  35918-2018所列的微型基因条形码可区分的范围内，则扩增片段 长度为192bp； （2）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的动物源 性成分对应的标准品DNA，制定高分辨熔解数据库； （3）利用微型基因条形码进行PCR扩增并使用高分辨熔解程序熔解实际样品中的DNA， 将其放入步骤（2）所得的标准高分辨熔解数据库中分析比对，区分和鉴别样品中动物源性 成分。 所述步骤（2）中，用于扩增的引物序列为： 上游引物： FISHCOILBC_ts：5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'； 下游引物: REVshort1：5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'。 所述PCR扩增体系为：5.00μL  2×Tap  PCR  Master  Mix，1.00μL（20ng/µL）  DNA模 板，10μM的正向引物和反向引物各0.20μL，0.50μL  20×EvaGreen染料，最后用超纯水将反 应体系补足至10.00μL。 所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；执行40个循环，包括94℃变性30s，51℃退 火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。 所述高分辨熔解程序为：初始温度65℃停留60s，熔解梯度为4℃/s，终止温度95℃ 停留1s，熔解梯度为0.05℃/s。 一种基于基因条形码及高分辨熔解曲线分析区分动物源性成分的试剂盒，包括： 微型基因条形码引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品的PCR扩增产物对应的高 分辨熔解曲线，所述对照品选自不同动物种类的基因组DNA或对应各动物种类的基因组DNA 的组合。 所述不同动物种类的基因组DNA 为山羊、绵羊、牛和水牛的基因组DNA。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明利用微型基因条形码引物进行PCR扩增，以提取自样品的DNA为模板，经过HRM分 析区分多个动物源性成分，实现了对样品中不同动物源性成分的鉴别。 本发明不需要单独设计通用引物或者特异性引物，统一采用微型基因条形码引 物，解决了特异性引物设计和优化困难，通用性引物通用范围小的不足，提高了检测通量和 降低了操作难度。 本发明扩增的的片段大小为192bp，对于经过高温，高压等深加工产品中降解的 DNA片段可实现有效扩增，且对于一些特定长度的短片段可以成功检测。 本发明采用的微型基因条形码可以同时扩增牛，水牛，绵羊，山羊四种物种，但不 仅限于此四种，还包括GB/T  35918-2018微型基因条形码下的共计64个物种，大大提高了检 测通量。 HRM具有很高的分别率和灵敏度，对于同一目标序列设置的多个重复对应的熔解 曲线基本重合，重复性良好，相比于普通熔解曲线的检测结果更准确，检测效果理想。 4 CN 111549145 A 说　明　书 3/5 页 附图说明 图1为山羊、绵羊、牛、水牛基因组DNA的鉴别图；A-理论拟合的熔解峰图；B-实验得 到的熔解峰图；C-PCR扩增曲线图；D-电泳验证图。 图2为山羊、绵羊、牛、水牛多组分混合差异化熔解曲线区分效果图；A  -单组份；B  -两组分；C-三组分和四组分（PCA）；D-多组分。 图3牛和山羊不同比例混合区分效果图；A-二维主成分分析图（PCA）；B-标准曲线 图。 图4为八种市售乳制品样品动物源性成分检测结果图；A  -归一化熔解曲线图；B  - 二维主成分分析图（PCA）。 图5为实际样品8的测序结果图。 图中，G-山羊基因组DNA、S-绵羊基因组DNA、B-牛基因组DNA、W-水牛基因组DNA、 NTC-空白对照组。