技术摘要：
本公开涉及用于将寨卡病毒灭活的方法，所述寨卡病毒可用于疫苗和免疫原性组合物中。本公开还涉及一种用于确定虫媒病毒制剂的灭活完全性的方法和一种用于确定包含灭活病毒的药物组合物中的残余甲醛含量的方法。
背景技术：
寨卡病毒係黄病毒科(Flaviviridae)内与其它蚊媒病毒(例如黄热病病毒、登革 热病毒(dengue)、西尼罗河病毒(West  Nile)和日本脑炎病毒)一起分类的黄病毒 (flavivirus)，自从这种病毒在2013年被引入巴西以来，它迅速传播，成为一种半球流行 病。这种病毒已经到达了中美洲和北美洲，包括美国领土，因此现在正威胁着美国大陆。实 际上，从来自一个曾在2015年到过波多黎各(Puerto  Rico)旅行的人的血清中分离出寨卡 病毒株PRVABC59。已经对这种病毒株的基因组测序至少三次(参见Lanciotti等人 Emerg.Infect.Dis.2016年5月；22(5):933-5和GenBank登录号KU501215.1；GenBank登录号 KX087101 .3；以及Yun等人Genome  Announc .2016年8月18日；4(4)和GenBank登录号 ANK57897.1)。 这种病毒最初是在1947年在乌干达(Uganda)分离，1952年首次与人类疾病相关 联，并且在非洲和东南亚已经零星地被公认为是轻度自限性发热性疾病的病因(Weaver等 人(2016)Antiviral  Res.130:69-80；Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。然 而，2007年，在北太平洋雅浦岛(the  North  Pacific  island  of  Yap)出现一次爆发，然后 跨越太平洋在岛屿之间传播，引起了2013-2014年法属玻利尼西亚(French  Polynesia)的 大范围爆发，然后传播至新喀里多尼亚(New  Caledonia)、库克群岛(Cook  Islands)，最终 传播至复活节岛(Easter  Island)。随后亚洲谱系病毒通过尚不确定的途径转移至西半球 (Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。病毒在动物学上可通过埃及伊蚊(Aedes  aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)以及可能通过赫斯里伊蚊(A.hensilli)和波利尼西亚 伊蚊(A.polynieseinsis)传播(Weaver等人(2016)Antiviral  Res.130:69-80)。另外，认为 可能存在其它的病毒传播载体，并且病毒可通过输血、经胎盘和/或通过性传播来传播。 2015年底，在广泛的寨卡病毒感染区域，胎儿异常(例如小头畸形)和吉兰-巴雷综 6 CN 111601885 A 说　明　书 2/68 页 合征(Guillain-Barre  syndrome，GBS)显著增加，警示寨卡病毒可能比最初想得更加致命， 这促使世界卫生组织(the  World  Health  Organization，WHO)宣布其为国际关注的突发公 共卫生事件(Public  Health  Emergency  of  International  Concern，PHEIC)(Heymann等 人(2016)Lancet  387(10020):719-21)。虽然寨卡病毒对公共卫生造成相当大的威胁，但是 当前没有获得FDA批准的疫苗或治疗，并且用于控制寨卡病毒的唯一预防措施涉及对蚊子 群体进行管理。 近来为了努力表征重组寨卡病毒以研发出潜在疫苗，鉴定出一种非人类细胞适应 的寨卡病毒，它在病毒包膜蛋白中位置330处具有突变(Weger-Luca relli等人 2017.Journal  of  Virology)。该研究的作者发现寨卡病毒株PRVABC59的全长感染性cDNA 克隆当在克隆期间扩增时在遗传上不稳定，并且选择使病毒基因组分裂以阐明所观察到的 不稳定性，研发并应用双质粒系统。然而，用于研发寨卡疫苗的双质粒系统不太合乎需要。
技术实现要素：
因此，需要研发出利用遗传稳定的寨卡病毒治疗和/或预防寨卡病毒感染的疫苗 和免疫原性组合物。疫苗研发的一个选择是将全病毒灭活并使用该灭活的全病毒对受试者 接种疫苗。然而，在研发灭活病毒疫苗的过程中，关键的安全保证是确信药品或原料药中没 有感染性病毒。研发出一种有效的灭活工艺和灵敏的分析法来测量和确定感染性病毒体是 否仍然存在对于研发来源于任何野生型病毒但无疑具有可能引起胎儿异常的致病性/脑炎 病毒的纯化的灭活病毒来说是一个关键的安全方面。此外，已知可用于将病毒灭活的甲醛 是基因毒性和致癌的，因此监测原料药和药品中的残余甲醛水平是重要的，并且管理当局 要求使用甲醛作为灭活剂的制造商测定药品中的残余甲醛含量。因此，需要一种灵敏的方 法，用于检测含有例如灭活寨卡病毒的灭活病毒的药品或药物组合物中的残余甲醛。 本公开至少部分地基于以下令人以外的发现：在室温下将低浓度甲醛相对短暂地 施加于病毒，可有效地将寨卡病毒灭活。另外，研发出一种测定法，所述测定法允许高灵敏 度地确定感染性病毒体在灭活后是否仍然存在。最终，研发出一种方法，其允许检测最终药 品或药物组合物中低水平的残余甲醛。 因此，本公开的某些方面涉及一种用于将寨卡病毒制剂灭活的方法，所述方法包 括： (a)从一个或多个体外培养的细胞分离所述寨卡病毒制剂，其中所述细胞用于产 生所述寨卡病毒制剂，其中分离所述寨卡病毒制剂包括一个或多个选自以下的步骤： (i)深度过滤， (ii)缓冲液更换和/或稀释； (iii)离子交换色谱法；以及 (b)将所述寨卡病毒制剂用甲醛处理，其中如以％(w/v)测量的甲醛浓度与以天测 量的在甲醛下的孵育时间相乘的数值结果为0.025至0.5。 在一些实施方案中，细胞为非人类细胞或Vero细胞。 在一些实施方案中，寨卡病毒制剂是从含有寨卡病毒的异质群体的接种物获得。 在一些实施方案中，寨卡病毒制剂是从临床分离株获得。 在一些实施方案中，寨卡病毒制剂是从寨卡病毒克隆分离株获得。寨卡病毒克隆 7 CN 111601885 A 说　明　书 3/68 页 分离株可通过蚀斑纯化获得。在蚀斑纯化前可将多个细胞用含有寨卡病毒的异质群体的接 种物接种。 本公开的一些方面涉及一种用于将寨卡病毒制剂灭活的方法，所述方法包括： (a)从临床分离株获得寨卡病毒制剂；以及 (b)将所述寨卡病毒制剂用甲醛处理，其中如以％(w/v)测量的甲醛浓度与以天测 量的在甲醛下的孵育时间相乘的数值结果为0.025至0.5。 本公开的一些方面涉及一种用于将寨卡病毒制剂灭活的方法，所述方法包括： (a)从含有寨卡病毒的异质群体的接种物获得寨卡病毒制剂；以及 (b)将所述寨卡病毒制剂用甲醛处理，其中如以％(w/v)测量的甲醛浓度与以天测 量的在甲醛下的孵育时间相乘的数值结果为0.025至0.5。 在一些实施方案中，将所述寨卡病毒制剂用0.005％(w/v)至0.02％(w/v)浓度的 甲醛处理。 在一些实施方案中，将寨卡病毒制剂处理八至十二天或十天。 在一些实施方案中，在15℃至30℃或22℃的温度下处理寨卡病毒制剂。 所述方法还可包括步骤(c)：确定灭活完全性。 在一些实施方案中，步骤(c)包括： (i)将培养的昆虫细胞用根据步骤(b)处理的寨卡病毒制剂接种并将所述昆虫细 胞孵育第一段时间，由此产生昆虫细胞上清液； (ii)将培养的哺乳动物细胞用(i)中产生的昆虫细胞上清液接种并将所述哺乳动 物细胞孵育第二段时间；以及 (iii)确定所述寨卡病毒制剂是否含有对所述哺乳动物细胞产生致细胞病变作用 的残余复制病毒。 在一些实施方案中，昆虫细胞选自CCL-125细胞、Aag-2细胞、RML-12细胞、C6/36细 胞、C7-10细胞、AP-61细胞、A.t.GRIP-1细胞、A.t.GRIP-2细胞、A.t.GRIP-3细胞、UM-AVE1细 胞、Mos.55细胞、Sua1B细胞、4a-3B细胞、Mos.42细胞、MSQ43细胞、LSB-AA695BB细胞、NIID- CTR细胞和TRA-171细胞，例如C6/36细胞。 在一些实施方案中，第一段时间为3至7天。 在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自VERO细胞、LLC-MK2细胞、MDBK细胞、MDCK细 胞、ATCC  CCL34  MDCK(NBL2)细胞、MDCK  33016(如WO97/37001中所述的保藏号DSM  ACC  2219)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，例如VERO细胞。 在一些实施方案中，第二段时间为3至14天。 所述方法还可包括步骤(d)：将经过甲醛处理的寨卡病毒制剂用焦亚硫酸钠中和， 例如在甲醛处理后至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天时将经过甲醛处理 的寨卡病毒制剂中和。 所述方法还可包括步骤(e)：制备包含灭活寨卡病毒制剂的药物组合物。 在一些实施方案中，将寨卡病毒制剂与佐剂混合。佐剂可选自由以下组成的组：铝 盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷脂酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA 衍生物、细胞因子、皂角苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌的脂多 糖(LPS)、聚磷腈、乳液、病毒颗粒、脂质卷(cochleate)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、 8 CN 111601885 A 说　明　书 4/68 页 泊洛沙姆颗粒(poloxamer  particle)、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(Complete  Freund’s  Adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。 在一些实施方案中，佐剂为铝盐，例如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾或Alhydrogel  85。 在一些实施方案中，寨卡病毒制剂中的一种或多种抗原的至少75％、至少85％、至 少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％吸附至佐剂。 在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ  ID  NO:1的位置98处或在与SEQ  ID  NO:1的位 置98相对应的位置处包含突变，例如SEQ  ID  NO:1中的Trp98Gly突变。 在一些实施方案中，寨卡病毒在包膜蛋白(E)中不包含突变。在一些实施方案中， 编码包膜蛋白的序列与SEQ  ID  NO:2中的对应序列相同。 本公开的一些方面还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含能通过任一种本 文所述的方法获得的灭活寨卡病毒。 本公开的一些方面还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含灭活寨卡病毒并 且具有小于50μg/ml的残余甲醛含量。在一些实施方案中，药物组合物能通过权利要求1至 28中任一项的方法获得。 本公开的一些方面还涉及一种用于确定虫媒病毒制剂的灭活完全性的方法，所述 方法包括以下步骤： (i)将培养的昆虫细胞用经历了灭活步骤的虫媒病毒制剂接种并将昆虫细胞孵育 第一段时间，由此产生昆虫细胞上清液； (ii)将培养的哺乳动物细胞用(i)中产生的昆虫细胞上清液接种并将哺乳动物细 胞孵育第二段时间；以及 (iii)确定所述虫媒病毒制剂是否含有对所述哺乳动物细胞产生致细胞病变作用 的残余复制病毒。 在一些实施方案中，虫媒病毒为黄病毒或甲病毒。在一些实施方案中，虫媒病毒为 寨卡病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒(Japanese  Encephalitis  virus)、蜱 传脑炎病毒、登革热病毒(dengue  virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis  Encephalitis  virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya  virus)、阿尼昂尼昂病毒(O'nyong'nyong  virus)或 马雅罗病毒(Mayarovirus)。 在一些实施方案中，使所述虫媒病毒制剂经历洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙 内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基亚乙基亚胺、亚甲基蓝或补骨脂素处理。 在一些实施方案中，昆虫细胞选自CCL-125细胞、Aag-2细胞、RML-12细胞、C6/36细 胞、C7-10细胞、AP-61细胞、A.t.GRIP-1细胞、A.t.GRIP-2细胞、A.t.GRIP-3细胞、UM-AVE1细 胞、Mos.55细胞、Sua1B细胞、4a-3B细胞、Mos.42细胞、MSQ43细胞、LSB-AA695BB细胞、NIID- CTR细胞和TRA-171细胞，例如C6/36细胞。 在一些实施方案中，第一段时间为3至7天。 在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自VERO细胞、LLC-MK2细胞、MDBK细胞、MDCK细 胞、ATCC  CCL34  MDCK(NBL2)细胞、MDCK  33016(如WO97/37001中所述的保藏号DSM  ACC  2219)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，例如VERO细胞。 在一些实施方案中，第二段时间为3至14天。 9 CN 111601885 A 说　明　书 5/68 页 在一些实施方案中，所述方法能够检测小于1.0TCID50的虫媒病毒。 本公开的一些方面还涉及一种用于确定包含灭活病毒的药物组合物中的残余甲 醛含量的方法，所述方法包括以下步骤： (a)提供包含已经用甲醛处理过的病毒的药物组合物； (b)将(a)的组合物与磷酸和2,4-二硝基苯肼(DNPH)混合，由此提供混合物； (c)将(b)的混合物在适合条件下孵育；以及 (d)分析混合物中残余甲醛的存在。 在一些实施方案中，(a)的组合物含有佐剂，佐剂可为氢氧化铝。在一些实施方案 中，(a)的组合物含有0.1mg/ml至1.0mg/ml氢氧化铝作为佐剂。 在一些实施方案中，步骤(b)包括将50份的(a)的组合物与1份的15至25％(v/v)磷 酸和2.5份的0.9至1.1mg/ml  DNPH混合。 在一些实施方案中，将(a)的组合物与磷酸和2,4-二硝基苯肼(DNPH)的混合物在 室温下孵育。在一些实施方案中，将(a)的组合物与磷酸和2,4-二硝基苯肼(DNPH)的混合物 孵育10至30分钟。 在一些实施方案中，通过HPLC分析(a)的组合物与磷酸和2,4-二硝基苯肼(DNPH) 的混合物，所述HPLC可为反相HPLC。在一些实施方案中，将水与乙腈(1:1，v/v)的混合物用 作HPLC中的流动相。 在一些实施方案中，病毒为灭活寨卡病毒。在一些实施方案中，已经将灭活寨卡病 毒在22℃下用0.01％(w/v)甲醛处理了10天。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ  ID  NO:1 的位置98处或在与SEQ  ID  NO:1的位置98相对应的位置处包含突变，例如SEQ  ID  NO:1中的 Trp98Gly突变。 附图说明 图1展示了模拟感染(顶部)或感染ZIKAV病毒株PRVABC59(底部)的Vero细胞单层 的明视场显微图像。 图2展示了如通过TCID50所确定的ZIKAV  PRVABC59  P1在Vero细胞单层上的生长动 力学。 图3展示了寨卡病毒PRVABC59  P5克隆a-f的效力测定测试(TCID50)。 图4展示了描绘寨卡病毒PRVABC59  P6克隆a-f在Vero细胞单层上的生长的致细胞 病变作用(CPE)的明视场显微图像。 图5展示了寨卡病毒PRVABC59  P6克隆a-f的效力测定测试(TCID50)。 图6展示了一种氨基酸序列比对，其比较来自寨卡病毒株PRVABC59  P6e(SEQ  ID  NO:8)和PRVABC59(SEQ  ID  NO:9)的靠近残基330的寨卡病毒包膜糖蛋白序列与若干其它黄 病毒(WNV(SEQ  ID  NO:10)；JEV(SEQ  ID  NO:11)；SLEV(SEQ  ID  NO:12)；YFV(SEQ  ID  NO: 13)；DENV  1  16007(SEQ  ID  NO:14)；DENV  2  16681(SEQ  ID  NO:15)；DENV  3  16562(SEQ  IDNO:16)；以及DENV  4  1036(SEQ  ID  NO:17))。 图7展示了一种氨基酸序列比对，其比较来自寨卡病毒株PRVABC59  P6e(SEQ  ID  NO:18)和PRVABC59(SEQ  ID  NO:19)的靠近残基98的寨卡病毒NS1蛋白序列与若干其它黄病 毒(WNV(SEQ  ID  NO:20)；JEV(SEQ  ID  NO:21)；SLEV(SEQ  ID  NO:22)；YFV(SEQ  ID  NO:23)； 10 CN 111601885 A 说　明　书 6/68 页 DENV  1  16007(SEQ  ID  NO:24)；DENV  2  16681(SEQ  ID  NO:25)；DENV  3  16562(SEQ  IDNO: 26)；以及DENV  4  1036(SEQ  ID  NO:27))。 图8展示了与ZIKAV  PRVABC59  P1病毒相比ZIKAV  PRVABC59  P6病毒克隆a-f的蚀 斑表型。 图9展示了与ZIKAV  PRVABC59  P1病毒相比ZIKAV  PRVABC59  P6病毒克隆的平均斑 点尺寸。 图10展示了在无血清生长条件下ZIKAV  PRVABC59  P6克隆a-f在Vero细胞中的生 长动力学。 图11展示了制备用于免疫接种实验的PRVABC59  P6b和P6e配制药品所采取的步骤 的示意图。 图12A展示了向CD-1小鼠给予来源于ZIKAV  PRVABC59  P6b和P6e克隆的疫苗制剂 的时间表。PBS用作安慰剂。 图12B展示了如图12A中所述使用来源于ZIKAV  PRVABC59P6b和P6e克隆的疫苗制 剂进行免疫接种的CD-1小鼠的血清ZIKAV中和抗体效价。ZIKAV中和抗体效价通过报告病毒 颗粒(RVP)中和测定来测定ZIKAV中和抗体效价。实线表示一组的几何平均值。检测限 (1.93log10)由虚线表示。 图13A展示了向AG129小鼠给予来源于ZIKAV  PRVABC59  P6b和P6e克隆的疫苗制剂 的时间表。PBS用作安慰剂。 图13B展示了如图13A中所述使用来源于ZIKAV  PRVABC59P6b和P6e克隆的疫苗制 剂进行免疫接种的AG129小鼠的血清ZIKAV中和抗体效价。实线表示一组的几何平均值。检 测限(1.30log10)由虚线表示。分配没有可检测效价(<1.30)的动物0.5的效价。 图14展示了攻击后AG129测试组的平均重量，其表示为起始重量的百分比。误差线 表示标准偏差。 图15展示了在攻击后的两天个别AG129小鼠的血清病毒血症，以PFU/mL报告。实线 表示一组的平均值。检测限(2.0log10)由虚线表示。 图16展示了攻击后AG129测试组的存活率分析。 图17展示了在来自接种疫苗的和受到攻击的AG129小鼠的汇集血清被动转移后的 攻击前血清循环ZIKAV中和抗体(Nab)效价。 图18展示了经过寨卡病毒攻击的被动转移小鼠和对照小鼠的平均体重。 图19展示了在攻击后的三天个别AG129小鼠的血清病毒血症，以PFU/mL报告。 图20展示了经过寨卡病毒攻击的被动转移小鼠和对照小鼠的存活率分析。 图21展示了ZIKAV中和抗体效价与在被动转移小鼠中观察到的病毒血症之间的相 关性。 图22展示了在感染P6a和P6e寨卡病毒前MVS原液后使用卡普兰梅耶存活曲线 (Kaplan  Meier  survival  curve)对AG129小鼠的存活率分析。 图23展示了在发明时在感染P6a和P6e寨卡病毒前MVS原液后的平均体重，以起始 重量的百分比表示。虚线表示供参考的起始重量的100％。 图24展示了在感染P6a和P6e寨卡病毒前MVS原液后的三天个别AG129小鼠的血清 病毒血症，以PFU/mL报告。虚线表示测定的检测限。 11 CN 111601885 A 说　明　书 7/68 页 图25展示了编辑的灭活动力学数据。数据比较感染效力(TCID50)与RNA拷贝，以及 四个毒物学批次样品的灭活完全性(COI)。这些数据表明COI测定的灵敏度超过TCID50。 图26展示了如0.31TCID50的输入病毒效价所证明的测定中C6/36和Vero灵敏度的 比较。 图27展示了使用C6/36细胞的CPE对比log  TCID50的对数回归分析，位点包括在 0.01TCID50/孔(-2log  TCID50/孔)的目标值周围的99％置信区间；模型预测0.85％的孔将 为阳性。 图28展示了PBS(a)和含有0.049μg/mL(b)、0.098μg/mL(c)、0.196μg/mL(d)、0.491 μg/mL(e)、0.982μg/mL(f)和1.964μg/mL(g)甲醛的PBS溶液的色谱图。