技术摘要：
本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码RNA(LETN)。特别地，本发明公开了lncRNA RP11‑196G18.22(LETN)在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关。降低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表 全部
背景技术：
近些年随着测序技术的快速发展，研究发现人类基因组上大量的非编码区会转录 出没有翻译活性的长链非编码RNA(lncRNA)，且数量远远超过蛋白。发现了数百种与人类各 种疾病或生理功能相关的lncRNA。特别是在癌症中，越来越多的证据证明了lncRNA在肿瘤 抑制或肿瘤发生中发挥协同作用[1]。然而，对于绝大多数lncRNA，其分子和生物学功能知 之甚少。 肝癌是全球第六大常见癌症在全球癌症发病中排名第五，每年约有 841000新发 病例和782000例死亡[2]，其中男性的发病率和死亡率要高出 2到3倍，在男性死亡中排名 第二。中国属于肝癌发病的高危国家，其主要是由于慢性HBV感染和黄曲霉毒素接触引起。 然而，尽管肝癌的发病率越来越高，但令人吃惊的是，治疗手段却少之又少。除了放射、移植 和外科手术等物理治疗方法，只有一种被批准的治疗晚期肝细胞癌的药物，索拉菲尼，但其 费用非常昂贵且平均只能延长2.8个月的寿命，并导致腹泻恶心等各种副作用[3]。 核仁是一个位于细胞核的非膜结构的亚核腔室，是进行rDNA转录和核糖体生物合 成等基本过程的重要细胞器。NPM1(也称为B23)是核仁中表达丰富的蛋白质，其蛋白序列含 有三个不同的结构域，N端结构域可以通过调控NPM1寡聚化和与其他蛋白质的相互作用来 影响其生物学功能,大量研究表明NPM1通过形成五聚物来发挥相应的功能。NPM1中心区域 是以高酸性区域的存在为标志的内在无序区，参与了与组蛋白的结合。C末端区域提供了一 个足够的平台，使其能够与核酸结合[4]。NPM1是一种重要的细胞蛋白，已被证明参与核糖 体的生物发生，染色质重构和中心粒复制等一系列生物学过程。当其异常表达或发生突变 时会引起胚胎发育异常和肿瘤的发生。
技术实现要素：
本发明人通过结合理论研究和实验手段，通过多组学数据挖掘工具，在癌症背景 下对可能具有潜在功能的lncRNA进行全面分析探究。在肝细胞癌(LIHC)中，本发明人通过 本实验室设计的算法，利用癌症基因组图谱 (TCGA)的数据对lncRNA进行功能调查，发现了 一条之前未被研究的 lncRNA RP11-196G18.22(我们命名为LETN)，预测其调节191对转录 因子和靶基因，可能在肝癌的发生发展中具有广泛而强大的调控潜力，并通过实验进行了 验证。 因此，本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码 RNA(lncRNA RP11-196G18.22，在本文中命名为LETN)，其在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞 增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关，因此可以作为肿瘤标志物及诊断标记。降 低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表达代表了癌症治疗的一个新策 3 CN 111575372 A 说 明 书 2/13 页 略。本发明还对LETN的作用机制进行了研究，发现LETN通过与NPM1 结合来发挥功能，通过 结合NPM1来影响rRNA的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展。 根据本发明的一个方面，提供了检测lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达水平的 试剂在制备癌症的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。检测 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表 达水平可以是检测其DNA或RNA 水平。 在一个实施方案中，本发明提供了诊断癌症的方法，所述方法包括检测受试者的 样品中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平，其中相对于对照(健康或正常样品)， LETN在受试者的样品中的过表达指示受试者患有癌症的(高)风险或患有癌症。 在一个实施方案中，本发明提供了检测lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达水平 的试剂，其用于诊断癌症。 在一个实施方案中，所述试剂为lncRNA RP11-196G18.22特异性探针、基因芯片或 PCR引物。 在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、 前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内 膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。 在另一个优选实施方案中，所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(Ensembl登录号ENST00000564237.1)所示。 根据本发明的另一个方面，提供了降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表 达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。 在一个实施方案中，本发明提供降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达 的试剂，其用作药物，特别是用作治疗癌症的药物。 在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受 试者施用有效量的降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达的试剂。 降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂的本质对于本发明来说并 不重要，只要它降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达即可。 根据一个优选实施方案，降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达的试剂 选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、 shRNA、miRNA、RNA适体、TALEN、 CRISPR和锌指核酸酶。在特别优选的实施方案中，用于反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR的具 体序列是本申请说明书实施例中使用的那些序列。 在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、 前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内 膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。 根据一个优选实施方案，所述lncRNA RP11-196G18 .22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(Ensembl登录号ENST00000564237.1)。 在另一个实施方案中，所述药物还包含另外的抗癌剂例如化疗药，例如用于降低 或抑制NPM1表达或突变的试剂或抑制LETN与NPM1的结合的试剂。或者所述药物与用于降低 或抑制NPM1表达或突变的方法或者抑制LETN与NPM1的结合的方法组合使用。即使lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的抑制足以实现治疗癌症的效果，但是预期将降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂与其他抗癌药物如化疗剂组合时，可以获得更强甚至协 4 CN 111575372 A 说 明 书 3/13 页 同的抗癌效果。由于本发明已经发现LETN是通过与NPM1结合来发挥功能，通过结合NPM1来 影响rRNA 的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展，因此这对于 具有降低或抑制NPM1表达或突变的抗癌药或化疗剂而言更是如此。 根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗癌药物的方法，所述方法包括下述 步骤： 1)确定过表达lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的细胞中lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)的表达水平； 2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触； 3)确定在步骤2)后细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；和 4)比较步骤1)和步骤3)中确定的lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达水平，其 中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗癌潜力，优 选所述细胞为癌细胞。 根据本发明的另一个方面，提供了鉴别一种肿瘤是否适合于以LETN 表达抑制剂 治疗的方法，所述方法包括以下步骤： 1)测定肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达相对于对照(正常或健康组织/细胞)是 否增加； 2)确定所述肿瘤是否适合于治疗，其中增加的表达表示适合于以 LETN表达抑制 剂治疗。 根据本发明的另一个方面，提供了评价药剂在治疗和/或预防癌症中的效果的方 法，其中所述方法包括测试所述药剂是否能够降低肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达，如 果能够降低，则说明所述药剂适合于治疗和/ 或预防癌症。在一个优选实施方案中，所述癌 症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、 肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺 癌。根据一个优选实施方案，所述LETN的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示(Ensembl登录号 ENST00000564237.1)。 附图说明 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 图1中A至J所示的结果显示LETN能够促进肝癌的发生发展。 A显示LETN在TCGA数据库中各种癌症和相关癌旁的表达情况 (CHOL：胆癌；LIHC： 肝癌；LUAD：肺腺癌；KIRC：肾透明细胞癌； BLCA：膀胱癌；BRCA：乳腺癌；PRAD：前列腺癌； READ：直肠癌； LUSC：肺鳞状细胞癌；UCEC：子宫内膜癌；PAAD：胰腺癌；HNSC：头颈部鳞癌； KIRP：乳头状肾细胞癌；COAD：结肠癌；STAD：胃癌； SARC：软组织癌；ESCA：食管癌；THCA：甲 状腺癌；THYM：胸腺癌； KICH：肾嫌色细胞癌；PCPG：肾上腺癌；CESC：宫颈鳞状细胞癌)，观察 到人类大部分癌症组织(实体瘤)中的LETN表达要高于相对应的癌旁组织；B显示在HUH7细 胞系中对LETN进行CRISPR-Cas9敲除，观察发现 LETN敲除组(sgLETN)细胞增殖速率要远远 低于对照(sgEV)；C所示为分别在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721，肺癌细胞系HCC827、前列腺 癌细胞系PC3、DU145对LETN进行敲低，检测发现LETN敲低组细胞增殖速率要远远低于对照 组细胞(siNC和siLMNA为两种不同的阴性对照。为防止脱靶效应，针对LETN设计两个siRNA 5 CN 111575372 A 说 明 书 4/13 页 敲低：siLETN-1和siLETN-2)； D，E所示为在HUH7和HCC827细胞中对LETN进行稳定敲低/敲 除后其细胞克隆形成能力明显被破坏；F所示为在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721 中对LETN进 行过表达，检测发现LETN过表达组细胞增殖速率要远远高于对照组细胞；G所示为在HUH7和 SMMC-7721细胞中对LETN进行稳定过表达后其细胞克隆形成能力明显增强；H所示为在肝癌 细胞系HUH7中对 LETN进行稳定敲低后观察到LETN敲低组其皮下成瘤能力显著降低；I所示 为在肝癌细胞系HUH7中对LETN进行稳定过表达后观察到LETN过表达组其皮下成瘤能力明 显增强(LETN-OE组为过表达LETN组，EV组为对照组)。 图2中A至E所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合发挥功能。 具体地，A所示为通过原位杂交实验发现LETN主要位于细胞和中且成团出现；B所 示为通过核质分离实验证实LETN大部分位于细胞核中， GAPDH和LaminA/C分别为细胞质和 细胞核的标志物；C所示为通过对 LETN相互作用的蛋白进行质谱分析，发现两次实验中 NPM1均是是结合能力最强的蛋白；D所示为通过细胞荧光共定位实验进一步证实了LETN 和 NPM1相互结合且定位于核仁中；E所示为在甲醛交联或未交联状态下通过NPM1进行拉下 (pull down)RNA,也发现NPM1确实能够拉下来 lncRNA LETN(图中MALAT1表示阴性对照)。 图3中A至C所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合影响rRNA 的产生和核小体的 装配功能来促进肝癌的发生发展(检测用抗体：鼠抗人 NPM1抗体(ab10530 ,abcam)， Histone H2A(EPR17470 ,ab177308 ,abcam) , Histone H2B(EP957Y ,ab52599 ,abcam) , Histone H3(17168-1-AP, proteintech) ,Histone H4(16047-1-AP,proteintech))。 具体地，A所示为在HUH7和HCC827细胞系中分别敲低LETN或 NPM1，均能明显降低 各种rRNA的表达，LETN和NPM1功能具有一致性；B所示为敲低LETN可以减弱NPM1和组蛋白的 结合能力，进而影响核小体的装配；C所示为对TCGA数据库中肝癌病人的临床资料分析生存 期分析，单独分成LETN或NPM1高表达组病人预后生存时间要比低表达组病人短；当继续细 分为NPM1-low LETN-low、NPM1-low LETN-high、 NPM1-high LETN-low、NPM1-high LETN- high四组时，发现NPM1和 LETN均高表达的病人其生存时间要远远低于NPM1和LETN均低表 达的病人。 图4中A至D所示的结果证明了LETN的各种敲低和过表达效率。 A所示为通过siRNA对五种细胞系进行LETN敲低，通过RT-qPCR检测敲低效率；B所 示为通过慢病毒shRNA对两种细胞系进行LETN敲低，通过 RT-qPCR检测敲低效率；C所示为 通过CRISPR-Cas9技术进行敲除LETN，通过RT-qPCR检测敲低效率；D所示为通过慢病毒过表 达系统对两种细胞系进行LETN过表达，通过RT-qPCR检测过表达效率。 图5表示敲低相应的lncRNA后对肝癌细胞系HUH7的增殖的影响。
本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码RNA(LETN)。特别地，本发明公开了lncRNA RP11‑196G18.22(LETN)在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关。降低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表 全部
背景技术：
近些年随着测序技术的快速发展，研究发现人类基因组上大量的非编码区会转录 出没有翻译活性的长链非编码RNA(lncRNA)，且数量远远超过蛋白。发现了数百种与人类各 种疾病或生理功能相关的lncRNA。特别是在癌症中，越来越多的证据证明了lncRNA在肿瘤 抑制或肿瘤发生中发挥协同作用[1]。然而，对于绝大多数lncRNA，其分子和生物学功能知 之甚少。 肝癌是全球第六大常见癌症在全球癌症发病中排名第五，每年约有 841000新发 病例和782000例死亡[2]，其中男性的发病率和死亡率要高出 2到3倍，在男性死亡中排名 第二。中国属于肝癌发病的高危国家，其主要是由于慢性HBV感染和黄曲霉毒素接触引起。 然而，尽管肝癌的发病率越来越高，但令人吃惊的是，治疗手段却少之又少。除了放射、移植 和外科手术等物理治疗方法，只有一种被批准的治疗晚期肝细胞癌的药物，索拉菲尼，但其 费用非常昂贵且平均只能延长2.8个月的寿命，并导致腹泻恶心等各种副作用[3]。 核仁是一个位于细胞核的非膜结构的亚核腔室，是进行rDNA转录和核糖体生物合 成等基本过程的重要细胞器。NPM1(也称为B23)是核仁中表达丰富的蛋白质，其蛋白序列含 有三个不同的结构域，N端结构域可以通过调控NPM1寡聚化和与其他蛋白质的相互作用来 影响其生物学功能,大量研究表明NPM1通过形成五聚物来发挥相应的功能。NPM1中心区域 是以高酸性区域的存在为标志的内在无序区，参与了与组蛋白的结合。C末端区域提供了一 个足够的平台，使其能够与核酸结合[4]。NPM1是一种重要的细胞蛋白，已被证明参与核糖 体的生物发生，染色质重构和中心粒复制等一系列生物学过程。当其异常表达或发生突变 时会引起胚胎发育异常和肿瘤的发生。
技术实现要素：
本发明人通过结合理论研究和实验手段，通过多组学数据挖掘工具，在癌症背景 下对可能具有潜在功能的lncRNA进行全面分析探究。在肝细胞癌(LIHC)中，本发明人通过 本实验室设计的算法，利用癌症基因组图谱 (TCGA)的数据对lncRNA进行功能调查，发现了 一条之前未被研究的 lncRNA RP11-196G18.22(我们命名为LETN)，预测其调节191对转录 因子和靶基因，可能在肝癌的发生发展中具有广泛而强大的调控潜力，并通过实验进行了 验证。 因此，本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码 RNA(lncRNA RP11-196G18.22，在本文中命名为LETN)，其在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞 增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关，因此可以作为肿瘤标志物及诊断标记。降 低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表达代表了癌症治疗的一个新策 3 CN 111575372 A 说 明 书 2/13 页 略。本发明还对LETN的作用机制进行了研究，发现LETN通过与NPM1 结合来发挥功能，通过 结合NPM1来影响rRNA的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展。 根据本发明的一个方面，提供了检测lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达水平的 试剂在制备癌症的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。检测 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表 达水平可以是检测其DNA或RNA 水平。 在一个实施方案中，本发明提供了诊断癌症的方法，所述方法包括检测受试者的 样品中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平，其中相对于对照(健康或正常样品)， LETN在受试者的样品中的过表达指示受试者患有癌症的(高)风险或患有癌症。 在一个实施方案中，本发明提供了检测lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达水平 的试剂，其用于诊断癌症。 在一个实施方案中，所述试剂为lncRNA RP11-196G18.22特异性探针、基因芯片或 PCR引物。 在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、 前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内 膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。 在另一个优选实施方案中，所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(Ensembl登录号ENST00000564237.1)所示。 根据本发明的另一个方面，提供了降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表 达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。 在一个实施方案中，本发明提供降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达 的试剂，其用作药物，特别是用作治疗癌症的药物。 在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受 试者施用有效量的降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达的试剂。 降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂的本质对于本发明来说并 不重要，只要它降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达即可。 根据一个优选实施方案，降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达的试剂 选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、 shRNA、miRNA、RNA适体、TALEN、 CRISPR和锌指核酸酶。在特别优选的实施方案中，用于反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR的具 体序列是本申请说明书实施例中使用的那些序列。 在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、 前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内 膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。 根据一个优选实施方案，所述lncRNA RP11-196G18 .22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(Ensembl登录号ENST00000564237.1)。 在另一个实施方案中，所述药物还包含另外的抗癌剂例如化疗药，例如用于降低 或抑制NPM1表达或突变的试剂或抑制LETN与NPM1的结合的试剂。或者所述药物与用于降低 或抑制NPM1表达或突变的方法或者抑制LETN与NPM1的结合的方法组合使用。即使lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的抑制足以实现治疗癌症的效果，但是预期将降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂与其他抗癌药物如化疗剂组合时，可以获得更强甚至协 4 CN 111575372 A 说 明 书 3/13 页 同的抗癌效果。由于本发明已经发现LETN是通过与NPM1结合来发挥功能，通过结合NPM1来 影响rRNA 的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展，因此这对于 具有降低或抑制NPM1表达或突变的抗癌药或化疗剂而言更是如此。 根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗癌药物的方法，所述方法包括下述 步骤： 1)确定过表达lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的细胞中lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)的表达水平； 2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触； 3)确定在步骤2)后细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；和 4)比较步骤1)和步骤3)中确定的lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达水平，其 中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗癌潜力，优 选所述细胞为癌细胞。 根据本发明的另一个方面，提供了鉴别一种肿瘤是否适合于以LETN 表达抑制剂 治疗的方法，所述方法包括以下步骤： 1)测定肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达相对于对照(正常或健康组织/细胞)是 否增加； 2)确定所述肿瘤是否适合于治疗，其中增加的表达表示适合于以 LETN表达抑制 剂治疗。 根据本发明的另一个方面，提供了评价药剂在治疗和/或预防癌症中的效果的方 法，其中所述方法包括测试所述药剂是否能够降低肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达，如 果能够降低，则说明所述药剂适合于治疗和/ 或预防癌症。在一个优选实施方案中，所述癌 症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、 肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺 癌。根据一个优选实施方案，所述LETN的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示(Ensembl登录号 ENST00000564237.1)。 附图说明 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 图1中A至J所示的结果显示LETN能够促进肝癌的发生发展。 A显示LETN在TCGA数据库中各种癌症和相关癌旁的表达情况 (CHOL：胆癌；LIHC： 肝癌；LUAD：肺腺癌；KIRC：肾透明细胞癌； BLCA：膀胱癌；BRCA：乳腺癌；PRAD：前列腺癌； READ：直肠癌； LUSC：肺鳞状细胞癌；UCEC：子宫内膜癌；PAAD：胰腺癌；HNSC：头颈部鳞癌； KIRP：乳头状肾细胞癌；COAD：结肠癌；STAD：胃癌； SARC：软组织癌；ESCA：食管癌；THCA：甲 状腺癌；THYM：胸腺癌； KICH：肾嫌色细胞癌；PCPG：肾上腺癌；CESC：宫颈鳞状细胞癌)，观察 到人类大部分癌症组织(实体瘤)中的LETN表达要高于相对应的癌旁组织；B显示在HUH7细 胞系中对LETN进行CRISPR-Cas9敲除，观察发现 LETN敲除组(sgLETN)细胞增殖速率要远远 低于对照(sgEV)；C所示为分别在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721，肺癌细胞系HCC827、前列腺 癌细胞系PC3、DU145对LETN进行敲低，检测发现LETN敲低组细胞增殖速率要远远低于对照 组细胞(siNC和siLMNA为两种不同的阴性对照。为防止脱靶效应，针对LETN设计两个siRNA 5 CN 111575372 A 说 明 书 4/13 页 敲低：siLETN-1和siLETN-2)； D，E所示为在HUH7和HCC827细胞中对LETN进行稳定敲低/敲 除后其细胞克隆形成能力明显被破坏；F所示为在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721 中对LETN进 行过表达，检测发现LETN过表达组细胞增殖速率要远远高于对照组细胞；G所示为在HUH7和 SMMC-7721细胞中对LETN进行稳定过表达后其细胞克隆形成能力明显增强；H所示为在肝癌 细胞系HUH7中对 LETN进行稳定敲低后观察到LETN敲低组其皮下成瘤能力显著降低；I所示 为在肝癌细胞系HUH7中对LETN进行稳定过表达后观察到LETN过表达组其皮下成瘤能力明 显增强(LETN-OE组为过表达LETN组，EV组为对照组)。 图2中A至E所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合发挥功能。 具体地，A所示为通过原位杂交实验发现LETN主要位于细胞和中且成团出现；B所 示为通过核质分离实验证实LETN大部分位于细胞核中， GAPDH和LaminA/C分别为细胞质和 细胞核的标志物；C所示为通过对 LETN相互作用的蛋白进行质谱分析，发现两次实验中 NPM1均是是结合能力最强的蛋白；D所示为通过细胞荧光共定位实验进一步证实了LETN 和 NPM1相互结合且定位于核仁中；E所示为在甲醛交联或未交联状态下通过NPM1进行拉下 (pull down)RNA,也发现NPM1确实能够拉下来 lncRNA LETN(图中MALAT1表示阴性对照)。 图3中A至C所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合影响rRNA 的产生和核小体的 装配功能来促进肝癌的发生发展(检测用抗体：鼠抗人 NPM1抗体(ab10530 ,abcam)， Histone H2A(EPR17470 ,ab177308 ,abcam) , Histone H2B(EP957Y ,ab52599 ,abcam) , Histone H3(17168-1-AP, proteintech) ,Histone H4(16047-1-AP,proteintech))。 具体地，A所示为在HUH7和HCC827细胞系中分别敲低LETN或 NPM1，均能明显降低 各种rRNA的表达，LETN和NPM1功能具有一致性；B所示为敲低LETN可以减弱NPM1和组蛋白的 结合能力，进而影响核小体的装配；C所示为对TCGA数据库中肝癌病人的临床资料分析生存 期分析，单独分成LETN或NPM1高表达组病人预后生存时间要比低表达组病人短；当继续细 分为NPM1-low LETN-low、NPM1-low LETN-high、 NPM1-high LETN-low、NPM1-high LETN- high四组时，发现NPM1和 LETN均高表达的病人其生存时间要远远低于NPM1和LETN均低表 达的病人。 图4中A至D所示的结果证明了LETN的各种敲低和过表达效率。 A所示为通过siRNA对五种细胞系进行LETN敲低，通过RT-qPCR检测敲低效率；B所 示为通过慢病毒shRNA对两种细胞系进行LETN敲低，通过 RT-qPCR检测敲低效率；C所示为 通过CRISPR-Cas9技术进行敲除LETN，通过RT-qPCR检测敲低效率；D所示为通过慢病毒过表 达系统对两种细胞系进行LETN过表达，通过RT-qPCR检测过表达效率。 图5表示敲低相应的lncRNA后对肝癌细胞系HUH7的增殖的影响。
