技术摘要：
一种苏云金芽胞杆菌营养期强启动子Prsi及其应用。本发明发现了一个在苏云金芽胞杆菌营养期工作的强启动子Prsi，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其核心位点如图1所示。本发明发现的启动子为组成型强启动子，该启动子在苏云金芽胞杆菌中表达β‑半乳糖苷酶的活性是芽  全部
背景技术：
启动子是含有RNA聚合酶特异性识别、结合和转录起始所需的保守序列的基因表 达元件，多数位于结构基因转录起始点的上游。对于原核生物而言，其启动子一般都包含- 10区和-35区。 细菌是良好的蛋白表达机器，大肠杆菌是目前最常用的蛋白表达宿主菌，但是大 肠杆菌往往需要破碎才能获得目的蛋白。芽胞杆菌可以向环境中分泌大量蛋白质，利于蛋 白的后续纯化，是很有潜力的分泌型基因工程宿主菌。随着枯草芽胞杆菌和一些相关菌株 的基因组的表征，随着我们进入基因组和蛋白质组学时代，芽胞杆菌种有望成为生产许多 新产品和改良产品的首选宿主。但是芽胞杆菌在生长后期会分泌大量蛋白酶，这大大限制 了芽胞杆菌系统的应用。应用营养期强表达的启动子可以减少蛋白酶的产生，缓解蛋白酶 对目的蛋白生产的阻碍。 目前芽胞杆菌中已报道的强启动子有P43、Phj3以及cry8E和HD73_5014的启动子 等。其中，HD73_5014的启动子是σE依赖的强启动子，表达β-半乳糖苷酶时可高达40000个米 勒单位的酶活，但它主要在芽胞期发挥作用。而Phj3是目前芽胞杆菌营养期表达效率最高 的启动子之一，表达β-半乳糖苷酶时可达8000个米勒单位的酶活。营养期强启动子对更好 的应用芽胞杆菌系统具有重要意义。 启动子按照是否需要诱导物可分为分组成型启动子和诱导型启动子两大类， Pamy，T7启动子等是常用的诱导型强启动子，需要在昂贵的诱导剂的使用下才能启动基因 表达，找到一个组成型表达的强启动子具有重要的应用价值。 B t是目前开发最成功的微生物杀虫剂，营养期杀虫蛋白 (veg e ta t i v e  insecticidal  proteins,VIPs)是一类在Bt营养期分泌的新型杀虫蛋白，对鳞翅目害虫具 有较好的杀虫活性。Vip3Aa是Vip的一种，在大肠杆菌BL21中表达纯化的Vip3Aa18蛋白对棉 铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性，而构建一株可以高表达Vip3Aa的芽胞杆菌工程菌对 生物杀虫剂的发展具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是要解决芽胞杆菌自身在生长后期分泌的分泌蛋白酶会降解外源 蛋白，降低芽胞杆菌系统外源蛋白表达效率的问题。本发明提供一种来源于苏云金芽胞杆 菌营养期高效表达的组成型强启动子，该启动子能在多种芽胞杆菌和大肠杆菌表达β-半乳 糖苷酶，并能在苏云金芽胞杆菌中高效表达杀虫蛋白Vip3A。 本发明的技术方案 第一方面，本发明提供了一种苏云金芽胞杆菌营养期强启动子Prsi，其核苷酸序 3 CN 111575290 A 说　明　书 2/6 页 列为序列表SEQ  ID  NO:1所示的核苷酸序列。 第二方面，本发明提供了一种含有强启动子Prsi的表达载体，所述表达载体为游 离型或整合型载体。优选地，所述游离型载体为广泛宿主穿梭质粒载体；所述整合型载体为 携带有靶基因翼侧500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体。 第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有第二方面所述的表达载 体。所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia  coli)或芽胞杆菌(Bacillus)。优选地，为大肠 杆菌(Escherichia  coli)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus  thuringiensis)、枯草芽胞杆菌 (Bacillus  subtilis)或蜡样芽胞杆菌(Bacillus  cereus)中的一种，更优选地为苏云金芽 胞杆菌(Bacillus  thuringiensis)。 第四方面，本发明提供第一方面所述强启动子或第二方面所述表达载体或第三方 面所述宿主细胞在启动目的基因表达中的应用。 本发明的优点和有益效果： 本发明以苏云金芽胞杆菌Bacillus  thuringiensis菌株为模板，扩增获得了一个 强启动子序列Prsi，以β-半乳糖苷酶为报告基因，对该启动子进行了评价。这个强启动子还 可以应用于除苏云金芽胞杆菌外的其他多种菌种中。该发明扩展了芽胞杆菌启动子元件的 应用范围，对于芽胞杆菌菌群中的基因表达、遗传基因操作和菌株改良也有重要意义。 附图说明： 图1、启动子Prsi结构示意图。 图2、重组穿梭载体pHT1K图谱。 图3、不同启动子高表达β-半乳糖苷酶的对比图，从左至右依次为Psod，Prsi， Pceb，Pusp，Pnda，Pcts，P43，Phj3，Pamy。 图4、强启动子Prsi的时相曲线。 图5、强启动子Prsi在不同菌株中的表达效果，从左至右依次为Bti75，Bt  HD73，Bt  BMB171，Bc9509，Bs168，E.coli  DH5ɑ菌株。 图6、高表达Vip3Aa18的苏云金芽胞杆菌重组菌株杀虫效果图。