技术摘要：
本发明属于纳米药物领域，涉及一种氧化石墨烯载羟基喜树碱纳米靶向药物的制备和应用，主要利用氧化石墨烯作为载体通过靶向分子的修饰以及药物的负载完成纳米靶向药物的制备。实验利用荧光素标记的Caspase‑3特异性底物肽(Pep)、壳聚糖(CS)和Toll样受体4抗体蛋白(Anti‑  全部
背景技术：
奶牛乳腺炎大多是乳腺遭到病原微生物感染、机械性损伤、物理化学变化及乳腺 组  织内生理代谢紊乱等引起的一种综合症，包括乳腺感染和炎症、微循环和免疫功能障碍 等。  奶牛乳腺炎是在世界范围内影响奶牛生产饲养及乳制品质量的一种复杂多病原性疾 病，发病  率高，其对奶牛生产业及相关食品行业造成重大的经济损失。据统计，世界范围内 每年因奶 牛乳腺炎造成高达百亿美元的损失。 现今治疗乳腺炎的方法相对比较单一，向乳腺内注射抗生素是常用的方法。但是 抗  生素的滥用及超级细菌的出现使得奶牛乳腺炎的治疗愈加困难。羟基喜树碱(HCPT)是 从植  物中提取的一类天然活性成分，具有抗炎和抗癌的功效，作为一种天然抗炎药，可以 用于治  疗炎症性疾病，但由于其水溶性差，限制其推广利用。 氧化石墨烯(GO)具有尺寸小、比表面积大及生物相容性好的优点。与原始氧化石  墨烯相比，GO表面有大量含氧基团，如其平面上含有-OH和C-O-C，而在其片层边缘含有C  ＝ O和COOH，这些基团可以与各种聚合物、金属和生物分子通过酰胺化、酯化作用及加成  反应 修饰到羧化GO的表面。由于独特的结构和性质，GO已经得到国内外学者的关注，被广  泛的 应用在药物输送、生物成像、基因和癌症治疗以及临床检验等各方面。 本发明利用GO作为载体负载HCPT，提高羟基喜树碱的有效药物浓度，同时，通过  在GO表面修饰靶向分子，特异性的进行高生物相容性和低的组织细胞毒性的GO纳米靶向  药物运送到炎症细胞。
技术实现要素：
本发明的目的在于制备一种氧化石墨烯载羟基喜树碱纳米靶向药物，并将其初步 应  用于乳腺炎症细胞的治疗。 本发明的技术方案：一种氧化石墨烯载羟基喜树碱纳米靶向药物的制备，利用荧 光  素标记的Caspase-3特异性底物肽(Pep)、壳聚糖(CS)、Toll样受体(TLR)4抗体蛋白  (Anti-TLR4)共价修饰GO负载HCPT，构建了GO纳米靶向药物  (GO/CS/Pep/Anti-TLR4/ HCPT)。 方法包括以下步骤：GO/CS的制备、GO纳米靶向载体(GO/CS/Pep/Anti-TLR4)的  制 备、GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT的制备、载药能力和载药效率的检测、HCPT药物释放的  检 测、药物靶向性检测、炎症因子含量及相关酶活性检测。 (1)GO/CS的制备 取50mg的GO粉末加入25mL三蒸水制成悬浮液，将悬浮液在400Hz的细胞破碎  仪中 超声分散3h制备成浓度为2mg/mL的GO溶液；在超声状态下逐渐加入溶于300μL含  45mg  EDC 4 CN 111588864 A 说　明　书 2/3 页 和25mg  NHS的溶液活化4h，25mL1mg/mL的CS溶液超声1h后在室温下磁  力搅拌24h，将上述 制备的悬浮液在4  000g  30min下超滤3次，用双蒸水分散成1mg/mL GO/CS溶液置于4℃保存 备用。 (2)GO/CS/Pep/Anti-TLR4的制备 取40mL上述(1)中制备的GO/CS溶液加入300μL含10mg  EDC和含5mg  NHS 的溶液活 化3h，用1mM  NaOH将活化后的GO/CS溶液pH调至8.0，再加溶于100μL含2mg Pep和10μL  0.6mg/mL的Anti-TLR4溶液，室温下避光搅拌反应24h，超滤3次除去多余的  物质纯化产物， 用双蒸水溶解成1mg/mL的GO纳米载体复合物GO/CS/Pep/Anti-TLR4溶液  置于4℃保存。 (3)GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT的制备 将1mL  5mM  DMSO溶解的HCPT药物与9mL1mg/mL的GO/CS/Pep/Anti-TLR4溶  液室温 避光搅拌24h，超滤3次后用双蒸水溶解成1mg/mL  GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT溶 液。 (4)载药能力和载药效率的检测 取1mL未经超滤的GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT，经12  000r/min离心60min，收集  上清用紫外可见分光光度计测量267nm处的吸光度，依据HCPT浓度-吸光度标准曲线，计  算 GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT中HCPT含量，同时，将离心后的固体物真空冷冻干燥后称  重， 按照公式LC＝Md/Mc和LE＝Md/Mo×100％计算LC和LE，其中，Md是负载到  GO/CS/Pep/Anti- TLR4/HCPT的HCPT质量，Mc是GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT的质量，Mo  是原始溶液中HCPT的 质量。 (5)HCPT药物释放的检测 分别取1mL的1mg/mL的GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT溶液装入30kDa透析袋中 并浸 入50mL  10mM  pH值分别为5.8、7.4、8.0的PBS缓冲液中37℃水浴，分别在2、4、6、  8、10、12、 24、36、48和72h，收集不同pH值的PBS缓冲液5mL，之后将对应pH值的  新鲜PBS缓冲液5mL加 入到原释放介质中，测量收集的pH缓冲液在267nm处的吸光度，  依据267nm处的紫外吸光值 与HCPT浓度之间的线性方程，计算不同pH条件下各时间点时  HCPT的累计释放。 (6)药物靶向性检测 将牛乳腺上皮细胞MAC-T细胞接种到6孔板中，用1mL含有10μg/mL  LPS的培养  液 处理12h后，弃去培养液，PBS冲洗3次，然后再加入1mL  1μg/mL的  GO/CS/Pep/Anti-TLR4/ HCPT培养液孵育12h后，弃去培养液，PBS冲洗细胞3次，最后再  用即用型PI染色15min后，用 PH＝7.4的PBS漂洗3次，用抗荧光淬灭封片剂进行封片，在  激光共聚焦显微镜下进行荧光 成像。 (7)炎症因子含量及相关酶活性检测 将牛乳腺上皮细胞MAC-T细胞接种到6孔板中，用1mL含有10μg/mL  LPS的培养  液 处理孵育12h后，弃去培养液，PBS冲洗3次，加入1mL  1μg/mL的  GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT 培养液继续培养6h，收取细胞上清液，检测TNF-α和IL-6的含 量，以及NAGase和LDH的活性。 附图说明 图1为GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT的Zeta电位及紫外吸收图。 图2为GO/CS/Pep/Anti-TLR4载药能力、载药效率表。 图3为GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT不同pH条件下的药物释放图。 5 CN 111588864 A 说　明　书 3/3 页 图4为GO/CS/Pep/Anti-TLR4/HCPT靶向作用验证图。 图5为TNF-α、IL-6含量及NAGase、LDH活性的检测结果图。