技术摘要：
本发明公开了一种提高烟草红花大金元遗传转化效率的培养基和方法，所述培养基包括共培养基、选择培养基，共培养基、选择培养基均包括MS基本培养基、NAA、6‑BA，所述NAA的终浓度为0.41mg/L，所述NAA与6‑BA的浓度比为1:5；所述方法包括如下步骤：烟草红花大金元叶盘的  全部
背景技术：
栽培烟草（Nicotiana  tabacum）是异源四倍体，属于茄科，由于其容易遗传转化， 被认为是一种重要的模式生物，用于验证其它植物的基因功能。与模式植物拟兰芥相比，烟 草基因的功能研究还存在很大的差距。近年来，CRISPR/Cas9技术的出现，为烟草基因功能 的研究提供了有效的工具。为了快速获得更多的烟草突变体，可以采用基于CRISPR/Cas9的 敲除质粒库进行混转，加快烟草基因功能研究的步伐。 红花大金元原名路美邑烟，1962年云南省路南县路美邑村烟农从大金元变异株中 选出，因花色深红而得名，是云南烟区的主要栽培品种之一。红花大金元具有抗逆性强，高 产稳产等特性，现是烟草的主要栽培品种。尽管目前植物转基因技术比较成熟，但是烟草红 花大金元的转化效率普遍不高，出芽率，生根率都较低。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种提高烟草红花大金元遗传转 化效率的培养基和方法，烟草愈伤组织出芽率（分化芽/叶盘）达到127%，生根率（生根苗/分 化芽）达到66%，比原有方法（出芽率是62%，生根率是10%）的出芽率提高了约2倍，生根率提 高了约6倍，满足规模化遗传转化的需求。 本发明提高烟草红花大金元遗传转化效率的培养基，包括共培养基、选择培养基， 共培养基、选择培养基均包括MS基本培养基、NAA、6-BA，所述NAA的终浓度为0.41mg/L，所述 NAA与6-BA的浓度比为1:5； 所述共培养基还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L； 所述选择培养基还包括蔗糖30g/L、琼脂8g/L、卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素250mg/L。 本发明另一目的是提供一种提高烟草红花大金元遗传转化效率的方法，步骤如 下： （1）烟草红花大金元叶盘的制备：将烟草红花大金元无菌苗的叶片在无菌条件下获得 叶盘，并将叶盘浸泡在MS培养基中，所述MS培养基为MS基本培养基、蔗糖30g/L，pH=5.75； （2）农杆菌的侵染：将带有敲除载体或过表达载体的农杆菌单菌落进行培养，离心收集 菌体，菌体用MS培养基重悬后，浸泡叶盘，并置于共培养基中黑暗培养；共培养基包括MS基 本培养基、NAA、6-BA、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH=5.75，其中NAA终浓度为0.41mg/L，所述NAA 与6-BA的浓度比为1:5； （3）选择培养：将步骤（2）中共培养后得到的叶盘直接转移到选择培养基中培养直至长 出绿芽，所述选择培养基包括MS基本培养基、NAA、6-BA、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、卡那霉素 50mg/L、羧苄青霉素250mg/L；其中NAA终浓度为0.41mg/L，所述NAA与6-BA的浓度比为1:5； 3 CN 111548983 A 说　明　书 2/4 页 （4）生根培养：将步骤（3）的绿芽沿绿芽的茎部切下后放入生根培养基中培养，所述生 根培养基包括MS基本培养基、蔗糖30g/L、卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素25mg/L、琼脂8g/L， pH=5.75。 所述步骤（1）中，利用打孔器获得长、宽均为4～6mm大小的叶盘。 所述步骤（2）中农杆菌菌种是LBA4404。 所述步骤（2）中单菌落培养是在27～29℃、150～250rpm下过夜培养，将其培养至 OD600=0.5～1，再离心收集菌体，用MS培养基将菌体的OD600控制在0.5～1，浸泡叶盘。 所述步骤（2）中浸泡叶盘后用灭菌后的滤纸吸干叶盘上的菌液，置于共培养基中 27～29℃下黑暗培养2～4天。 所述步骤（3）选择培养基中培养条件为在28℃下光照培养16h，25℃条件下黑暗培 养8h；每隔8～12天更换一次培养基。 所述步骤（4）中生根培养时间为5～10天。 本发明所用的MS基本培养基可为商用粉末也可为自配溶液；优选为自配溶液（具 体配方见