技术摘要：
本发明提供一种基于CD90posi细胞检测肿瘤的试剂盒，包括：通过对肝癌细胞中CD90posi亚群总RNA构建CircRNA文库，进行CircRNA的高通量测序或分离肝癌患者肿瘤组织CD90posi细胞总RNA，进行CircRNA高通量测序。根据测序情况，对结果进行生物信息学分析，采集差异表达的分子  全部
背景技术：
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率较高，每年约有60 万以上的患者死于肝癌，病死率位居国内肿瘤第二位，严重威胁人民群众的生命健康。肝癌 起病隐匿，临床表现缺乏特别性，患者就医时往往处于肝癌中晚期，肝癌早期患者难以发 现，严重影响肝癌的治疗效果。目前肝癌的临床检测手段主要通过检测患者血清甲胎蛋白 (AFP)并结合影像学检查进行确诊，可分为以下几类：B超检查，B超受肠气及周围脏器的影 响，分辨率较低；虽可在B超引导下进行肝脏占位病灶穿刺活检，但肝穿刺的病理诊断存在 一定假阴性率；同时肝脏穿刺存在肝创面出血、肿瘤随针道转移等严重并发症，限制了其临 床应用。CT与磁共振成像：CT或MR仅能分辨直径1.0cm以上的病灶，且仍有一定的假阳性率 与假阴性率。DSA技术：虽可提高肝癌检测的准确率，但DSA为一种侵入性创伤性检查，多用 于肝癌治疗，检测范围和实用性受到极大限制。 随着分子生物学技术进步，人类对疾病的认识从宏观到微观，从环境到基因，从遗 传到表观遗传，逐步深入。越来越多的学者认为，肿瘤的发生是多因素协同作用的结果。以 表观遗传为例，基因5’端启动子区DNA甲基化能影响启动子活性，而miRNA则从3’UTR区发挥 调控功能，二者既能协同作用，也能相互制约，研究发现，约10％的miRNA表达受到DNA甲基 化的影响；而circRNA可作为miRNA海绵或缓冲剂，通过吸附或释放miRNA来影响靶基因表 达。 通过对肝细胞癌微环境细胞群的分析，筛选出CD90posi肿瘤细胞，发现CD90posi 细胞促进肝癌细胞的增殖、迁移。同时，CD90posi细胞表现出很强的增殖潜力和细胞干性。 将CD90posi肝癌细胞和肿瘤细胞系中其他侧群细胞按不同比例混合，并注射于裸鼠皮下， 发现随着CD90posi细胞所占比例增加，移植的肿瘤体积和重量越大，表明CD90posi细胞是 肝细胞癌增殖和生长的关键因素。 进一步，在CD90posi细胞中发现GLI1/3转录因子的高表达，并通过分子表达干预、 分子抑制剂使用等实验手段，在培养的肝癌细胞和移植的裸鼠皮下干细胞癌中证明了 GLI1/3促进CD90posi细胞的分化，并激活IL-6/STAT3信号通路，促进肿瘤细胞的增殖。并 且，在大多数原发性肝癌患者中检测CD90的表达，并在随访研究中证明CD90高表达的肝癌 患者预后较差。这与TCGA肝癌大数据的统计结果一致。 在肝癌细胞系Huh7和97L中分离出CD90posi肿瘤细胞，并对细胞进行CircRNA-Seq 的工作，利用生物信息学的分析方法，筛选出差异表达的CircRNA分子，并根据序列相关性 的原则分析了CircRNA母本基因的GO功能通路富集情况。结果显示，CircRNA在CD90posi肝 癌细胞中的存在较显著的差异表达，这些差异表达的基因参与了肿瘤细胞的能量代谢、信 号转导、蛋白泛素化降解和基因表达调控等重要过程，CircRNA或许可以作为原发性肝癌检 3 CN 111549138 A 说　明　书 2/3 页 测和筛查的分子指标。一方面CircRNA的变化反应了细胞代谢和信号转导的异常；另一方 面，CircRNA可以表征CD90在肿瘤组织中的表达水平。 本发明立足于肝癌肿瘤微环境中异质细胞的基因差异表达，CD90posi细胞是促进 肿瘤增殖和迁移的重要肿瘤细胞亚群，进而分析CD90posi关联的差异CircRNA的表达，从而 将细胞水平的差异转变为细胞相关的核酸分子的表达变化。有助于阐明CircRNA在肝癌中 的重要功能，对肝癌筛查新标志物的寻找，肝癌的早期筛查有重要临床意义，同时能够对肿 瘤检测手段的革新，新兴的液体活检技术的探索提供理论和数据支持，随着对CircRNA在肝 癌中研究的深入，也为肿瘤治疗提供新的思路。
技术实现要素：
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