技术摘要：
本公开总体上涉及可以结合至磷酸化的苏氨酸231‑τ蛋白(pT231‑τ)并中和该磷酸化的苏氨酸231‑τ蛋白(pT231‑τ)的活性的构象特异性抗体。本技术的抗体可用于用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式‑pT231‑τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。
背景技术：
提供以下描述以帮助读者理解。提供的信息或引用的参考文献均不被认为是本方 法的现有技术。 患有阿尔茨海默氏病(AD)和多种其他中枢神经系统病症(诸如额颞叶痴呆、皮克 氏病、皮质基底节变性、创伤性脑损伤(TBI)、慢性创伤性脑病变(CTE)和进行性核上性麻 痹)的患者的脑部含有包含τ蛋白的神经纤维缠结(NFT)。这种共同的病理特征导致这些各 种神经退行性疾病(被称为“τ蛋白病”)。τ相关病理与AD中的神经元和记忆力的进行性丧失 密切相关。AD的τ蛋白病中的极早期事件是τ过度磷酸化，特别是在Ser/Thr-Pro基序上的τ 过度磷酸化，其引起微管破坏和神经毒性。已发现τ中的磷酸化的Thr231-Pro基序(pT231- τ)以两种不同的顺式和反式构象存在。pT231-τ蛋白的顺式构象主要在AD患者的脑中表达。 由于神经元功能障碍发生在缠结形成之前很久，因此主要的挑战是开发免疫疗 法，其专门针对在τ蛋白病和AD中记忆力丧失之前的早期致病事件。
技术实现要素：
本技术总体上涉及特异性地结合磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)并中和磷 酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)活性的构象特异性抗体。本技术的抗体可用于用于治疗 与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。 在一方面，本技术提供了抗体，所述抗体包含SEQ  ID  NO:1至SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:7至SEQ  ID  NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基 酸取代的变体，和SEQ  ID  NO:41、SEQ  ID  NO:42或SEQ  ID  NO:45至SEQ  ID  NO:48的轻链免 疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。在一些实施方式 中，抗体是人源化抗体。 在另一方面，本技术提供了抗体的抗原结合片段，其中，抗原结合片段选自由以下 组成的组：Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。 在以上实施方式中的任一者中，抗体结合至包含氨基酸序列KVAVVRTPPKSPS(SEQ  ID  NO:56)的磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白的表位。在一些实施方式中，抗体特异性地结合至 4 CN 111587123 A 说　明　书 2/74 页 磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)的顺式构象。在一些实施方式中，抗体具有选自由以 下组成的组的同种型：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。 在一方面，本技术提供了编码本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体的重组核酸序列。 在又一方面，本技术提供了宿主细胞或载体，其包含编码本文所描述的抗-顺式-pT231-τ抗 体的重组核酸。 在一方面，本技术提供了组合物，其包含抗-顺式-pT231-τ抗体和药学上可接受的 载剂。在一些实施方式中，组合物包含抗-顺式-pT231-τ抗体，所述抗-顺式-pT231-τ抗体包 含SEQ  ID  NO:1至SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:7至SEQ  ID  NO:14的重链免疫球蛋白可变结构 域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体，和任选的SEQ  ID  NO:41、SEQ  ID  NO: 42或SEQ  ID  NO:45至SEQ  ID  NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多 种保守氨基酸取代的变体。 在另一方面，本技术提供了用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋 白表达相关的神经病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的包含SEQ  ID  NO:1至SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:7至SEQ  ID  NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种 或多种保守氨基酸取代的变体的抗体，其中，该抗体特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并 中和该顺式-pT231-τ蛋白。 在该方法的某些实施方式中，抗体还包含SEQ  ID  NO:41、SEQ  ID  NO:42或SEQ  ID  NO:45至SEQ  ID  NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸 取代的变体。 在该方法的一些实施方式中，神经病症是τ蛋白病、创伤性脑损伤(TBI)或中风。在 另一个实施方式中，τ蛋白病选自由以下组成的组：进行性核上性麻痹(PSP)、慢性创伤性脑 病变(CTE)、额颞叶痴呆(FTD)、额颞叶变性、Lytico-Bodig病、缠结优势型痴呆、脑膜血管瘤 病、亚急性硬化性全脑炎、皮克氏病、皮质基底节变性和阿尔茨海默氏病(AD)。 在某些实施方式中，对象处于所述τ蛋白病的早期。在一个实施方式中，所述τ蛋白 病的早期通过获自所述对象的样品中升高水平的顺式pT231-τ或顺式pT231-τ:反式pT231- τ比率的增加来确定。在一些实施方式中，该方法还包括确定获自对象的样品中CSF  t-τ、 pT181-τ、Αβ42的水平或ApoE4水平。在某些实施方式中，样品选自由以下组成的组：尿液、 血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。 在一些实施方式中，对象具有反复的脑创伤史。 另外地或替选地，在该方法的一些实施方式中，将抗体与附加的治疗剂分开地、依 序地或同时地施用给对象。在一些实施方式中，附加的治疗剂是多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰 他敏、美金刚和氯化锂中的一者或多者。 在一方面，本技术提供了用于选择用本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体治疗的对 象的方法，其包括：(a)检测获自所述对象的样品中的相对于在参考样品中观察到的顺式 pT231-τ蛋白水平的提高或顺式pT231-τ蛋白:反式pT231-τ蛋白比率的增加；和(b)选择所 述对象用本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体治疗。在一些实施方式中，获自对象的样品选自 由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。 在某些实施方式中，参考样品获自健康对照对象。 在另一方面，本技术提供了用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋 5 CN 111587123 A 说　明　书 3/74 页 白表达相关的神经病症的试剂盒，该试剂盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并中和 该顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用抗体的说明书，其中，抗体包含SEQ  ID  NO:1至SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:7至SEQ  ID  NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多 种保守氨基酸取代的变体。在试剂盒的一些实施方式中，抗体还包含SEQ  ID  NO:41、SEQ  ID  NO:42或SEQ  ID  NO:45至SEQ  ID  NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或 多种保守氨基酸取代的变体。 在一方面，本技术提供了用于检测样品中的顺式-pT231-τ蛋白的试剂盒，该试剂 盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用抗体的说明书，其中，抗体包含SEQ  ID  NO:1至SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:7至SEQ  ID  NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列 或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。在试剂盒的一些实施方式中，抗体还包含SEQ  ID  NO:41、SEQ  ID  NO:42或SEQ  ID  NO:45至SEQ  ID  NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序 列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。 在某些实施方式中，抗体偶联至一种或多种可检测的标记。在一个实施方式中，一 种或多种可检测的标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记。 另外地或替选地，在一些实施方式中，试剂盒还包括特异性地结合至顺式-pT231- τ蛋白抗体的二级抗体。在一些实施方式中，二级抗体偶联至选自由以下组成的组的至少一 种可检测的标记：放射性标记、荧光标记或发色标记。 附图说明 图1显示了鼠抗体PT-113的重链免疫球蛋白可变(VH)结构域的核苷酸序列和氨基 酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。一部分的CH1序列被包括在图中。 图2显示了鼠抗体PT-113的轻链免疫球蛋白可变(VL)结构域的核苷酸序列和氨基 酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。一部分的Cκ序列被包括在图中。 图3以单字母码显示了小鼠PT-113抗体的成熟VH结构域的氨基酸序列，与其推断 的亲本种系V区段IGHV1S127*01和JH2区段的氨基酸序列比对。残基编号根据Kabat等人, Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interests,NIH公布号91-3242,美国卫生和 公众服务部(第5版，1991)来指定。PT-113VH结构域的CDR序列加下划线。星号表示PT-113VH 氨基酸序列和IGHV1S127*01氨基酸序列之间的差异。 图4以单字母码显示了小鼠PT-113抗体的成熟VL结构域的氨基酸序列，与其推断 的亲本种系V区段IGKV1-110*02和Jk1区段的氨基酸序列比对。残基编号根据Kabat等人 (1991)来指定。PT-113VL结构域的CDR序列加下划线。星号表示PT-113VL氨基酸序列和 IGKV1-110*02氨基酸序列之间的差异。 图5显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的经合成的小鼠PT-113VH基因 的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成 熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加 下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。 图6显示了侧接有NheI和EcoRI位点(加下划线)的经合成的小鼠PT-113VL基因的 核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟 VL结构域的N-末端氨基酸残基(D)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下 6 CN 111587123 A 说　明　书 4/74 页 划线。邻接EcoRI位点的内含子序列呈斜体。 图7显示了pChPT-113、pHuPT-113A、pHuPT-113B、pHuPT-113C、pHuPT-113D和 pHuPT-113D-AA载体(统称为表达载体)的示意性结构。从SalI位点顺时针开始，质粒含有重 链转录单元，从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV-P)开始，以启动抗 体重链基因的转录。CMV启动子后接VH外显子、含有人γ-1重链恒定区(包括CH1、铰链、CH2 和CH3外显子，连同居间内含子)的基因组序列、以及CH3外显子后的聚腺苷酸化位点。在重 链基因序列之后，轻链转录单元以CMV启动子开始，随后是VL外显子和含有人κ链恒定区外 显子(CL)的基因组序列，内含子的一部分位于其前，并且聚腺苷酸化位点在CL外显子后。轻 链基因则后跟SV40早期启动子(SV40-P)、对嘌呤霉素具有抗性的嘌呤霉素N-乙酰基-转移 酶基因(puro)和含有SV40聚腺苷酸化位点(SV40-A)的区段。最后，质粒含有质粒pUC19的一 部分，其包含细菌复制起点(pUC  ori)和β-内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。在pHuPT-113D-AA 中，CH2区在位置234和位置235处带有Leu-至-Ala氨基酸取代(Kabat等人(1)的Eu编号)。相 关限制酶位点的位置显示于图中。 图8显示了小鼠PT-113VH结构域、四种类型的人源化PT-113VH(HuPT-113VH1、 HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4)结构域和人受体AF174092VH结构域的氨基酸序 列的比对。氨基酸残基以单字母码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位 置。小鼠PT-113VH结构域的CDR序列加下划线。AF174092VH结构域中的CDR残基从图中省略。 据预测，HuPT-113VH1、HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4中的加下划线的残基在抗 原结合位点的形成中起重要作用，因此相应的小鼠残基保留在这些位置。 图9显示了小鼠PT-113VL结构域、人源化PT-113VL(HuPT-113VL1)结构域和人受体 M99608  VL结构域的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母码显示。序列上方的数字表示 根据Kabat等人(1991)的位置。小鼠PT-113VL结构域的CDR序列加下划线。M99608  VL结构域 中的CDR残基从图中省略。当设计HuPT-113VL1时，不需要框架氨基酸取代。 图10显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH1基因的核苷酸 序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构 域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻 接HindIII位点的内含子序列呈斜体。 图11显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH2基因的核苷酸 序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构 域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻 接HindIII位点的内含子序列呈斜体。 图12显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH3基因的核苷酸 序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构 域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻 接HindIII位点的内含子序列呈斜体。 图13显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH4基因的核苷酸 序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构 域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻 接HindIII位点的内含子序列呈斜体。 7 CN 111587123 A 说　明　书 5/74 页 图14显示了侧接有NheI和EcoRI位点(加下划线)的HuPT-113VL1基因的核苷酸序 列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VL结构域 的N-末端氨基酸残基(D)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接 EcoRI位点的内含子序列呈斜体。 图15显示了瞬时表达的ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D  IgG1(I)抗体与本文公开的pT231-Dmpτ肽的结合。 图16显示了ChPT-113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I)和HuPT-113D  IgG1-AA(I)抗体的 SDS  PAGE分析。在还原条件下，在MES缓冲液(Thermo  Fisher  Scientific)中在4-12％SDS  PAGE凝胶上跑抗体(各5μg)。PageRuler  Prestained  Protein  Ladder(Thermo  Fisher  Scientific)用作分子量标准品(泳道4)。泳道1，ChPT-113IgG1；泳道2，HuPT-113D  IgG1 (I)；泳道3，HuPT-113D  IgG1-AA(I)。H和L分别表示每种经测试的抗体的重链和轻链。 图17显示了用于ChPT-113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I)和HuPT-113D  IgG1-AA(I)重 链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸的序列。 图18显示了由pChPT-113构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区)的核 苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。 图19显示了由pChPT-113构建体编码的κ轻链的编码区(可变区和恒定区)的核苷 酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。 图20显示了由pHuPT-113D构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区)的 核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。 图21显示了由pHuPT-113D和pHuPT-113D-AA构建体编码的κ轻链的编码区(可变区 和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。 图22显示了由pHuPT-113D-AA构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区) 的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。 图23显示了小鼠PT-113  IgG2b抗体与四种不同的τ肽结合的ELISA分析。 图24显示了ChPT-113  IgG1抗体与四种不同的τ肽结合的ELISA分析。 图25显示了(i)生物素化的小鼠PT-113  IgG2b和(ii)ChPT-113  IgG1抗体与 pThr231-Dmpτ肽在不同浓度的竞争抗体的存在下的结合。 图26A显示了ChPT-113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I)和HuPT-113D  IgG1-AA(I)抗体 与pThr231-Dmpτ肽的结合的ELISA分析。图26B显示了ChPT-113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I) 和HuPT-113D  IgG1-AA(I)抗体与pThr231-Proτ肽的结合的ELISA分析。图26C显示了ChPT- 113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I)和HuPT-113D  IgG1-AA(I)抗体与np-Thr231-Proτ肽的结合 的ELISA分析。图26D显示了ChPT-113  IgG1、HuPT-113D  IgG1(I)和HuPT-113D  IgG1-AA(I) 抗体与pThr231-Alaτ肽的结合的ELISA分析。 图27A显示了HuPT-113D  IgG1-AA(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO:128)。 图27B显示了由SEQ  ID  NO:128编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:39)。 图27C显示了HuPT-113D  IgG1-AA(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO: 129)。 图27D显示了由SEQ  ID  NO:129编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:55)。 8 CN 111587123 A 说　明　书 6/74 页 图28A显示了HuPT-113D  IgG4(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO: 130)。 图28B显示了由SEQ  ID  NO:130编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:40)。 图28C显示了HuPT-113D  IgG4(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO: 129)。 图28D显示了由SEQ  ID  NO:129编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:55)。 图29A显示了HuPT-113D  IgG1(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO: 131)。 图29B显示了由SEQ  ID  NO:131编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:132)。 图29C显示了HuPT-113D  IgG1(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ  ID  NO: 129)。 图29D显示了由SEQ  ID  NO:129编码的氨基酸序列(SEQ  ID  NO:55)。 图30A是显示THP-1细胞中对CD16染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色 的抗-CD16抗体染色的细胞。 图30B是显示THP-1细胞中对CD32染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色 的抗-CD32抗体染色的细胞。 图30C是显示THP-1细胞中对CD64染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色 的抗-CD64抗体染色的细胞。 图31A是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数 (5,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗 体。 图31B是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数 (50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白 抗体。 图31C是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数 (5,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗 体。 图31D是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数 (50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白 抗体。 图32A是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单 克隆抗-卵清蛋白抗体。 图32B是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml 包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克 隆抗-卵清蛋白抗体。 图32C是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单 克隆抗-卵清蛋白抗体。 9 CN 111587123 A 说　明　书 7/74 页 图32D是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml 包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克 隆抗-卵清蛋白抗体。 图33A是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1mg/ ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单 克隆抗-卵清蛋白抗体。 图33B是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml 包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克 隆抗-卵清蛋白抗体。 图33C是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单 克隆抗-卵清蛋白抗体。 图33D是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml 包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克 隆抗-卵清蛋白抗体。 图34A是显示卵清蛋白IC浓度和Jurkat细胞数(50,00个细胞/孔)对FcR活化的影 响的图。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔(10μg/mL)和一系列浓度的兔多克隆抗-卵清蛋白 抗体和鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体两者生成。 图34B是显示卵清蛋白IC浓度和Jurkat细胞数(100,00个细胞/孔)对FcR活化的影 响的图。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔(10μg/mL)和一系列浓度的兔多克隆抗-卵清蛋白 抗体和鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体两者生成。 图35是显示在每种pThr-Dmp肽包衣浓度(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)下每种抗 体(HuPT-113D  IgG1-AA(II)(IgG1-AA)、HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)和HuPT-113D  IgG1 (II)(IgG1))的结合曲线的图。 图36A是显示响应于在2,2 ,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释的pThr-Dmp肽的在 THP-1细胞中TNFα分泌的图。 图36B是显示响应于在2,2 ,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释的pThr-Dmp肽的在 THP-1细胞中IL-6分泌的图。 图37是显示用在2,2,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释至1μg/ml的pThr-Dmp肽包被 的Jurkat细胞中FcγRIIIa活化的水平的图。 图38A是显示诱导TNFα从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图38B是显示诱导IL-1β从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图38C是显示诱导IL-6从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 10 CN 111587123 A 说　明　书 8/74 页 图38D是显示诱导TNFα从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体 (HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图38E是显示诱导IL-1β从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体 (HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图38F是显示诱导IL-6从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体 (HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图39是显示HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA； 红色)和HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4；绿色)的来自图38A至图38C的EC50值的图。 图40是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa活化的图。将孔用天然pThr- Dmp肽IC在1μg/ml包衣、10μg/ml包衣或100μg/ml包衣下包被。 图41A是显示诱导TNFα从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图41B是显示诱导IL-1β从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图41C是显示诱导IL-6从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D  IgG4(II) (IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。 图42是显示HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA； 红色)和HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4；绿色)的来自图41A至图41C的EC50值的图。 图43是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa活化的图。 图44A是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa  V158活化的图。将孔用TFE 中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用增殖细胞。 图44B是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa  V158活化的图。将孔用TFE 中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。 图45A是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa  V158活化的图。将孔用TFE 中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。 图45B是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa  F158活化的图。将孔用TFE 中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。 11 CN 111587123 A 说　明　书 9/74 页 图45C是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIa  H131活化的图。将孔用TFE中 的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。 图46是显示用HuPT-113D  IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)或 HuPT-113D  IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa  V158活化的图。将孔用DBPS 中的pTau在10μg/ml包衣下包被。 图47是经纯化的HuPT-113D  IgG-AA(II)(IgG-AA)的SDS-PAGE分析。