技术摘要：
公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)‑氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。
背景技术：
与年龄有关的疾病可以说是21世纪生物医学面临的最大挑战。到2030年，65岁以 上的美国人数量将达到7000万——几乎占人口的25％。越来越多的老年人将面临慢性进行 性神经退行性疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病和其他痴呆症。到目前为止，年龄本身是 所有这些迟发性神经退行性疾病的单一最大的共同风险因素。这些人口统计资料显示，神 经退行性疾病的患病率正在上升，这表明治疗市场非常庞大且正在扩大。然而，造成这种与 年龄相关的风险的机制仍然知之甚少，迄今为止，还没有针对这些疾病中任何一种的疾病 改良疗法。 有针对帕金森病的对症疗法，但由于疾病的持续发展，这些疗法在持续治疗后失 败。阿尔茨海默病的治疗方法价格昂贵，但基本上无效，主要用作家庭的安慰剂。任何能够 在功能上显著减慢这些疾病中任何一种的治疗方法将是向前迈出的重要一步。需要用于神 经退行性疾病的新的有效疗法。 II.
技术实现要素：
本文公开了在对象中减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起 始和/或治疗与年龄有关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向 所述对象施用治疗剂；其中治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶 (NOX)或下游NOX效应物。 在一方面，本文公开了减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起 始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其 中神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、1型脊髓小脑共济失调、年龄相 关性痴呆、路易体痴呆、可能的血管性痴呆、额颞痴呆和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。 本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或 治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中NOX是 选自NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5的NOX亚型，和/或下游NOX效应物包含活性氧物质、过氧 化氢或超氧化物。因此，一方面，治疗剂可通过抑制、减少和/或消除下游NOX效应物例如 ROS、过氧化氢和/或超氧化物来减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬的 起始和/或治疗与年龄有关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病。 在一方面，本文公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起 始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其 中所述治疗剂是信号转导物和转录激活因子3(STAT3)抑制剂，并且其中所述治疗剂减少 STAT3介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。 4 CN 111601643 A 说　明　书 2/38 页 本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或 治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中所述 治疗剂是抗IL-6抗体或抗炎剂，并且其中所述治疗剂减少IL-6介导的NOX活化，从而引起 NOX抑制。 本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或 治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中抑制 NOX或NOX下游效应物的试剂是小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、肽或蛋白质，包括但不 限于包含二亚苯基碘 的小分子。罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5- 甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶(dismutazyme)、C60 的丙二酸衍生物、C60的乙酸衍生物或其任何组合。 III.附图说明 并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施方案，并且与说明书 一起示出了所公开的组合物和方法。 图1A、图1B、图1C和图1D显示了WT小鼠海马中p62聚集体的年龄依赖性积累。对来 自年老(1A，24个月)或年轻(1B，4个月)小鼠的切片进行p62免疫染色(红色)。图1C显示了簇 所占据的海马面积％，平均值±SD，n＝8，通过t检验，*p<0.05。图1D显示了使用Imaris软件 对聚集体进行的3-D重建，显示了聚集体内数百个3μm至8μm离散沉积物。底部显示了穿过聚 集体中心的90°光学截面。包含Dapi(蓝色)以显示细胞核。 图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G和图2H显示了p62阳性聚集体与其他蛋白 质的共定位。图2A、图2B、图2C、图2D和图2E显示了p62(红色)和帕金蛋白(绿色)免疫染色的 年老海马。图2A显示了合并的通道，(2B)各个通道，(2C)聚集体的更高放大率，(2D)300正交 视图，(2E)使用Sigmaplot  11和Sigmastat  4.0的信号之间的统计相关性(r2＝0.81，p＝ 0.013)。图2F和图2G显示了p62和Sumo3(2F)或lamp2(2G)的合并图像(蛋白质也涉及通过溶 酶体处理的蛋白质)。图2H显示了p62和颤蛋白(神经蛋白)。p62和Sumo3与颤蛋白有大量重 叠，而与lamp2仅部分重叠。 图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F显示了p62阳性蛋白聚集体和GABA能神经元纤 维之间的部分重叠。大多数p62蛋白聚集体不与钙调蛋白(CR)(3A)和PV神经元(3D)结合。一 些p62聚集体标记有CR(3B和3C)或PV(3E和3F)。图3B、图3C、图3E和图3F是1mm厚的光学切片 的共聚焦照片。箭头和箭头标记分别表示被CR或PV标记或未被CR或PV标记的p62点。 图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G和图4H显示了星形胶质细胞与p62蛋白聚 集体之间的结合。在小胶质细胞中很少观察到p62免疫反应性(由Iba标记；4A和4E)。在细胞 体内，一些用GFAP标记的星形胶质细胞含有p62阳性点。有时，星形胶质细胞被p62阳性聚集 体(4B和4F)包围。在GFAP-GFP小鼠中进一步证实了含有p62的聚集体与星形胶质细胞的结 合，该小鼠能够显示带有GFP荧光的星形胶质细胞的精细投影(4C和4G)。同样，颤蛋白阳性 聚集体也与星形胶质细胞结合或位于星形胶质细胞内部(4D和4H)。图4A、图4B、图4C和图4D 是1mm厚度的5至20个切片的投影，而图4E、图4F、图4G和图4H是1μm厚的切片的对应代表，以 确认是否存在共定位。 图5显示了Nox的抑制或歧化酶模拟物C3对超氧化物的减少作用，可减少p62聚集 5 CN 111601643 A 说　明　书 3/38 页 体的积累。12月龄至17月龄的雌性C57BL6小鼠在水中接受了罗布麻宁(50mg/kg)或C3(1mg/ kg/天)，然后进行了灌注。将固定的脑进行切片，并对p62进行免疫染色。共聚焦图像分析了 每只小鼠的6个海马/3个切片，每组4只小鼠。为了量化含p62的聚集体，由设盲的研究人员 在描绘的区域中分别将聚集体圈起来，并使用Image  J测量聚集体面积。显示了聚集体覆盖 的面积和簇数。平均值±SEM，*p<0.05，***p<0.001，Mann-Whitney秩和检验。 图6显示了与年轻小鼠相比，年老小鼠海马神经元中的溶酶体明显更大。用针对 Lamp1和小清蛋白(PV)的抗体对5月龄和20月龄的雌性小鼠的脑切片进行免疫染色，选择该 抗体以分析单个神经元中的溶酶体。在老年和年轻的动物中，在PV神经元和周围的锥体神 经元中，lamp1标记的溶酶体均较大。使用Image  J使用分析颗粒功能在1μm厚的光学切片中 定量分析PV神经元中的溶酶体；年轻n＝8，年老n＝7。*p<0.001，Mann-Whitney秩和检验。 图7显示了组织蛋白酶D(CatD)的蛋白质印迹，其显示了年老和年轻小鼠海马提取 物中pre-pro-CarD的积累。Pre-pro-CatD(ppCatD)要求通过将CatD放在酸性环境中进行自 溶处理，因此这些数据与衰老的脑中溶酶体酸化受损有关。 图8A、图8B、图8C、图8D和图8E显示了在p62阳性聚集体附近神经元纤维受到损伤 的初步证据。图8A显示了具有表达YFP的锥体神经元的海马(绿色)显示p62聚集体附近的裸 露区域(14月龄的小鼠)。对p62(红色)和PV(绿色)进行免疫染色的年轻(8B，4月龄)与年老 (8C，24月龄)大脑切片的高倍图像，使单个纤维更清晰可见。图8D和图8E显示了更高倍数的 放大图像，其显示了与p62阳性聚集体直接相邻的纤维损失。 图9显示了用促炎性LPS治疗和通过C3共同治疗恢复功能导致的J774A.1细胞中的 溶酶体损伤。 IV.