技术摘要：
本发明公开了一种新型的枣花蜂蜜真实性评价方法。具体涉及一种利用液相色谱串联质谱检测中蜂蜜中伯胺氧化酶的方法，用于枣花蜂蜜的真实性评价。包括：枣花蜂蜜中伯胺氧化酶的水解之后的特征肽段筛选，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测等步骤。本发明所提出的  全部
背景技术：
蜂蜜是一种天然甜味食品，深受人们喜爱。糖类和水分是蜂蜜中的主要物质，此 外，蜂蜜中还含有丰富氨基酸、酚酸、黄酮、微量元素等对人有益的物质。蜂蜜种类繁多，按 照蜜源植物的不同，可以分为洋槐、椴树、枣花、荆条、荔枝、龙眼、油菜等单花蜜。其中枣花 蜜因味道甘甜、花香葱郁，且具有良好的润肠、补血、调节免疫力和助眠等功效，深受广大女 性和老年人的喜爱。枣花蜜是我国北方地区夏季独有的蜂蜜品种，主要集中在山东、河南、 河北、和山西等等区域。由于蜜蜂采集枣花蜜时，易于出现一定程度的中毒反应，蜂群群势 下降很快，从而导致枣花蜜的产量相对较低。尽管枣花蜜售价显著高于其它种类单花蜜，但 是收获的枣花蜜远不能满足市场的需求。不良企业为了追逐高额利润，往往制造和销售掺 假的枣花蜜，主要是在枣花蜜蜂蜜中掺入其它种类蜂蜜，更有甚者，掺入大量廉价糖浆，从 而扰乱枣花蜜销售市场。如何有效评价枣花蜂蜜的真实性，保护蜂农和消费者权益成为当 前蜂产品亟需解决的难题之一。 蜂蜜中含有少量的蛋白质，主要是来源于蜂蜜分泌的王浆主蛋白和酶类等动物源 性蛋白，此外，还含有来源于蜜源植物分泌到花蜜中的植物源性蛋白。由于蜂蜜中植物源性 蛋白来源的特殊性，可以将其作为蜂蜜种类评价的专属性指标。本研究团队发现枣花蜂蜜 中存在大量的伯胺氧化酶(primary  amine  oxidase，PrAO)，其分子量约为18kDa。枣花花蜜 中的PrAO十分丰富，通过蜜蜂的采集行为，迁移并保留在蜂蜜中。PrAO仅仅存在于枣花蜂蜜 中，在其它种类的蜂蜜均未发现，具有专属性，是枣花蜂蜜的特有成分。此外，不同产地的枣 花蜂蜜中PrAO的含量相对稳定，因此，蜂蜜中PrAO的有无和含量可以作为枣花蜂蜜真实性 和纯度评价的关键指标。
技术实现要素：
本发明提供一种检测蜂蜜中伯胺氧化酶的方法及应用于该方法的特征肽段和应 用，通过特征肽段对蜂蜜中伯胺氧化酶进行高精度的定量检测，从而解决现有技术中，蜂蜜 掺假后难以鉴别的问题。 此方法可用于生产和商业中对枣花蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。 第一方面，本发明提供枣花蜂蜜中植物源性蛋白—伯胺氧化酶的鉴定及特征肽段 的筛选的方法，包括： A提取枣花蜂蜜样品中总蛋白，通过SDS-PAGE电泳方法分离、回收PrAO，胶内酶解 PrAO并除盐，复溶后进液相色谱串联质谱检测；使用PEAKS  Studio软件针对质谱结果进行 搜库，查询对比得到PrAO此特异性蛋白； 3 CN 111579705 A 说　明　书 2/6 页 B从质谱检测结果中筛选PrAO特征肽段以及其序列，人工合成所述特征肽段及对 应的稳定同位素内标肽段； 进一步，本发明提供可用于液相色谱串联质谱测定枣花蜂蜜中PrAO蛋白的特征肽 段，所述特征肽段选自如下任一个： i)AGPVISLASIYDR； ii)AGPVISLASIYDREQGK； iii)IIPGSLSSISLLSEDDYPQIR。 进一步地，特征肽段i)可作为定量肽段，特征肽段ii)和iii)可作为定性肽段。 第二方面，本发明提供了一种基于液相串联高分辨质谱技术判定蜂蜜是否为枣花 蜂蜜并对枣花蜂蜜样本的PrAO的特征肽段的定量方法，具体步骤如下： A：合成与储存肽段标品：特征肽段AGPVISLASIYDR和稳定同位素标记的内标(IS) 肽段AGPVISLASIYDR*由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度超过98％；储存在-20℃备 用。 B：标准曲线的绘制：在初始流动相(97：3v/v，水/ACN，含0.1％甲酸)中制备一系列 特征肽段标准品(5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL)，然 后向配置好的每个浓度的标准品中加入IS肽段至其浓度为500ng/mL。通过绘制分析物/IS 肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。 C：蜂蜜样本检测前处理：使用PBS缓冲溶液稀释蜂蜜样品，超滤法提取蜂蜜中蛋白 质，使用胰蛋白酶水解提取蛋白，酶解产物除盐，加入稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤 C中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；。 进一步地，步骤B、C中采用UHPLC-Q  Exactive  plus(或三重四级杆质谱)进行液相 色谱串联质谱检测： 应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术 方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。 具体地，采用UHPLC-Q  Exactive  Plus检测蜂蜜样本的图谱中应该含有枣花蜂蜜 PrAO特征肽段AGPVISLASIYDR的精确m/z值：681.37481([M 2H]2 )；样本的图谱中应该含有 添加的稳定同位素内标肽段AGPVISLASIYDR*的精确m/z值：686.37849([M 2H]2 )，其允许偏 差应在5ppm以内。 其MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有枣花蜂蜜PrAO特征肽段AGPVISLASIYDR的 特征碎片离子m/z  924.48,m/z  1037.56，相应地，稳定同位素内标肽段AGPVISLASIYDR*的 子离子图谱(MS/MS)中应含有碎片离子m/z  934.48,m/z  1047.57，且其精确质量数的误差 应当小于5ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方 可肯定所求的该蜂蜜样本中的PrAO含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。 本发明采用UHPLC-Q  Exactive  plus仪器对枣花蜂蜜中PrAO定量，基于高分辨质 谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数， 不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数 进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： 研究发现，枣花蜂蜜中伯胺氧化酶的含量相对恒定，本发明据此建立起一套枣花 4 CN 111579705 A 说　明　书 3/6 页 蜂蜜中伯胺氧化酶特异性蛋白鉴定的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本发明提供的枣花 蜂蜜伯胺氧化酶蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优 点，适用于枣花蜂蜜伯胺氧化酶的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂 蜜消费者的权益意义重大。 附图说明 图1为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus提取的伯胺氧化酶SEQ  ID  NO.2、SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID  NO.4三种肽段的离子流； 图2为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus检测的伯胺氧化酶SEQ  ID  NO.2、SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID  NO.4三种肽段的质谱图； 图3为本发明实施例1提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus检测的伯胺氧化酶SEQ  ID  NO.2、SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID  NO.4三种肽段的二级碎片质谱图； 图4为本发明实施例2提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus提取的稳定同位素内标 肽段AGPVISLASIYDR*的离子流； 图5为本发明实施例2提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus检测的稳定同位素内标 肽段AGPVISLASIYDR*的质谱图； 图6为本发明实施例2提供的通过UHPLC-Q  Exactive  plus检测的稳定同位素内标 肽段AGPVISLASIYDR*的二级碎片质谱图； 图7为本发明实施例3提供的筛选出的各肽段的响应度对比图。