技术摘要：
本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种COVID‑19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒，基于抗原抗体反应，利用纳米微球作为载体接上冠状病毒蛋白抗原，当交联有抗原的微球与抗体结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性  全部
背景技术：
新型冠状病毒肺炎-2019(COVID-19)是一种新发现的冠状病毒，其引起的这种  新 型肺炎疾病，发病快，传播速度快，若不及时诊断治疗，病死率非常高。鉴于  COVID-19病毒 具有传染性强、传播迅速的特点，找到一种准确性高、低成本、操作  方便的快速筛查诊断方 法可以有效地控制疫情，避免巨大的人员物资的损耗与浪费。 目前，可以检测COVID-19的方法有：PCR基于核酸检测的PCR方法、ELISA  法以及胶 体金免疫层析法等。其中，基于核酸检测的PCR方法虽然是临床的金标准，  但是其取样复杂 (咽试纸)，需要专业医护人员，且检测时间长，不适用于在高速公  路、机场、火车站等关口 设置的快速筛查方法。ELISA法虽然敏感性和特异性很好，  但是，操作复杂，而且测试时间 长，完成全部试验需要2～4个小时以上。而胶体金 免疫层析法操作简单、检测时间短，但准 确度不高，检测范围窄，而且所选用的试  剂(酶联IgM二抗、酶联IgG二抗等)造价较高。 中国专利CN1661372A公开了一种用于检测SARS抗体的免疫微球及其制备方  法和 用途。该免疫微球是以表面有羧基修饰的聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基  通过多聚赖 氨酸化学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S、N、M或E蛋白。但该专  利在聚苯乙烯微球制备 过程中，由于聚苯乙烯微球中的羧基含量低(可用于活化、  偶联的位点少)、疏水性强、非特 异性吸附高。为解决微球的亲水差和偶联位点少的，  在后续抗原偶联过程中，需要额外引 入亲水性和富含氨基的多聚赖氨酸，造成操作 步骤多、时间长、偶联效率低的问题。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供基于微球技术的新型冠状病毒  (COVID- 19)抗体检测微球及含该微球的试剂盒，该检测试剂盒具有较高的检测灵  敏度和特异性， 稳定性好，操作简单，反应时间短；可适用于肉眼观察、手机拍照、  全自动生化分析仪等多 种检测方式。 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种COVID-19病毒抗体检测微球，所述检测微球为高分子纳米颗粒表面的羧  基 上偶联COVID-19病毒重组抗原。 优选地，所述COVID-19病毒重组抗原为COVID-19病毒重组S蛋白、COVID-19  病毒 重组N蛋白、COVID-19病毒重组M蛋白和COVID-19病毒重组E蛋白中的一  种或几种。 优选地，所述高分子纳米颗粒，其粒径为100～300纳米；所述高分子纳米颗粒  为 含羧基的高分子纳米颗粒或含环氧基的高分子纳米颗粒； 所述含羧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸和/或丙烯酸为单体，与苯乙烯、 甲 4 CN 111551713 A 说　明　书 2/14 页 基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸羟乙酯的一种或多种共聚； 所述含环氧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体得到的聚甲  基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒，或以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体与苯乙烯、甲基  丙烯酸 甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸和丙烯酸的一种或多种共聚。 更具体地，所述高分子纳米颗粒所采用的高分子选自聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-  甲基丙烯酸(PST-MMA-MAA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸缩水甘油酯  (PST- MMA-GMA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯  (PST-MMA-HEMA)、聚苯乙烯-甲 基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸(PST-HEMA-MAA)、  聚苯乙烯-甲基丙烯酸(PST-MAA)、聚苯乙 烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PST-GMA)、  聚苯乙烯-甲基丙烯酸羟乙酯(PST-HEMA)、聚甲基 丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸  (PMMA-MAA)、聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PMMA- GMA)和聚 甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯(PMMA-HEMA)中的一种或几种。 本发明还提供了上述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法，所述制备方法  包 括以下步骤： 1)高分子纳米颗粒加入NHS进行羧基的活化； 2)加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应； 3)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂  和防腐剂 的缓冲溶液即得COVID-19病毒抗体检测微球。 具体地，当针对含羧基的高分子纳米颗粒时，上述COVID-19病毒抗体检测微  球的 制备方法包括以下步骤： 1)含羧基的高分子纳米颗粒加入NHS或碳二亚胺进行羧基的活化； 2)加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应； 3)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂  和防腐剂 的缓冲液即得COVID-19病毒抗体检测微球。 优选地，步骤1)中，活化温度4-37℃，活化时间10min～12h；步骤2)中，  偶联反应 温度4-37℃，偶联反应时间1～24h；步骤3)中，所述缓冲液为PBS缓冲  液、Tris-HCl缓冲液、 硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓  冲液的浓度为0.005～ 0.05mol/L；pH为6.0～8.0。 进一步优选地，采用NHS进行羧基活化时，步骤1)中，活化温度4-30℃，活  化时间 10～30min。步骤2)中，偶联反应温度4-30℃，偶联反应时间1～10h。 进一步优选地，采用碳二亚胺进行羧基活化时，步骤1)中，活化温度4-37℃，  活化 时间2-12h；步骤2)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间4-24h。 优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比  妥 酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。 当针对含环氧基的高分子纳米颗粒时，上述COVID-19病毒抗体检测微球的制  备 方法包括以下步骤： 1)含环氧基的的高分子纳米颗粒加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应； 2)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂  和防腐剂 的缓冲液即得COVID-19病毒抗体检测微球。 优选地，步骤1)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间4～48h；步骤2)  中，所述 5 CN 111551713 A 说　明　书 3/14 页 缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸  缓冲液中的一 种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。 本发明中，优选地，所述稳定剂选自小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、蔗糖、  甘油中的 一种或多种；所述稳定剂的质量百分比浓度为0.5～20％。 本发明中，优选地，所述防腐剂选自叠氮化钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸 中的 一种或多种；所述防腐剂的质量百分比浓度为0.005-1％。 本发明进一步提供了一种COVID-19病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括上  述 的COVID-19病毒抗体检测微球。 本发明提供的一种新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒，其主要成分是  抗 体检测微球试剂，包含COVID-19病毒重组抗原修饰的纳微米颗粒、pH  6.0～8.0 的缓冲液、 稳定剂和防腐剂。 在上述方案的基础上，所述的抗体检测微球试剂为COVID-19病毒重组蛋白修  饰 的纳微米颗粒(高分子纳米颗粒)； 优选地，纳微米颗粒可以由多种原料制备，优选聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基  丙烯酸(PST-MMA-MAA)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸  (PGMA- MMA-MAA)、聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PMMA-MAA)、聚甲基丙  烯酸缩水甘油酯(PGMA) 中一种或两种的组合。 优选地，所使用的COVID-19病毒重组抗原蛋白可以是COVID-19新型冠状病  毒的 重组N蛋白。 优选地，COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法所制备终产品中重组蛋白的浓  度为0.025～2.0mg/mL。 在上述方案的基础上，所述的抗体检测微球试剂由以下方法制备而成： 步骤1)采用全基因合成技术合成COVID-19病毒N蛋白基因序列，内切酶消  化后连 入pET30a质粒(Nova  gen)，并转化BL21感受态(DE3)宿主菌，培养后采  用超声或高压均质 的方法破碎细胞，将细胞上清进行离子交换层析和金属螯合层析  进行纯化并鉴定，得到 COVID-19的重组N蛋白。 优选地，破碎细胞为在冰水浴中进行超声破碎(30min，超声3s/停3s，30％功 率)。 优选地，采用金属螯合层析的方式进行蛋白纯化。 步骤2)取15～60mg/mL的高分子纳米球，按一定比例加入N蛋白，以NHS 活化、环氧 活化、碳二亚胺活化等方式连接N蛋白与纳米球； 优选地，采用NHS反应对纳米微球表面的羧基在4-30℃下进行10～30min的 活化， 然后与蛋白在4～30℃下进行1～10h的偶联反应，将蛋白偶联到微球上。 优选地，COVID-19的重组N蛋白加样终浓度为0.025～2.0mg/mL。 优选地，利用NHS/EDC反应的高反应活性，通过蛋白上的氨基将蛋白偶联到微  球 上。 步骤3)反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计  算 偶联到纳米微球上的N蛋白量。 步骤4)加入1-10mL浓度为0.5～10mg/mL  BSA到微球溶液中封闭微球上残留 的未 反应基团，室温下垂直混合过夜。 6 CN 111551713 A 说　明　书 4/14 页 步骤5)采用离心的方式将免疫微球离心，去除上清液；用缓冲液重悬和离心；  将 免疫微球用缓冲液重悬，并用200～600W超声波处理20s分散微球，得到检测微  球，随后加 入稳定剂和防腐剂。 在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的  抗体 检测微球试剂可以采用预铺板试剂盒的方式进行检测，即将抗体检测微球试剂  涂布在基 底材质上，包装成型，随后进行检测。 其制备步骤如下： 步骤1)将抗体检测微球试剂滴于洁净的玻片或透明塑料片上； 步骤2)在适当干燥条件下干燥。 优选地，所述适当干燥条件可以包括：室温环境自然干燥5～10min，37℃下干  燥2 ～5min，减压干燥2～5min(0.5～2.6kPa)； 在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的  缓冲 液包括PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、巴比妥酸-盐酸缓冲液 的一种或多 种组合； 优选地，所述缓冲液为0.005～0.05M浓度的PBS缓冲液； 优选地，所述缓冲液的pH为6.0～8.0； 在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的  稳定 剂包括小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、蔗糖、甘油中的一种或多种组合； 优选地，所述稳定剂为5～50mL的质量百分比浓度0.5～10％BSA溶液、质量  百分 比浓度1～20％甘油溶液、质量百分比浓度10～20％蔗糖中的一种或几种组合； 在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的 防腐 剂包括叠氮化钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸中的一种或多种组合； 优选地，所述防腐剂为质量百分比浓度0.005-0.01％NaN3、质量百分比浓度  0.1- 0.5％Proclin  300；0.1％-1％对羟基苯甲酸一种或多种组合； 本发明的新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒的检测方式为： 采用预铺板试剂盒进行检测，即将抗体检测微球试剂涂布在基底材质上，包装  成 型，随后进行检测； 步骤1)铺板：将抗体检测微球试剂滴于洁净的玻片或透明塑料片上；优选地，  铺 板加取抗体检测微球试剂量为0.5～2μL； 步骤2)首次干燥；优选地，在室温下干燥5～10min，或在37℃下干燥2～5min； 步骤3)点样；优选地，将被测血清样品滴在干燥好的铺板表面，点样量为0.5～  2μ L； 步骤4)再次干燥，优选地，在室温下干燥5～20min，或在37℃下干燥5～10  min； 步骤5)采用适当的检测方式进行观察，记录阴性与阳性。优选地，适当的检测  方 式可以包括：肉眼、手机显微镜、放大镜和光镜一种或几种的组合。 本发明的试剂盒抗体阳性率检测可以基于乳胶增强比浊法，以全自动生化分析  仪、特种蛋白仪及分光光度计检测，其具体步骤为： 步骤1)稀释：将抗体检测微球试剂稀释20～500倍，加入到生化分析仪储存瓶 中； 步骤2)加样：将10μL～200μL血清加入到样品管中； 7 CN 111551713 A 说　明　书 5/14 页 步骤3)设置参数：将抗体检测试剂与待测血清按照1:10～3:7之间的比例进行  混 合加样设置； 步骤4)以检测数值进行分析。 试剂盒抗体阳性率检测可以选用肉眼观察、光镜观察或全自动生化分析仪及分  光光度仪一种或几种的组合。 本发明检测结果可以区分COVID-19抗体的阴性和阳性；优选地，其检测结果  可以 给出COVID-19抗体的强阳性、中阳性、弱阳性和阴性。 本发明是基于抗原抗体反应，利用纳米微球作为载体接上冠状病毒N蛋白抗原，  当交联有抗原的微球与抗体结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液 的散光 性能或透光性能。在载玻片或者其他透明基底下，微球与待测血清中综合抗  体的结合，可 以产生雾面或者黑点(透光性差的区域)，可以采用肉眼、手机、放大  镜以及光镜等简单的 仪器观察，根据雾面范围尺寸和黑点(透光性差的区域)的相  对占比，省去了ELISA法反复 孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，  省时省力，判断弱阳性、强阳性、中阳 性和阴性。适用于简单、低成本、快速的筛 查方法。 另一方面，在均相的溶剂中，本发明的微球与待测样品中综合抗体(IgM和IgG  等) 结合引发的聚集，引起了反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变，其与被  测抗体浓 度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗体浓度。与全自动生化  分析仪、蛋白分 析仪和免疫比浊技术的联合使用，可以得到半定量的抗体浓度结果。 本发明采用COVID-19病毒重组抗原；微球采用了亲水性更好、羧基含量更高 的聚 苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PST-MMA-MAA)等微球，有利于简化后  续的抗原偶联 操作；抗原偶联优选采用NHS活化偶联技术，比EDC活化偶联技术 的步骤少(仅3步)、时间短 (小于12h)、偶联效率更高(大于95％)；结果判定上  采用肉眼、手机、放大镜以及光镜等简 单的仪器观察，也可以在全自动生化分析仪 上检测。 与现有技术相比，本发明有益效果为： 1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单； 2)本发明试剂盒反应快速，时间只需数分钟，省时省力，避免了酶联免疫诊断  试 剂盒需要数小时的费时的缺点，适用于快速筛选试剂； 3)本发明试剂盒可以肉眼检测、手机拍照、放大镜、光镜等方式的直接观察，，  不 需要任何仪器设备，有利于产品的快速推广，适用于机场、火车站等关口的快速  筛选，适合 广大基层卫生防疫单位使用； 4)本发明试剂盒可以适用于全自动生化分析仪得到半定量数据，可以临床实时  表征患者病情和康复情况，满足针对COVID-19抗体的多种检测需求； 5)该方法不需要预处理样本，操作简便、准确可靠、重复性好，可用于全自动  生化 分析仪、特种蛋白仪及分光光度计上使用。 6)本发明操作简单，避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，  提升检测稳定性和重复性； 7)本发明的抗体检测微球试剂借助纳微米颗粒的聚集，放大了抗体与重组蛋白  的结合的光学信号，解决了抗原抗体反应临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实  验稳定 性差等问题。 8 CN 111551713 A 说　明　书 6/14 页 附图说明 图1实施例1中N蛋白的SDS-PAGE电泳图； 图2实施例1中抗体检测微球试剂电镜图； 图3实施例2中试剂盒检测血清中COVID-19特异性抗体的存在； 图4实施例2中试剂盒检测强阳性结果示例图( )； 图5实施例2中试剂盒检测中阳性结果示例图( )； 图6实施例2中试剂盒检测弱阳性示例图( )； 图7实施例2中试剂盒检测阴性示例图(-)； 图8实施例2中标准抗体检测试剂盒灵敏度(检出限)； 图9实施例2中标准抗体交叉反应结果图； 图10实施例3中200个COVID-19阳性病例微球检测结果； 图11实施例3中200个COVID-19阳性病例各年龄段微球检测结果统计。