技术摘要：
本发明属于临床生物样本检测技术领域，具体涉及血浆中神经酰胺检测技术，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及高通量液相色谱串联质谱法检测四种神经酰胺(Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0)的方法。
背景技术：
神经酰胺又称神经鞘脂类，是存在于皮肤的一种脂类，在表皮角质层形成过程中 发挥着重要作用。是(神经)鞘脂类共有的结构单位。血浆神经酰胺(Ceramides,Ceram)在细 胞膜完整性、细胞应激反应、炎性信号转导和细胞凋亡中发挥年重要作用，与动脉粥样硬化 斑块形成，缺血性心脏病、心肌梗死、高血压、中风等均有一定的相关性。 本发明检测的4种神经酰胺物质，包括Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0，与冠状动脉疾病(CAD)患者的心血管死亡显著相关。目前已 报道的Cer d18:1/16:0、 Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1，及其与Cer d18:1/24:0的比 值和CAD的发生相关密切。血浆Ceram 升高的患者，即使在年龄、性别、吸烟状况和血清生物 标志物：如低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、C-反应蛋白(CRP)和脂蛋白相 关的磷脂酶A2(LPPLA2)正常的情况下，也存在很高的心血管事件风险。另外有研究报道，患 者通过现有的临床治疗(包括他汀类药物，依折麦布和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9) 抑制剂)，血浆中的Ceram浓度明显降低。定量神经酰胺需要一种有选择性、灵敏的分析方 法。为此，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及一种高通量液相色 谱串联质谱法检测4种神经酰胺的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供公开了一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及一 种高通量液相色谱串联质谱法检测4种神经酰胺的方法。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (一)、标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制: 精确称取Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0标 准品，用异丙醇分别溶解制备为500μg/mL的四种神经酰胺的标准储备液；用各标准储备液 稀释为一定浓度范围的标准工作液，即5-1000ng/mL Cer d18:1/16:0、5-1000ng/mL Cer d18:1/18:0、50-10000ng/mL Cer d18:1/24:1、50-10000ng/mL Cer d18:1/24:0； (b)、标准内标液的配制： 精确称取Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0同位素内标标准品，用异丙醇溶解制备为四种浓度为100μg/mL的标准储备 液。各标准储备液进一步用异丙醇稀释为一定浓度的上述四种神经酰胺标准内标液，即 100ng/mL Cer d18:1-d7/16:0、20ng/mL Cer d18:1-d7/18:0、1500ng/mL Cer d18:1-d7/ 24:1、500ng/mL Cer d18:1-d7/24:0； 4 CN 111595993 A 说 明 书 2/6 页 (c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程： 用移液枪分别移取至少三种不同浓度的标准工作液10μL，将上述至少三种不同浓 度的标准工作液分别与20μL标准内标液和570μL异丙醇混合，并置于1.5mL离心管中，在500 ～15000rpm 的转速下离心1～20min，吸取离心后的上清液，供LC-MS/MS检测，分别得出上 述至少三种标准溶液中的Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/ 24:0的色谱图及其对应的标准内标液中Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0的色谱图，以上述至少三个标准溶液的Cer d18:1/16: 0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0的峰面积和对应的标准内标液中的 Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0 的峰 面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1，y2，y3，y4，y5和y6，以上述标准工作液中含有Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0的浓度与对应的标准内标 液中的Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0 的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1，x2，x3，x4，x5和x6，将以上检测所得至少数据分别 进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1 b，y2＝c*x2 d，y3＝e*x3 f，y4＝g*x4 h，y5＝i*x5 j和y6＝k*x6 m，并且得到权重系数a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和m； (二)检测血液的离心 取待检血液至少2mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，得到上清液血浆，置于- 80℃备用； (三)待测样品处理 (d)用移液枪移取步骤(b)的标准内标液20μL于1 .5mL离心管中，然后加入步骤 (二)的 10uL的血浆于上述离心管中，加入100～1000uL异丙醇，涡旋混匀3min，在500～ 15000rpm的转速下离心1～20min，吸取离心后的上清液，供LC-MSMS检测。 (四)待测样品的检测 取步骤(d)待测样品，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品 进行检测，得出上述待测样品中Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0的色谱图及其对应的标准内标液中Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、 Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0的色谱图，将上述色谱图中的Cer d18:1/16:0、 Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0的峰面积和对应的标准内标液中的同 位素的峰面积之比y1，y2，y3，y4，y5和y6，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1 b，y2 ＝c*x2 d，y3＝e*x3 f，y4＝g*x4 h，y5＝i*x5 j和y6＝k*x6 m中，通过计算得到待检测样 品中的Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24:0的浓度与对应 的标准内标液中的Cer d18:1-d7/16:0、Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0 的浓度之比x1，x2，x3，x4，x5和x6，标准内标液中的Cer d18:1-d7/16:0、 Cer d18:1-d7/18:0、Cer d18:1-d7/24:1、Cer d18:1-d7/24:0的浓度是已知的，通过计算 得到待检测血液中的Cer d18:1/16:0、 Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:1、Cer d18:1/24: 0的浓度。 本发明的一种血浆中神经酰胺含量的分析方法，其中：在步骤(c)中使用4种不同 浓度的标准工作液，6种不同浓度的标准工作液分别是： ng/ml STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 5 CN 111595993 A 说 明 书 3/6 页 Cer d18:1/16:0 5 10 50 100 500 1000 Cer d18:1/18:0 5 10 50 100 500 1000 Cer d18:1/24:1 50 100 500 1000 5000 10000 Cer d18:1/24:0 50 100 500 1000 5000 10000 本发明的一种血浆中神经酰胺含量的分析方法，其中：在步骤(c)和步骤(d)中，所 述异丙醇的体积是570μL；所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵的水溶液和50％的乙腈异丙 醇溶液，所述洗脱液是由2：2：98的甲酸，水和乙腈组成。 本发明的一种血浆中神经酰胺含量的分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四 级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为BEH C18柱，柱温为55℃，进样量为2μL； 本发明的一种血浆中神经酰胺的分析方法，其中：所述分析色谱柱的流动含有 0.1％甲酸水溶液和含有0.1％甲酸乙腈异丙醇(7：3)溶液，流速为0.4mL/min，分析色谱柱 采用梯度洗脱方式； 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果： 本发明所述的检测血浆中神经酰胺含量的分析方法，血浆样本经蛋白沉淀前处理 后直接进样，效率得到很大提高，检测过程更简便快速；另外，可以同时检测4个化合物，在 临床治疗中，为 CAD患者诊断提供辅助检测和风险评估。 附图说明 图1为本发明实施例的Cer d18:1/16:0及其内标同位素的色谱图； 图2为本发明实施例的Cer d18:1/18:0及其内标同位素的色谱图； 图3为本发明实施例的Cer d18:1/24:1及其内标同位素的色谱图； 图4为本发明实施例的Cer d18:1/24:0及其内标同位素的色谱图。
