技术摘要：
超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法及应用，涉及一种细胞生长因子的保护剂及其制备方法及应用。是要解决sPL在长时间放置、经过温度改变或震动后，出现不稳定现象，有不溶性成分析出的问题。该保护剂包括A液和B液；A液包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚乙烯吡  全部
背景技术：
哺乳动物的血液由55％血浆和45％血液细胞组成的，其中血液细胞又可以分为红 细胞、白细胞和血小板三类。血小板在血液细胞中占比小于1％，在生理状态下，起到维持血 管内皮的完整性，参与止血和凝血作用，当身体受到创伤后，血小板启动凝血机制，释放出 凝血因子、促血管活性因子和生长因子等成分，对早期的创伤愈合、血栓形成、组织修复起 着重要的调节作用。 正常人血液中血小板计数为100×109～300×109个/升，当血液中血小板过低时容 易出血。有些疾病会伴随着血小板缺少症，因此在临床疾病治疗上输入血小板可以用于救 治一些因各种原因造成的血小板减少或功能异常的患者，例如白血病、再生障碍性贫血、淋 巴瘤、骨髓移植前等血液病患者以及因放化疗而引起骨髓抑制的癌症病人，其中有很多患 者需要依靠不间断地输注血小板来维持生命。另外，研究表明，血小板中有很多细胞生长因 子和调节因子，在多种生理病理条件下可以起到对机体的修复作用，比如血小板衍生生长 因子(PDGF)是由血小板的α颗粒合成的糖蛋白，主要通过与成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细 胞上的a受体结合，激活衰老受损局部细胞的有丝分裂，增加细胞基质产物，使再生细胞增 多，在激发新血管形成和促进已有血管生长中也起到重要作用，PDGF是一种对高效促有丝 分裂的因子，尤其对中胚层来源的细胞，包括肌肉细胞和间质细胞有促进分裂和繁殖作用； 转化生长因子-β(TGF-β)是一种可以控制细胞增殖和分化的糖蛋白，可以促进成纤维细胞 的扩增、促进合成胶原和纤维蛋白原又掉骨基质的沉淀和抑制骨吸收，同时TGF-β参与体内 许多炎症反应，是体内多功能的基础抗炎细胞因子；纤维细胞生长因子(FGF)能促进血管新 生，激发成纤维细胞生产，加速损伤组织修复和胚胎发育；表皮生长因子(EGF)能够修复上 皮细胞，加速细胞繁殖和分化；血管内皮生长因子(VEGF)能产生胶原蛋白，激生透明质酸， 从而有较强修复组织作用和促进血管生成作用；胰岛生长因子-1(IGF-1)是成纤维细胞趋 化剂并能促进蛋白合成和骨形成。 利用血小板中营养因子制备成超活性多细胞因子制剂sPL进行临床治疗方法就是 将制备完成的尽量少含红细胞的富血小板血浆利用高效诱导技术、冻融原理进行裂解，快 速血小板中营养因子释放方法，在骨、软骨修复、皮肤损伤修复、常规方法难以修复的韧带 损伤修复、以及由于手术造成的骨缺损、颌面部重构、牙龈缺损修复等过程都起到重要作 用。研究对比超活性多细胞因子制剂sPL和富血小板血浆发现，富血小板血浆存在较强的免 疫原性，多用于自体移植，而血小板裂解液制备过程中不仅去除了残余细胞结构，降低了免 疫原性，而且还保留了其中的多种生长因子，可为异体或异种移植创造条件。因此，如作为 构建组织工程化组织的潜在选择，超活性多细胞因子制剂sPL可能具有比富小板血浆更优 越的应用前景。 超活性多因子制剂sPL制备后，经过梯度离心、温度改变和过滤等过程，去掉了纤 3 CN 111569050 A 说　明　书 2/7 页 维蛋白和颗粒性成分，但剩余的成分仍包括血小板中的多种细胞因子、促粘附因子、促血管 形成因子、趋化因子、凝血因子、免疫调节因子以及血浆中的部分蛋白成分、脂膜成分、核酸 成分等，超过150多种成分。这些成分在sPL中呈现富集状态。正常情况下，将制备完成的sPL 会在短时间内使用，不会出现不稳定现象，对骨科、皮肤修复等需要制备后短时间内进行应 用的过程不会造成影响。当在用于细胞培养等需要存放时间长、温度改变、震动等过程后， 会出现不稳定现象，样品中有不溶性成分析出，而不溶性析出物也会将营养因子同时裹挟 带走，影响sPL产品使用效果。
技术实现要素：
本发明是要解决sPL在长时间放置、经过温度改变或震动后，出现不稳定现象，有 不溶性成分析出的问题，提供一种超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法。 本发明超活性多细胞生长因子sPL的保护剂包括A液和B液；其中A液按重量份数包 括0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮、0.11份的蔗糖 脂肪酸酯和15～16份乙醇溶液； B液包括0.5-1.1mg/mL的黄原胶、0.2-0.4mg/mL的帕洛沙姆-188、0.6-1.2mg/mL的 海藻酸钠、180-220U/mL的肝素钠和纯净水； 其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。 进一步的，所述乙醇溶液的体积浓度为95％。 本发明还提供超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，包括以下步骤： 一、A液配置方法：按重量份数称取0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、 0.05份的聚乙烯吡咯烷酮和0.11份的蔗糖脂肪酸酯，加入到15～16份的乙醇溶液中，高速 搅拌至溶解； 二、B液配制方法：将黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠和肝素钠加入到纯净水中， 搅拌至溶解；B液中黄原胶的浓度为0.5-1.1mg/mL，帕洛沙姆-188的浓度为0.2-0.4mg/mL， 海藻酸钠的浓度为0.6-1.2mg/mL，肝素钠的浓度为180-220U/mL； 三、将A液加入B液中，边加入边搅拌，直至呈均一状态，即得到保护剂；其中A液和B 液的体积比为1:(45-55)。 进一步的，步骤一中所述乙醇溶液的体积浓度为95％。 进一步的，步骤一中所述高速搅拌的速度为200-300rpm。 本发明还提供上述保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL中的应用。 进一步的，保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL的具体方法为：将所述保护剂 在无菌条件下逐滴加入到sPL中，混匀。 进一步的，sPL液体与保护剂的体积比为100：(0.5-2)。 本发明的有益效果： 超活性多细胞生长因子sPL在制备过程中，经过血液分离、诱导、离心、破壁等过 程，血小板内释放出很多的成分，虽然在sPL制备的最后一步也经过离心、过滤等过程，形成 相对稳定的均一态液体。但是随着放置时间的延迟、温度的改变和环境振动的因素和酶促 反应，会将原有的多种营养成分的均一态打破，造成脂溶性物质和大分子蛋白的聚集、析 出，这种析出也会裹挟着其他可溶性成分，造成sPL营养成分的流失和应用效果的降低。 4 CN 111569050 A 说　明　书 3/7 页 本发明中的保护剂组成包括脂溶性成分A液和水溶性成分B液。A液中含有可以促 进脂溶性成分分散、乳化的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖脂肪酸酯。A 液中四种成分对sPL中的极微小的脂溶性物质例如血小板颗粒中的膜性结构起到溶解和分 散作用。B液中含有黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠、肝素钠等水溶性成分，B液可以降低促 凝血类物质的活性和增加液体粘度等作用，防止大分子相互碰撞发生的水溶性降低、成分 析出、聚团、沉淀等连锁反应。 因此，本发明的保护剂对多种复杂组分的sPL具有保护作用，加入保护剂的sPL液 体呈现均匀状态，无明显片状、块状析出物析出，其稳定性不受温度变化、运输震动、时间长 短的影响。同时发现，sPL中添加本发明的保护剂后，还能防止水溶性因子例如PDGF、TGF-B 等被裹挟入沉淀中，保护了有效成分能长时间发挥作用。另外，本发明保护剂中各种成分并 未对sPL应用造成影响，从细胞学实验可以看出，细胞贴壁效率高，形态良好，相同的细胞接 种后经过72小时进行细胞拍照，可以看到加了保护剂的细胞与新鲜配置的sPL细胞长满度 均为90％，而没有加保护剂的经过48小时放置的sPL其因为营养因子的聚团无法被细胞充 分利用，细胞增殖数量降低，长满度仅为80％。 附图说明 图1为加入保护剂与未加保护剂的sPL在温度变化和震动条件下的状态对比图； 图2为加入保护剂与未加保护剂的sPL在长时间保存后状态对比图； 图3为不同保护剂添加比例的sPL使用效果对比图； 图4为稳定性测试结果； 图5为关键组分PDGF析出情况测试结果； 图6为关键组分TGF-B析出情况测试结果； 图7为添加保护剂的sPL进行细胞培养后的细胞形态图； 图8为添加保护剂的sPL进行细胞培养后的细胞长满度统计。