技术摘要：
本发明涉及芽孢杆菌应用技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌Z‑101及其复合微生物阻镉剂和制备方法。所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Z101的菌株于2019年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：60928。本发明制得的复合的复合微  全部
背景技术：
我国土壤总的重金属点位超标率为16.1％，耕地点位超标率高达19.4％。其中， 镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌、镍8种重金属超标率高达16％，尤以镉超标率高达7％。其中，农田 土壤重金属镉含量超标，极易在农作物中富集，通过食物链对人体健康造成重要伤害，已经 成为社会热点之一。 镉在土壤环境中具有不同的形态，可以互相转化：水溶态和交换态、专性吸附、氧 化物结合态、有机结合态、残渣态等。目前重金属镉污染主要通过物理、化学和生物等方法 进行土壤修复。其中生物修复含植物修复和微生物修复。 微生物在土壤中的生命活动能吸附富集土壤重金属，实现生物成矿，不但可以降 低土壤中重金属镉的毒性，而且产生的代谢产物一般在细胞膜上或细胞体外产生，使土壤 颗粒的表面张力发生明显变化，从而使重金属的解吸附效率得到提高。微生物对重金属镉 的去除效果好，而且毒性低，生物可降解性高。巨大芽孢杆菌广泛应用于农业生产，且由于 其具备芽孢属性，在发酵工艺、产品制剂、保质期等产业化应用方面具备丰富的应用前景。 中国发明专利申请号201611044980.0公开了一种蜡状芽孢杆菌Y10及其耐镉和/ 或降低有效镉含量中的应用，但是该发明采用的技术仅在一定程度内达到降低金属镉的含 量，对其他重金属的降低效果并不理想，且该没有公开微生物菌剂的制备技术，不方便推广 应用。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101。 本发明的目的之二是提供一种巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101的复 合微生物阻镉剂，制得的复合的复合微生物阻镉剂实现了重金属元素活性降低70％以上、 稻米镉含量降低50％以上、其他作物重金属元素富集也明显减少、中轻度污染农田基本可 达到安全利用目标。 本发明的目的之三是提供一种巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101的复 合微生物阻镉剂的制备方法，制备方法简易，有利于推广应用。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。 本发明的一种巨大芽孢杆菌Z-101，所述巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z- 101的菌株于2019年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为 GDMCC  NO：60928。保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。其 分类学名称为Bacillus  megaterium，生物材料名称及注明的鉴别特征：Bacillus  megaterium  Z-101，即巨大芽孢杆菌Z-101。 5 CN 111592997 A 说　明　书 2/15 页 本发明的巨大芽孢杆菌Z-101的生理生化特性：为革兰氏阳性菌、好氧，最适温度 30-37℃、最适ph6.0-8.0，对于硝酸盐、美兰试剂呈阴性反应，对于肌醇、明胶试验呈阳性反 应。 巨大芽孢杆菌Z-101在生长和代谢过程中可以产生苹果酸等有机酸，一方面低浓 度有机酸促进土壤镉等重金属被吸附、转化和固定，进而降低重金属的活性；另一方面，有 机酸可以改善土壤结构，减少作物根系减少麦根酸类物质的分泌，从而减少根系对镉等重 金属的吸收和运转，并且增加土壤粒状有机物结合镉的含量，降低根际土壤水溶态/交换态 镉含量。达到降低作物生长发育过程吸收转化镉的作用。 具体地，所述菌株的16S  rDNA序列如SEQ  ID  NO:1所示。 16SrDNA基因序列测定 细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同 反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期以来，国际上通用的“正式的”或“官方 的”细菌分类方法是以《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一 个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难以明确对该菌株进行鉴定。目前， 细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结 论。其中DNA序列分析的16S  rRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴 定常用的技术手段(Kim  et  al，2004；Prap  et  al，1997)。 核糖体16SrDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用保 守区域设计的通用引物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技术的基 本原理是从微生物样本中提取16SrDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SrDNA 的序列信息，再与16SrDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在进化树中的 位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16SrDNA片段保守区域设计的通用引 物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此 通过对某菌株16SrDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可的。 1、方法 (1)PCR反应体系(25μL)： 10×PCR  Buffer    2.5μL dNTP(2.5mM)     2.0μL 引物27F(10μM)     0.5μL 引物1492R(10μM)   0.5μL DNA模板     100ng Taq酶(5U/μL)     0.5μL ddH2O     19μL (2)PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35 个循环，72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析仪进行DNA测序。 2、测序结果 TGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAG ATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA 6 CN 111592997 A 说　明　书 3/15 页 CCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGG GTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGC GCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGA GTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGC GGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGAC AGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC TTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGAC GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGA GGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTG TAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCG 3、同源性分析 通过NCBI比对结果显示，所测菌株Z101与数据库里对比相似度最高的是： Bacillus  megaterium，巨大芽孢杆菌。 更具体地，所述菌株的形态特征如下：所述菌株为革兰氏阳性菌，革兰氏染色呈蓝 色，所述菌株呈杆状或短链状，两端钝圆，单个菌体大小为2.5-5.0μm×1.6-2.5μm，芽孢位 于菌体中央，椭圆形，大小为1.1-1.2μm×0.7-1.7um。 优选地，所述Z-101的菌株筛选方法为： A、培养基 (A1)初筛培养基：牛肉膏2-5g，蛋白陈6-15g，氯化钠3-8g，CdLC2  50-100mg，蒸馏 水1000ml，调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min； (A2)复筛培养基：牛肉膏2-5g，蛋白陈16-15g，氯化钠3-8g，CdLC2  50-100mg，琼脂 粉18-20g，蒸馏水1000买ml，调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min； (A3)纯化、保存培养基：牛肉膏2-5g，蛋白陈6-15g，氯化钠3-8g，蒸馏水1000ml，调 节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min； B、分离方法 (B1)从广东省韶关市大宝山矿区水稻根际土壤采取100g土样，加入吐温80的无菌 水，震荡，静置后过滤，取上清液；室温条件下离心20-30分钟；弃上清液，保留沉淀物，加入 20-30mL含pH  7 .0磷酸缓冲液制备菌悬液；将菌悬液置于80℃水浴加热10-20min，自然冷 却；吸取5ml菌悬液涂接种到装有45ml初筛培养基中；设置培养温度30-37℃、转速100- 120rpm、培养时间为24-48小时； (B2)取初筛培养物100ul，涂布在复筛培养基，设置培养温度30-37℃、培养时间为 24-48小时，获得耐镉微生物菌落； C、纯化、保存 7 CN 111592997 A 说　明　书 4/15 页 在纯化培养基划线纯化复筛培养基平板上直径最大的微生物菌落，获得奈镉单菌 落Z-101；将Z-101接种于试管斜面，30-37℃培养24-48小时，置于4℃冰箱中保存； D、革兰氏、芽孢染色：革兰氏染色采用结晶紫染色方法，芽孢染色采用石碳酸碱性 复红染液。 优选地，巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101菌种筛选具体为： A、培养基 (A1)初筛培养基：牛肉膏3g，蛋白陈10g，氯化钠5g，CdLC250-100mg，蒸馏水1000， 调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min。 (A2)复筛培养基：牛肉膏3g，蛋白陈10g，氯化钠5g，CdLC250-100mg，琼脂粉18- 20g，蒸馏水1000，调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min。 (A3)纯化、保存培养基：牛肉膏3g，蛋白陈10g，氯化钠5g，蒸馏水1000，调节ph7.0- 7.4，121℃灭菌20min。 B、分离方法 (B1)从广东省韶关市大宝山矿区水稻根际土壤采取100g土样，加入500mL含 0 .01％吐温80的无菌水，震荡20min，静置30min后过滤，取上清液。室温条件下6000- 8000rpm离心20-30分钟。弃上清液，保留沉淀物，加入20-30mL含pH7.0磷酸缓冲液制备菌悬 液。将菌悬液置于80℃水浴加热15min，自然冷却。吸取5ml菌悬液涂接种到装有45ml初筛培 养基中。设置培养温度30-37℃、转速100-120rpm、培养时间为24-48小时。 (B2)取初筛培养物100ul，涂布在复筛培养基。设置培养温度30-37℃、培养时间为 24-48小时，获得耐镉微生物菌落。 C、纯化、保存 在纯化培养基划线纯化复筛培养基平板上直径最大的微生物菌落，获得奈镉单菌 落Z-101。将Z-101接种于试管斜面，30-37℃培养24-48小时，置于4℃冰箱中保存。 D、革兰氏、芽孢染色 革兰氏染色和芽孢染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可以缩小鉴定范围。革 兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属 于革兰氏阳性(G )或者革兰氏阴性菌(G-)，用以分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在生物安 全隐患，在农业微生物应用过程不予采用。芽孢染色将菌体内的芽孢进行染色，可以直观观 察芽孢的大小、位置、形状等特点进一步缩小其鉴定范围。芽孢杆菌具有保质期长，易于存 放的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。革兰氏染色采用结晶紫染色方法，芽孢 染色采用石碳酸碱性复红染液。 结合图1和图2，通过革兰氏染色和芽孢染色结果可以看出，巨大芽孢杆菌Z-101革 兰氏染色呈蓝色，为革兰氏阳性菌。巨大芽孢杆菌Z-101呈杆状或短链状，两端钝圆，单个菌 体大小为2.5-5 .0μm×1 .6-2 .5μm。芽孢位于菌体中央，椭圆形，大小为1.1-1 .2μm×0 .7- 1.7um。 本发明的一种巨大芽孢杆菌Z-101的复合微生物阻镉剂，所述阻隔剂由以下原料 组成： 8 CN 111592997 A 说　明　书 5/15 页 优选地，本发明的一种巨大芽孢杆菌Z-101的复合微生物阻镉剂，所述阻隔剂由以 下原料组成： 巨大芽孢杆菌Z-101液体发酵液，巨大芽孢杆菌Z-101菌剂是以芽孢形式存货为主 的活体液体微生物制剂，能够在喷施后迅速萌发，在植株叶片代谢产生多种活性物质，降低 水稻植株对重金属镉的吸收。同时，巨大芽孢杆菌Z-101在植株根基土壤中迅速形成优势菌 落群，吸收、钝化土壤重金属活性镉。本发明设计巨大芽孢杆菌Z-101芽孢数为20-30亿g/ ml。 柠檬酸，有机酸不仅能够去除土壤中的重金属，还具有良好的生物降解性，因此不 会给土壤的理化性质带来大的损伤，不会对环境造成“二次污染”。柠檬酸对镉的解吸附机 理主要是镉与柠檬酸的反应，主要去除土壤中镉的可交换态、碳酸盐结合态以及铁锰氧化 物结合态，其中去除率最高的是重金属的可交换态。同时，柠檬酸是一种弱酸性高分子有机 酸，弱酸性环境对于巨大芽孢杆菌Z-101液体制剂中芽孢状萌发具有抑制作用，能够有效缓 解巨大芽孢杆菌Z-101代谢产生的气体导致包装胀气的现象。本发明设计柠檬酸含量为50- 70g/L。 磷酸二氢钾是一种无氯磷钾复合肥料，养分含量高，具有良好的物理性和化学稳 定性，是目前盐指数最低的化学肥料，对水稻种植安全，不会灼伤叶片和根，可用于叶面施 肥和无土栽培的营养液。同时，磷酸二氢钾是一种良好的缓冲剂，能够长期维的持本产品的 ph为6.0-8.0，延长巨大芽孢杆菌Z-101的存活时间。本发明设计磷酸二氢钾含量为30-50g/ L。 EDTA是一种高效、廉价的螯合剂，作用机制主要是与重金属离子结合，改变土壤中 重金属的存在形态，使土壤颗粒表面吸附的重金属离子解吸，在这一过程中重金属污染物 的溶解性增大，从而为土壤重金属镉修复创造有利条件。本发明设计EDTA含量为15-30g/L。 葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物， 9 CN 111592997 A 说　明　书 6/15 页 即生物的主要供能物质。在巨大芽孢杆菌Z-101菌剂中添加葡萄糖，一方面高糖分环境下能 够抑制芽孢萌发，延长保质期；另一方面菌剂稀释后能够迅速为芽孢提供能量，快速萌发形 成土壤根基优势菌群。本发明设计葡萄糖含量为5-10g/L。 硅酸钠是一种易溶于水的活性硅，能够改变土壤阳离子平衡，通过离子竞争抑制 水稻植株对镉的吸收以及土壤对重金属镉的钝化。本发明设计硅酸钠含量为2-5g/L。 具体地，所述巨大芽孢杆菌Z-101液体发酵液的制备方法为： (1)种子培养基制备 (1.1)种子培养基 (1.2)培养条件：Z-101划线于培养皿平板，30-37℃培养24-36小时； (1.3)制备方法：无菌条件下将菌体刮起，无菌水冲洗平板菌体，保存； (2)液体发酵液培养基配方 (2.1)碳氮比 采用豆饼粉、酵母粉为Z-1-1菌株的复合碳源和碳源，以谷氨酸钠、硫酸铵作为基 础氮源、以葡萄糖作为基础碳源进行碳氮比调节，调节培养基碳氮比为12：1-18：1； (2.2)渗透压 硫酸镁0.01-0.05g/L、K2HPO4  0.2-0.5g/L、一水硫酸锰0.005-0.01g/L； (3)液体发酵环境条件 (3.1)Ph值 在巨大芽孢杆菌Z-101发酵过程中，通过补酸或者补碱的设置初始Ph值为6.5- 7.2、发酵过程中调节Ph为7.1-7.5； (3.2)接种量为3-5％； (3.3)发酵温度为28-33℃； (3.4)含氧量 转速80-150rmp、通气量为、通气量为每小时每立方米培养基通入压缩无菌空气 3.5-5.5/L； (3.5)发酵时间，发酵终点为接种后培养40-48小时。 优选地，所述步骤(2.1)中，调节培养基碳氮比的原料具体为：豆饼粉10-15g/L、酵 母粉0.3-0.8g/L、谷氨酸钠0.5-1.0g/L、硫酸铵0.15-0.5g/L、葡萄糖8-12g/L。 优选地，所述步骤(1.1)中，种子培养基的培养具体为：牛肉膏3g，蛋白陈10g，氯化 钠5g，琼脂粉18-20g，蒸馏水1000ml，调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min。 具体地，本发明的巨大芽孢杆菌的液体发酵方法如下： (1)种子培养基制备 (1.1)种子培养基：牛肉膏3g，蛋白陈10g，氯化钠5g，琼脂粉18-20g，蒸馏水1000， 调节ph7.0-7.4，121℃灭菌20min。 (1.2)培养条件：Z-101划线于培养皿平板，30-37℃培养24-36小时。 (1.3)制备方法：无菌条件下用玻璃刮刀轻轻将菌体刮起，20ml无菌水冲洗平板菌 体3次，保存于无菌的三角瓶中。 (2)液体发酵液培养基配方 影响微生物发工业化发酵的营养因素有很多，对发酵影响较大的因子主要包含碳 10 CN 111592997 A 说　明　书 7/15 页 氮比和渗透压。 (2.1)碳氮比 培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途 径，在发酵工业中尤其重要。菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。微生 物发酵所采用的多为一种或几种复合碳源和氮源的大分子有机物，具有养分全面，易于吸 收利用等优点。本发明采用豆饼粉、酵母粉为Z-1-1菌株的复合碳源和碳源，以谷氨酸钠、硫 酸铵作为基础氮源、以葡萄糖作为基础碳源进行碳氮比调节，调节培养基碳氮比为12：1- 18：1。具体为：豆饼粉10-15g/L、酵母粉0.3-0 .8g/L、谷氨酸钠0.5-1 .0g/L、硫酸铵0.15- 0.5g/L、葡萄糖8-12g/L。 (2.2)渗透压 微生物发酵培养基的渗透压主要通过无机盐离子调节，培养基渗透压太低会造成 菌体发酵养分不足，抑制菌体代谢、繁殖活力；渗透压太高会抑制菌体滴代谢获活动甚至导 致菌体失水死亡。此外，无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。其主要功能是构成菌 体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基渗透压、调节pH值和氧化还 原电位等，对于芽孢杆菌的代谢活动具有重要作用。 其中，磷是某些蛋白质和核酸的组成成分，腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)是重要的能 量传递者，参与一系列的代谢反应；钾不参与细胞结构物质的组成，它是许多酶的激活剂； 镁不参与任何细胞结构物质的组成，但它的离子状态是许多重要的酶(如己糖磷酸化酶、异 柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂；微量元素锰是某些酶的激活剂，羧化反应必须有锰参 与。具体为：硫酸镁0.01-0.05g/L、K2HPO40.2-0.5g/L、一水硫酸锰0.005-0.01g/L。 (3)液体发酵环境条件 液体发酵的环境因素在微生物生长代谢过程中十分重要，主要有初始Ph值、发酵 温度、接种量、含氧量、发酵时间等。 (3.1)Ph值 pH是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数，是衡量代谢活动的综合指 标。pH的变化会影响到各种酶活、菌对基质的利用速率和细胞的构造，从而影响菌的生长和 产物的合成。在巨大芽孢杆菌Z-101发酵过程中，通过补酸或者补碱的设置初始Ph值为6.5- 7.2、发酵过程中调节Ph为7.1-7.5。 (3.2)接种量 接种量是指移种的种子液体积与发酵液体积之比。适当的接种量可调节培养液黏 度和溶解氧含量，缩短生长达到高峰的时间、使产物提前合成。发酵时间与菌体生长繁殖的 关系可以通过生长曲线来得出，最适的发酵时间能够使得菌体的代谢量达到最大，而又不 会菌体自溶，影响发酵结果。巨大芽孢杆菌Z-101设定为3-5％。 (3.3)发酵温度 温度是微生物体内许多生化反应、酶活性的重要的环境因素。低温和高温均会降 低机体代谢活力，抑制生长繁殖。最适环境温度条件下，菌体能够有效提高必须的机质代谢 率，从而影响菌体对于营养物质的转化率。巨大芽孢杆菌Z-101属于中温性菌株，具体为：发 酵温度为28-33℃。 (3.4)含氧量 11 CN 111592997 A 说　明　书 8/15 页 好氧微生物必须在有氧条件下以分子氧作为呼吸链的终端电子受体，才能具备完 整的呼吸链，将有机物转化为CO2、H2O，并获取能量。巨大芽孢杆菌Z-101属于好氧微生物，在 发酵环境控制过程中，通过调整转速和通气量调节发酵含氧量，具体为：转速80-150rmp、通 气量为、通气量为每小时每立方米培养基通入压缩无菌空气3.5-5.5/L。 (3.5)发酵时间 设定巨大芽孢杆菌Z-101发酵终点为接种后培养40-48小时。 优选地，所述巨大芽孢杆菌Z-101液体发酵液的芽孢数为20-30亿g/ml，所述复合 微生物阻镉剂的pH为6.0-8.0。 本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101的阻镉效果 在初筛培养基接种Z-101，设置CdLC2浓度为100mg/L。培养温度28-33℃、转速100- 120rpm、培养时间24小时，制备种子液体。分别吸取1ml种子液及121℃灭活种子液接种于初 筛培养基，培养温度30-37℃、转速100-120rpm、培养时间48小时微，微孔过滤获得纯菌体及 其无菌滤液。 (1)分别取20毫升滤液，原子吸收光谱法测定滤液中的镉离子含量。 处理 初始Cd含量 对照灭活Z-101滤液 接种Z-101滤液 镉离子浓度 100mg/L 97.94mg/L 41.80mg/L (2)用5毫升无菌水将微孔过滤获得的菌体冲洗3-5次，细胞破碎仪超声破壁，离 心，获得细胞壁沉淀。烘干称重后用原子吸收光谱法测定的镉离子含量。 处理 对照灭活Z-101菌体 接种Z-101菌体 镉离子浓度 0.47mg/g 31.07mg/g 本发明的一种巨大芽孢杆菌Z-101的复合微生物阻镉剂的制备方法，以巨大芽孢 杆菌Z-101液体发酵液为核心，按照上述配比添加柠檬酸、磷酸二氢钾、EDTA、硅酸钠、葡萄 糖，经搅拌均匀，制得液体复合微生物阻镉剂。 本发明的有益效果在于： (1)本发明针对中轻度污染耕地中镉污染的重金属钝化，主要采用现代微生物技 术，以巨大芽孢杆菌Z-101为核心，通过生物吸附、钝化的方法降低土壤镉的活性。辅以磷酸 氢二钾、碳酸钙、柠檬酸及其腐殖酸等原料，制备一种集全方位、立体化复合微生物菌剂，实 现了重金属元素活性降低50％以上、稻米镉含量降低45％以上、其他作物重金属元素富集 也明显减少、中轻度污染农田基本可达到安全利用目标。 (2)本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101是发酵配方原料来源广 泛、价格便宜、有效活菌数高，可以进一步开发为液体、粉剂、颗粒等不同剂型的产品。本发 明的本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101在发酵过程中，代谢产生吲哚乙 酸、吲哚丁酸等生物激素，能够有效促进作物生长。同时，本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)Z-101可有效活化土壤降解土壤中有机磷的功效和钾。活化的磷和钾能被作物 吸收利用，进一步的减少化肥的使用量，从而减少因过量使用化肥带入土壤的重金属和导 致土壤酸化的物质。 (3)将本发明的复合微生物菌剂应用于水稻的盆栽实验中，糙米镉含量降幅为 52.14％，阻镉效果明显。 说明书附图 12 CN 111592997 A 说　明　书 9/15 页 图1是本发明的巨大芽孢杆菌Z-101的革兰氏染色显微镜放大图。 图2是本发明的巨大芽孢杆菌Z-101的芽孢染色显微镜放大图。