技术摘要：
本发明提供了一种人CNOT1基因的g.[42481_42482delAG]突变形式，突变所在片段序列如SEQ ID NO：2所示；CNOT1基因发生g.[42481_42482delAG]突变的肝癌患者对FOLFOX4化疗方案耐药。可以采用含有5’‑CTTCTTGAAAAAGTAAGTTCTTA‑3’和5’‑ATTCTAGTTTTGTCTACATCTC‑3’引物  全部
背景技术：
肝癌是中国人最常罹患和最易致死的主要癌症，根据国家癌症中心发布的全国最 新癌症报告（2019年版），肝癌发病率位列恶性肿瘤第四位，死亡率则高居恶性肿瘤第二位， 目前国内新发肝癌病例和死亡病例均占世界的一半以上。肝癌早期症状不明显，60%以上的 患者确诊时已是中晚期了，往往失去了手术治疗的最佳机会。化疗是中晚期肝癌的重要治 疗方式，然而肝癌患者对化疗药物的敏感性存在差异，对化疗耐药的肝癌患者的预后非常 差；此外，肝癌癌灶存在异质性且在化疗过程中容易发生新的耐药突变，因此化疗过程中常 常会出现继发性耐药，需要及时变更治疗方案。目前临床上还无法及时准确地预测和评估 肝癌患者对化疗药物的反应，导致大多数肝癌化疗患者不断进行试验性化疗，既耽误病情 又承受了不必要的药物毒副反应。因此，如何在化疗前有效探知原发性耐药以及在化疗过 程中及时监测是否发生继发性耐药十分重要。目前临床上对于肝癌化疗疗效评估主要依靠 的是影像学手段和血清学指标，然而影像学手段往往存在一定的滞后，血清标记物（如血清 甲胎蛋白即AFP）则普遍特异性不强，且这两者均无法有效准确地反映癌灶的分子本质，从 而难以分析和预测其变化趋势，对治疗的指导价值比较有限。为此，亟需寻找特异准确的肝 癌化疗分子标志物，预测和评估化疗疗效，及时发现耐药人群和耐药时间节点，以便有效指 导化疗方案的选择和及时变更。 目前临床上在癌症治疗中使用的结合了氟尿嘧啶、奥沙利铂等常用化疗药物优点 的FOLFOX4化疗方案，由于其在整体反应率、疾病控制率、无进展生存期、总生存期方面，均 优于传统化疗药物（如阿霉素），且耐受性和安全性较好，因此自2011年起FOLFOX4方案就被 原国家卫生部颁发的《原发性肝癌诊疗规范》所收录，推荐用于治疗晚期原发性肝癌。本发 明针对接受FOLFOX4方案化疗治疗的原发性肝癌（下文简称肝癌）患者，采集其化疗前和化 疗过程中的血样并提取其细胞外游离DNA（cell-free  DNA，即cfDNA），通过二代DNA测序技 术解析其中的循环肿瘤DNA（circulating  tumor  DNA即ctDNA）来监测癌灶突变变动信息， 并结合临床疗效评估信息分析，结果发现CNOT1（CCR4-NOT  transcription  complex  subunit  1）基因的两种特定突变以及NPAS2（Neuronal  PAS  domain  protein  2）的两种特 定突变可以做为肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的标志物，而缺乏有效特异的化疗疗效和耐 药评估分子标志物正是FOLFOX4方案在肝癌化疗上面临的一大棘手难题，导致其难以实现 精准化疗。 CNOT1基因编码的蛋白是CCR4-NOT转录复合体的重要亚基组份，而CCR4-NOT复合 体的主要功能是作为脱腺苷酶通过调控信使RNA的降解来抑制信使RNA的翻译，同时该复合 体也广泛参与了转录起始、延伸和蛋白的修饰，因此对于细胞的生长和增殖具有重要的作 3 CN 111575294 A 说　明　书 2/9 页 用，而CNOT1蛋白对于CCR4-NOT复合体功能的发挥是不可或缺的，CNOT1基因的特定突变将 会影响到CCR4-NOT复合体功能的发挥。CCR4-NOT蛋白复合体是高度保守的，部分研究表明 该复合体功能失调和肿瘤的发生发展显著相关，然而其在肝癌中的关联研究很少，只有零 星的报道如任崇仁研究发现CNOT7基因与肝细胞癌对IFN-γ的耐受相关（任崇仁.CNOT7基 因敲除逆转肝细胞癌对IFN-γ耐受的研究[D].山西：山西医科大学，2017.）。本发明首次发 现了CNOT1基因的两种特定突变，并将其应用于肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的预测和评估 中，这对于肝癌患者化疗方案尤其是FOLFOX4方案的选择和及时变更意义显著，可以有效提 高原发性肝癌患者行FOLFOX4方案化疗的受益，避免无效化疗和没必要的化疗毒副作用；同 时对于原发性肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药机制的研究和有效化疗药物的研发具有重要的 价值。
技术实现要素：
本发明提供了CNOT1基因的两种特定突变及其检测试剂盒和方法，这两种特定基 因突变可以做为原发性肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的分子标志物应用于耐药的预测和分 析中。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 本发明的目的（1）在于提供一种发生g.[42415insATCA]突变的人CNOT1突变基因，它是 由野生型CNOT1基因的第42415位点插入ATCA这4个核苷酸而形成的，而NCBI登录号为NC_ 000016.10所示序列中的第58519951-58629826范围内的序列即为CNOT1野生型基因的参考 序列，则g.[42415insATCA]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：1所示，其余序列参见CNOT1 野生型基因参考序列；CNOT1基因发生g.[42415insATCA]突变的肝癌患者对FOLFOX4化疗方 案耐药。发生g.[42415insATCA]突变的CNOT1基因可以应用于肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药 检测试剂盒、检测方法和治疗药物的研发。 本发明的目的（2）在于提供一种发生g.[42481_42482delAG]突变的人CNOT1突变 基因，它是由野生型CNOT1基因的第42481-42482位点缺失AG这2个核苷酸而形成的，而NCBI 登录号为NC_000016.10所示序列中的第58519951-58629826范围内的序列即为CNOT1野生 型基因的参考序列，则g.[42481_42482delAG]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：2所示，其 余序列参见CNOT1野生型基因参考序列；CNOT1基因发生g.[42481_42482delAG]突变的肝癌 患者对FOLFOX4化疗方案耐药。发生g.[42481_42482delAG]突变的CNOT1基因可以应用于肝 癌行FOLFOX4方案化疗耐药检测试剂盒、检测方法和治疗药物的研发。 本发明的目的（3）在于提供用于检测CNOT1基因g.[42415insATCA]突变的检测引 物和探针，其中CNOT1基因g.[42415insATCA]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：1所示，其 余序列参见CNOT1野生型基因参考序列；所述检测引物为5’-CTTCTTGAAAAAGTAAGTTCTTA-3’ 和5’-ATTCTAGTTTTGTCTACATCTC-3’，检测探针为5’-FAM-TTCAGAATCAGTTTA-MGB-NFQ-3’；检 测引物和探针可用于构建CNOT1基因g.[42415insATCA]突变检测试剂盒和检测方法，特别 是用于构建基于数字PCR或实时荧光定量PCR的CNOT1基因g.[42415insATCA]突变检测方 法。 本发明的目的（4）在于提供用于检测CNOT1基因g.[42481_42482delAG]突变的检 测引物和探针，其中CNOT1基因g.[42481_42482delAG]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：2 4 CN 111575294 A 说　明　书 3/9 页 所 示 ，其 余 序 列 参 见 C N O T 1 野 生 型 基 因 参 考 序 列 ；所 述 检 测 引 物 为 5’- CTTCTTGAAAAAGTAAGTTCTTA-3’和5’-ATTCTAGTTTTGTCTACATCTC-3’，检测探针为5’-VIC- GTACAAGGTGAGTGA-MGB-NFQ-3’；检测引物和探针可用于构建CNOT1基因g .[42481_ 42482delAG]突变检测试剂盒和检测方法，特别是用于构建基于数字PCR或实时荧光定量 PCR的CNOT1基因g.[42481_42482delAG]突变检测方法。 本发明提供的CNOT1基因的g.[42415insATCA]和g.[42481_42482delAG]这两种突 变形式目前尚未见报道，这两种突变可以做为肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的基因标志物， 从而可以应用于耐药的预测和评估中，具有准确特异和及时有效的优点；此外还提供了针 对突变的特异性检测引物和探针。这对于肝癌患者化疗方案尤其是FOLFOX4方案的选用和 及时变更意义显著，可以有效提高肝癌行FOLFOX4方案化疗的受益，避免无效化疗和没必要 的化疗毒副作用；同时对于肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药机制的研究和有效化疗药物的研 发具有重要的价值。 附图说明 图1是人CNOT1基因第5号外显子特定突变示意图。图中间白色方框代表第5号外显 子，两边黑色方框代表内含子；左右箭头指向处分别为g.[42415insATCA]突变和g.[42481_ 42482delAG]突变发生处。