技术摘要：
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，该方法通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割，以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行指数扩增，从而实现对不同 全部
背景技术：
对于大多数RNA病毒而言，以单链RNA(ssRNA)的形式感染生物，部分DNA病毒以单 链DNA(ssDNA)形式进行复制。此外，人体中许多RNA以单链形式存在以执行其特定功能。因 此，快速准确检测单链特异性核酸在疾病诊断和病理分析中起着至关重要的作用。同时核 酸序列中的单碱基改变，是构成细菌、病毒以及肿瘤抗药性的遗传学基础，同时也和多种疾 病有密切关系。所以快速准确的检测出核酸序列中的单碱基改变，同样对生物研究与疾病 诊断都将具有重要的作用。 目前，关于核酸的检测方法研究者们已开发了如基于核酸聚合酶、核酸水解酶、脱 氧核酶和纳米材料等的多种核酸信号放大技术。比如，目前最多的是基于聚合酶链式反应 (PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释 放荧光，这种方法不仅需要精密的变温控制仪器并且对单链寡核苷酸的检测有一定局限 性。研究者们还开发了一种基于核糖核酸酶H(RNaseH)的单循环核酸信号放大技术，即通过 环部带有RNA序列的分子信标与目标DNA杂交，在RNaseH的作用下将分子信标的RNA部分水 解，从而释放荧光基团。虽然这种技术的目标序列可以为单链寡核苷酸，但由于其为单循环 线性信号放大技术，信号放大效率较低从而一定时间内产生的信号强度不足，导致检测灵 敏度较低。从而限制了上述方法在实际中的应用范围。 近几年发展起来的恒温扩增技术是用于核酸检测最常用于信号放大的方法，无论 是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依 赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景，包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装 配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和EXPAR。其中，RCA方法涉及繁琐的 DNA探针连接过程和引物-模板比例的调整，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，且容易引 起背景干扰。EXPAR和SDA的高扩增效率使其成为有效的核酸检测扩增策略。然而，ssRNA和 ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，这使得ssRNA和ssDNA不能直接用作引发 扩增反应的引物。因此，建立用于测量ssRNA和ssDNA的准确而有效的策略仍然是一项极富 挑战性的任务。 CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种免疫系统， 用于抵抗外源物质的入侵。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicr epeats)是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该系统通过对入侵的病毒核酸进行特异性 的识别，利用CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)切割外源核酸从而达到防御的目的。近年来， CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调 控及基因检测等研究中。 3 CN 111575352 A 说 明 书 2/8 页
技术实现要素：
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9点 特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，旨在解决传统长链ssRNA或ssDNA检测成本 高、对热循环设备依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，以及ssRNA和ssDNA具 有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，不能直接应用于链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温 扩增技术的问题，使ssRNA和ssDNA现场可视化检测成为可能。 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种基于CRISPR-Cas9点 特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，包括以下步骤： 1)将不同浓度待检测的靶基因、PAMmer、Cas9与sgRNA以适当比例混合于缓冲溶液 中，并于37℃条件下孵育30～60min，得到点特异性切割产物；所述靶基因为ssRNA或ssDNA， 所述PAMmer与待测靶基因相匹配，所述sgRNA包括锚定序列和引导区序列，所述锚定序列与 Cas9蛋白特异性识别，所述引导区序列与所述靶基因的片段相匹配； 2)将步骤1)中得到的点特异性切割产物加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应， 经phi29DNA聚合酶延伸和Nb.BbvCI选择内切酶切割，得到富G序列的扩增产物； 3)向步骤2)得到的富G序列的扩增产物中加入含K 缓冲液和hemin溶液充分反应， 再加入过量的ABTS和H2O2孵育5min，使富G序列的扩增产物与hemin结合形成G-四链体能够 充分反应完全，再用紫外可见分光光度计检测反应体系的紫外可见光的吸收强度； 4)根据不同浓度靶基因的标准溶液做靶基因浓度-紫外可见光的吸收强度的标准 曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的紫外可见光的吸收强度，计算待测溶液中靶基因的 浓度。 本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割， 以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR 进行检测，该系统中可以人为设计sgRNA中与目标ssRNA或ssDNA互补的spacer区(20nt)从 而实现对不同靶标序列ssRNA和ssDNA可视化检测。 作为优选的，所述的sgRNA是通过部分互补的两条DNA单链重叠延伸获得转录模 板，再将所述转录模板进行转录得到。 作为优选的，所述重叠延伸的程序：95℃×3min；30个热循环：95℃×20s，52℃× 30s，72℃×25s；72℃×10min。 作为优选的，步骤1)中所述PAMmer、Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1:1。 作为优选的，步骤1)中所述待检测的靶基因在反应体系中的终浓度为100aM～ 2.5nM。 作为优选的，步骤2)中所述EXPAR反应体系包括0.3U/μLphi29DNA聚合酶，0.4U/μL Nb.BbvCI，1×DNA聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5mMdNTP和10nMEXPAR模板；扩增反 应温度为30～45℃，反应时间为1～2h；所述点特异性切割产物作为引物与EXPAR模板相匹 配，并延伸合成双链DNA。DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，Nb.BbvCI内切酶在特定识 别位点切割双链DNA中的一条链。 作为优选的，所述phi29DNA聚合酶还可以是KlenowFragment(exo-)DNA聚合酶或 vent(exo-)DNA聚合酶。 作为优选的，步骤3)中所述反应温度为30～45℃，反应时间为10～40min。 4 CN 111575352 A 说 明 书 3/8 页 作为优选的，步骤3)中所述吸收强度为420nm处的紫外吸收信号，检测范围400nm ～460nm。 本发明还提供了上述方法在检测ssRNA或ssDNA单碱基突变中的应用。 本发明检测原理为：如图1A所示，Cas9与sgRNA组装在一起形成Cas9/sgRNA二元复 合物。靶标ssRNA(或ssDNA)与PAMmer序列杂交。随后，Cas9识别PAMmer序列上的“NGG”(PAM) 位点，并促进sgRNA的20nt引导区序列与ssRNA(或ssDNA)靶序列杂交，形成20bp异源双链 体。Cas9对异源双链体的PAM附近的特定位置进行剪切，从而释放出目标ssRNA或ssDNA的点 特异性切割片段(P1)。 如图1B所示，以G4-EXPAR(包括X-Y-Y区域)为模板，以点特异性切割片段P1(能特 异性的与X区域结合)为引物，在phi29DNA聚合酶的作用下，沿模板的3’端向5’端延伸，延伸 的过程中形成双链DNA，在Nb.BbvCI内切酶的作用下激活了次级聚合酶延伸，所产生的链置 换效应释放前期的P2和P3产物(图1B中的循环1)。此外，P2和P3还可以用作引物，与G4- EXPAR模板中间的Y区域组装在一起，并通过聚合酶延伸和链置换循环积聚大量扩增产物P2 和P3产物(图1B中的循环2)。富G序列的扩增产物(P2和P3)在K 的辅助下，可与hemin结合形 成G-四链体，具有过氧化氢模拟酶的催化活性。G-四链体/hemin催化H2O2分解产生大量的活 性氧(ROS)，导致ABTS被氧化成ABTS· ，颜色由无色变为鲜绿色。因此，Cas-G4EX系统可实现 对ssRNA和ssDNA的无标记、点特异性的可视化检测。 相比现有技术，本发明具有如下有益效果： 1、本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切 割。以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发 EXPAR进行指数扩增，实现了对任意序列ssRNA和ssDNA的可视化检测。从而解决了长链 ssRNA和ssDNA无固定的3’末端，无法作为引物进行链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温扩增的 难题。 2、本发明的检测方法整合了CRISPR/Cas9的点特异性识别和切割以及G4-EXPAR的 高扩增效率，提供多级信号放大策略，实现高灵敏度对ssRNA和ssDNA检测的新方法，对 ssRNA的检测限为250aM，对ssDNA的检测限为100aM。同时本发明Cas-G4EX系统在实际样本 检测中具有极其重要的实用价值。本发明为单链核苷酸的检测提供了新思路和新选择，也 将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。 3、本发明的检测系统具有响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便，灵敏度高 和特异性强，结果读取简单，减少了对热循环仪器和精密信号采集仪器的依赖。 4、本发明首次利用PAMmer辅助CRISPR/Cas9系统的单链核酸切割活性，用于ssRNA 或ssDNA单碱基突变的检测，扩大了CRISPR/Cas9系统的检测和应用范围，并提供了可行性 的理论基础。 附图说明 图1为本发明检测系统对ssRNA/ssDNA检测原理图。 图2为本发明检测系统对ssDNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssDNA的紫外可见 光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。 图3为本发明检测系统对ssDNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特 5 CN 111575352 A 说 明 书 4/8 页 异性切割ssDNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssDNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不 同单碱基突变ssDNA的紫外可见光光谱响应图。 图4为本发明检测系统对ssRNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssRNA的紫外可见 光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。 图5为本发明检测系统对ssRNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特 异性切割ssRNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssRNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不 同单碱基突变ssRNA的紫外可见光光谱响应图。
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，该方法通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割，以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行指数扩增，从而实现对不同 全部
背景技术：
对于大多数RNA病毒而言，以单链RNA(ssRNA)的形式感染生物，部分DNA病毒以单 链DNA(ssDNA)形式进行复制。此外，人体中许多RNA以单链形式存在以执行其特定功能。因 此，快速准确检测单链特异性核酸在疾病诊断和病理分析中起着至关重要的作用。同时核 酸序列中的单碱基改变，是构成细菌、病毒以及肿瘤抗药性的遗传学基础，同时也和多种疾 病有密切关系。所以快速准确的检测出核酸序列中的单碱基改变，同样对生物研究与疾病 诊断都将具有重要的作用。 目前，关于核酸的检测方法研究者们已开发了如基于核酸聚合酶、核酸水解酶、脱 氧核酶和纳米材料等的多种核酸信号放大技术。比如，目前最多的是基于聚合酶链式反应 (PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释 放荧光，这种方法不仅需要精密的变温控制仪器并且对单链寡核苷酸的检测有一定局限 性。研究者们还开发了一种基于核糖核酸酶H(RNaseH)的单循环核酸信号放大技术，即通过 环部带有RNA序列的分子信标与目标DNA杂交，在RNaseH的作用下将分子信标的RNA部分水 解，从而释放荧光基团。虽然这种技术的目标序列可以为单链寡核苷酸，但由于其为单循环 线性信号放大技术，信号放大效率较低从而一定时间内产生的信号强度不足，导致检测灵 敏度较低。从而限制了上述方法在实际中的应用范围。 近几年发展起来的恒温扩增技术是用于核酸检测最常用于信号放大的方法，无论 是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依 赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景，包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装 配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和EXPAR。其中，RCA方法涉及繁琐的 DNA探针连接过程和引物-模板比例的调整，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，且容易引 起背景干扰。EXPAR和SDA的高扩增效率使其成为有效的核酸检测扩增策略。然而，ssRNA和 ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，这使得ssRNA和ssDNA不能直接用作引发 扩增反应的引物。因此，建立用于测量ssRNA和ssDNA的准确而有效的策略仍然是一项极富 挑战性的任务。 CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种免疫系统， 用于抵抗外源物质的入侵。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicr epeats)是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该系统通过对入侵的病毒核酸进行特异性 的识别，利用CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)切割外源核酸从而达到防御的目的。近年来， CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调 控及基因检测等研究中。 3 CN 111575352 A 说 明 书 2/8 页
技术实现要素：
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9点 特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，旨在解决传统长链ssRNA或ssDNA检测成本 高、对热循环设备依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，以及ssRNA和ssDNA具 有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，不能直接应用于链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温 扩增技术的问题，使ssRNA和ssDNA现场可视化检测成为可能。 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种基于CRISPR-Cas9点 特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，包括以下步骤： 1)将不同浓度待检测的靶基因、PAMmer、Cas9与sgRNA以适当比例混合于缓冲溶液 中，并于37℃条件下孵育30～60min，得到点特异性切割产物；所述靶基因为ssRNA或ssDNA， 所述PAMmer与待测靶基因相匹配，所述sgRNA包括锚定序列和引导区序列，所述锚定序列与 Cas9蛋白特异性识别，所述引导区序列与所述靶基因的片段相匹配； 2)将步骤1)中得到的点特异性切割产物加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应， 经phi29DNA聚合酶延伸和Nb.BbvCI选择内切酶切割，得到富G序列的扩增产物； 3)向步骤2)得到的富G序列的扩增产物中加入含K 缓冲液和hemin溶液充分反应， 再加入过量的ABTS和H2O2孵育5min，使富G序列的扩增产物与hemin结合形成G-四链体能够 充分反应完全，再用紫外可见分光光度计检测反应体系的紫外可见光的吸收强度； 4)根据不同浓度靶基因的标准溶液做靶基因浓度-紫外可见光的吸收强度的标准 曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的紫外可见光的吸收强度，计算待测溶液中靶基因的 浓度。 本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割， 以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR 进行检测，该系统中可以人为设计sgRNA中与目标ssRNA或ssDNA互补的spacer区(20nt)从 而实现对不同靶标序列ssRNA和ssDNA可视化检测。 作为优选的，所述的sgRNA是通过部分互补的两条DNA单链重叠延伸获得转录模 板，再将所述转录模板进行转录得到。 作为优选的，所述重叠延伸的程序：95℃×3min；30个热循环：95℃×20s，52℃× 30s，72℃×25s；72℃×10min。 作为优选的，步骤1)中所述PAMmer、Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1:1。 作为优选的，步骤1)中所述待检测的靶基因在反应体系中的终浓度为100aM～ 2.5nM。 作为优选的，步骤2)中所述EXPAR反应体系包括0.3U/μLphi29DNA聚合酶，0.4U/μL Nb.BbvCI，1×DNA聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5mMdNTP和10nMEXPAR模板；扩增反 应温度为30～45℃，反应时间为1～2h；所述点特异性切割产物作为引物与EXPAR模板相匹 配，并延伸合成双链DNA。DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，Nb.BbvCI内切酶在特定识 别位点切割双链DNA中的一条链。 作为优选的，所述phi29DNA聚合酶还可以是KlenowFragment(exo-)DNA聚合酶或 vent(exo-)DNA聚合酶。 作为优选的，步骤3)中所述反应温度为30～45℃，反应时间为10～40min。 4 CN 111575352 A 说 明 书 3/8 页 作为优选的，步骤3)中所述吸收强度为420nm处的紫外吸收信号，检测范围400nm ～460nm。 本发明还提供了上述方法在检测ssRNA或ssDNA单碱基突变中的应用。 本发明检测原理为：如图1A所示，Cas9与sgRNA组装在一起形成Cas9/sgRNA二元复 合物。靶标ssRNA(或ssDNA)与PAMmer序列杂交。随后，Cas9识别PAMmer序列上的“NGG”(PAM) 位点，并促进sgRNA的20nt引导区序列与ssRNA(或ssDNA)靶序列杂交，形成20bp异源双链 体。Cas9对异源双链体的PAM附近的特定位置进行剪切，从而释放出目标ssRNA或ssDNA的点 特异性切割片段(P1)。 如图1B所示，以G4-EXPAR(包括X-Y-Y区域)为模板，以点特异性切割片段P1(能特 异性的与X区域结合)为引物，在phi29DNA聚合酶的作用下，沿模板的3’端向5’端延伸，延伸 的过程中形成双链DNA，在Nb.BbvCI内切酶的作用下激活了次级聚合酶延伸，所产生的链置 换效应释放前期的P2和P3产物(图1B中的循环1)。此外，P2和P3还可以用作引物，与G4- EXPAR模板中间的Y区域组装在一起，并通过聚合酶延伸和链置换循环积聚大量扩增产物P2 和P3产物(图1B中的循环2)。富G序列的扩增产物(P2和P3)在K 的辅助下，可与hemin结合形 成G-四链体，具有过氧化氢模拟酶的催化活性。G-四链体/hemin催化H2O2分解产生大量的活 性氧(ROS)，导致ABTS被氧化成ABTS· ，颜色由无色变为鲜绿色。因此，Cas-G4EX系统可实现 对ssRNA和ssDNA的无标记、点特异性的可视化检测。 相比现有技术，本发明具有如下有益效果： 1、本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切 割。以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发 EXPAR进行指数扩增，实现了对任意序列ssRNA和ssDNA的可视化检测。从而解决了长链 ssRNA和ssDNA无固定的3’末端，无法作为引物进行链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温扩增的 难题。 2、本发明的检测方法整合了CRISPR/Cas9的点特异性识别和切割以及G4-EXPAR的 高扩增效率，提供多级信号放大策略，实现高灵敏度对ssRNA和ssDNA检测的新方法，对 ssRNA的检测限为250aM，对ssDNA的检测限为100aM。同时本发明Cas-G4EX系统在实际样本 检测中具有极其重要的实用价值。本发明为单链核苷酸的检测提供了新思路和新选择，也 将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。 3、本发明的检测系统具有响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便，灵敏度高 和特异性强，结果读取简单，减少了对热循环仪器和精密信号采集仪器的依赖。 4、本发明首次利用PAMmer辅助CRISPR/Cas9系统的单链核酸切割活性，用于ssRNA 或ssDNA单碱基突变的检测，扩大了CRISPR/Cas9系统的检测和应用范围，并提供了可行性 的理论基础。 附图说明 图1为本发明检测系统对ssRNA/ssDNA检测原理图。 图2为本发明检测系统对ssDNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssDNA的紫外可见 光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。 图3为本发明检测系统对ssDNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特 5 CN 111575352 A 说 明 书 4/8 页 异性切割ssDNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssDNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不 同单碱基突变ssDNA的紫外可见光光谱响应图。 图4为本发明检测系统对ssRNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssRNA的紫外可见 光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。 图5为本发明检测系统对ssRNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特 异性切割ssRNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssRNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不 同单碱基突变ssRNA的紫外可见光光谱响应图。
