技术摘要：
本发明公开了工程化以减少或消除NR4A、TOX、NR4A TOX的表达和/或功能的免疫细胞，或工程化以减少或消除NR4A TOX的表达和/或功能并增加IL‑21表达的免疫细胞。本发明还提供了工程化以抑制NFAT/AP‑1通路的表达和/或功能的细胞。本发明公开的细胞是T细胞和NK细胞。可将其  全部
背景技术：
用于癌症的过继细胞疗法是输注T细胞用于识别和消除肿瘤细胞的日益普遍的策 略。表达靶向人类CD19(huCD19)抗原的嵌合抗原受体(CAR  T)的T细胞1 ,2已经对B细胞白血 病和淋巴瘤3 ,4展现出令人印象深刻的临床疗效。然而，CAR  T细胞对实体肿瘤的效果较 差5,6，部分原因是它们进入低反应性7(“耗竭”8-11或“功能失调”12,13)状态，该状态由慢性抗 原刺激触发，且其特征在于几种抑制性受体的上调和效应子功能的丧失14,15。因此，本领域 中需要提供靶向低反应性肿瘤的免疫疗法。本发明提供了满足该未被满足的需求的组合物 和方法。 发明概述 本发明提供被工程化以在细胞中减少或消除NR4A转录因子的表达和/或功能的细 胞。本发明还提供被工程化以在细胞中减少或消除TOX转录因子的表达和/或功能的细胞。 在一方面，本发明还提供被工程化以在细胞中减少或消除NR4A和TOX转录因子的表达和/或 功能的细胞。在另一方面，将细胞工程化以在细胞中减少或消除NR4A和TOX转录因子的表达 和/或功能，并增加IL-21的表达。在另一方面，本发明提供了被工程化以在细胞中抑制 NFAT/AP-1通路的表达和/或功能的细胞。在一方面，对于所公开的细胞，该细胞是免疫细 胞，例如T细胞和NK细胞。 该细胞可以被扩增以产生同源或异源细胞群体和/或与载体(例如药学上可接受 的载体)组合的同源或异源细胞群体。 本发明还提供诱导免疫应答和治疗需要选择性免疫疗法的病症的方法，该方法包 含使靶细胞与本文所述的细胞或组合物接触，或基本上由该步骤组成，或由该步骤组成。该 接触可以在体外或在体内进行，从而向例如人类患者的对象提供免疫疗法。 本发明还提供生产工程化细胞的方法，该方法包含在细胞中减少或消除NR4A转录 因子的表达和/或功能，或由基本上该步骤组成，或由该步骤组成。 本发明还提供了生产工程化细胞的方法，该方法包含在细胞中减少或消除TOX转 录因子的表达和/或功能。在另一方面，生产工程化细胞的方法，该方法包含在细胞中减少 7 CN 111601882 A 说　明　书 2/77 页 或消除NR4A转录因子和TOX转录因子的表达和/或功能，或基本上由该步骤组成，或由该步 骤组成。在另一方面，本发明还提供生产工程化细胞的方法，所述方法包含在细胞中减少或 消除NR4A转录因子和TOX转录因子的表达和/或功能并且增加IL-21的表达，或基本上由该 步骤组成，或由该步骤组成。在另一方面，本发明提供生产工程化细胞的方法，该方法包含 在细胞中抑制细胞中NFAT/AP-1通路的表达和/或功能，或基本上由该步骤组成，或由该步 骤组成。 在一方面，对于发明公开的方法，所述细胞是免疫细胞，例如T细胞和NK细胞。 含有用于制造和使用该细胞的材料的试剂盒。 附图说明 附图示出本技术的实施方式，但并非限制性的。为了清楚和易于说明，附图不是按 比例绘制的，并且在某些情况下可能以夸大或放大的方式示出各个方面，以便于对特定实 施方式的理解。 图1A-1F：提供过继性传输表达嵌合抗原受体(CAR)小鼠CD8 T细胞的非限制性的 例子，其在较短的时间内展现出与内源性CD8 T细胞相似的耗竭表型。图1A提供肿瘤实验的 示意图。图1B提供流式细胞术图，示出了在过继性传输后第8天的CAR  CD8 T细胞群体和内 源性CD8 T细胞群体。图1C提供示出两个群体的总CD8 T细胞百分比的柱状图。图1D提供示 出CAR  CD8 T细胞或内源性CD8 T细胞的PD-1和Tim3表达的流式细胞术图。图1E提供示出四 个群体(图1A-1D)的表面受体表达的柱状图。所有数据均为(且对于被重复的数据，将会是) 三次生物学重复测定的数据点的平均值，且流式细胞术图代表三次生物学重复测定。图1F 提供了CAR  CD8 T细胞与内源性CD8 T细胞相比的细胞因子再刺激的流式细胞术图。用PMA/ 离子霉素刺激细胞或不刺激细胞。 图2A-2G：提供了与被转移有仅缺失Nr4a3的CAR  CD8 T细胞的小鼠相比，被过继性 转移有缺失所有三个Nr4a家族成员的CAR  CD8 T细胞的荷瘤小鼠展现肿瘤消退率增加和生 存期延长的非限制性例子。图2A提供了肿瘤实验的示意图。图2B提供了平均肿瘤生长的时 间进程，在d0时对于Nr4a3-/-，n＝13；在d0时对于Nr4aTKO，n＝14。在d21时，使用t检验(假 设方差相等)计算p值；由f检验确定等方差。使用单侧Mann-Whitney-Wilcoxon检验计算出 的实验具有91％的功效。图2C提供了相应的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图2D示出了存活曲 线，p值使用log-rank(Mantel-Cox)检验计算。图2E提供了肿瘤实验的示意图。图2F提供了 示出过继性转移后第8天CAR  NGFR CD8 T细胞的PD-1、Tim3、Lag3表面表达的柱状图。数据 为具有两次生物学重复测定的数据点的平均值。图2G提供了示出过继性转移后第8天用 PMA/离子霉素对CAR  NGFR CD8 T细胞进行再刺激后的TNF和IFNγ。两组中均未在背景以上 检测到IL-2(未示出)。数据示出具有两次生物学重复测定的数据点的平均值。 图3A-3G：浸润被过继转移的表达CAR小鼠CD8 T细胞和OT-1TCR转基因T细胞的 B16-OVA-huCD19肿瘤示出与内源性CD8 TIL表型相似的表型。(图3A)用于评估在肿瘤注射 后21天及过继转移150万个CAR  T细胞后第8天分离的CD45.1 CD8 表达CAR的TIL和内源性 CD45.2 TIL的特性的实验设计。(图3B)左侧：示出CAR  CD8 TIL群体和内源性CD8 TIL群体 的流式细胞术图；CAR  TIL通过CD45.1 表达和在CAR逆转录病毒载体中编码的Thy1.1表达 表示。右侧，示出了在CAR  CD8 TIL和内源性CD8 TIL上的PD-1和TIM3的表面表达的流式细 8 CN 111601882 A 说　明　书 3/77 页 胞术图。(图3C-3D)用于评估CD45.1 OT-1TCR转基因TIL特性的实验设计；其他细节如同(图 3B)。(图3E)示出在总CD8 TIL中的CAR  TIL和OT-1TIL百分比的柱状图。柱状图示出对于CAR  TIL、OT-I  TIL和内源性TIL分别为6、5和11次生物学重复测定的数据点的平均值。流式细胞 术图代表所有生物学重复测定。(图3F,图3G)与用CAR逆转录转导并在体外再刺激的CD8 T 细胞相比，在CAR、OT-1和内源性CD8 TIL再刺激后产生细胞因子的定量。用PMA/离子霉素刺 激细胞或不刺激细胞。(图3F)所示的柱状图是具有三次生物学重复测定的数据点的平均 值。所有p值都是使用Welch校正的非配对t检验计算。*p≤0 .05，**p≤0 .01，***p≤ 0.001，****p≤0.0001。(图3G)再刺激后细胞因子产生的代表性流式细胞术图(数据来自 (图3F))。 图4A-4F：PD-1hiTIM3hi  CAR  CD8 TIL的基因表达和染色质可及性图谱类似于PD- 1hiTIM3hi内源性CD8 TIL的基因表达和染色质可及性图谱。(图4A)来自表达CAR的TIL(CAR  TIL  PD-1hiTIM3hi(图4A)和PD-1hiTIM3lo(图4B))群体以及内源性TIL  PD-1hiTIM3hi(图 4C)、PD-1hiTIM3lo(图4D)、PD-1loTIM3lo(图4E)群体的各种群体的RNA测序(RNA-seq)数据 的主成分分析(PCA)。示出了PC1和PC2的方差百分比。(图4B)顶部，小鼠CD8 T细胞ATAC-seq 数据的热图，从通过k-平均值聚类确定的9个簇的行均值中示出log2倍变化。底部，基序富 集分析的热图。示出与所有可及区域相比在至少一个聚类中被富集的转录因子家族的一个 代表性成员的数据。(图4C)在CAR  TIL  PD-1hiTIM3hi(图4A)和PD-1hiTIM3lo(图4B)群体之 间，以及在内源性TIL  PD-1hi-TIM3hi(图4C)、PD-1hiTIM3lo(图4D)、PD-1loTIM3lo(图4E) 之间进行比较的Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3的蛋白水平表达的代表性的流式细胞术图；(图4D) Nr4a表达水平的定量；数据示出来自三次独立生物学测定的平均值和个体数值。(图4E)人 CD8 TIL20的单细胞RNA-seq散点图，在单细胞中绘制PDCD1和HAVCR2的表达(分别为x和y 轴)，以及不同NR4A基因的表达(色标)。每个点代表单个细胞。(图4F)顶部，来自PD-1hi  TIL (来自人黑素瘤的两个样本和来自非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的一个样本19)以及来自HIV感 染个体的抗原特异性CD8 T细胞的人类CD8 T细胞ATAC-seq数据，示出从通过k-均值聚类确 定的9个簇的行平均值中log2倍变化。底部，基序富集分析的热图。 图5A-5F：与用野生型CAR  CD8 T细胞转移的小鼠相比，用缺少所有三个Nr4a家族 成员的Nr4a  TKO  CAR  CD8 T细胞过继转移的荷瘤小鼠表现出更高的肿瘤消退率和延长的 生存期。(图5A)用于监测肿瘤生长的实验设计；肿瘤接种后第7天过继转移300万CAR  T细 胞。(图5B)前三幅图，在个体小鼠中肿瘤生长的时间进程，每种条件下包含30个或更多个生 物学重复测定。在d7，PBS的小鼠数量n＝21，WT的小鼠数量n＝35，以及Nr4aTKO的小鼠数量n ＝39。底部，在第21天，PBS的小鼠数量n＝14，WT的小鼠数量n＝25，Nr4aTKO的小鼠数量为n ＝36。数据示出平均值±s.d.以及个体数值；p值使用普通的单向ANOVA与Tukey的多重比较 检验计算；*p＝0.0331，****p<0.0001。(图5C)使用log-rank(Mantel-Cox)检验计算存活曲 线的p值；****p<0 .0001。在第90天，存活小鼠的数量，对于PBS，n＝0；对于WT，n＝1；对于 Nr4aTKO  n＝27。(图5D)用于评估CD8 TIL特性的实验设计；在肿瘤接种后第13天过继转移 150万个CAR  T细胞。(图5E)过继转移后8天，在WT和Nr4aTKO  TIL中PD-1和TIM3的表达。两种 样本都在细胞上以在CAR NGFR 群体中设定水平的CAR表达(103-104)设门。顶部图，PD-1和 TIM3表面表达的代表性流式细胞术图；中部和左下，PD-1和TIM3表达的代表性流式细胞术 柱状图。示出了六次独立实验的平均值和个体数值，每个点代表3-8只小鼠的TIL。双侧p值 9 CN 111601882 A 说　明　书 4/77 页 使用具有Welch校正的配对t检验计算。(图5F)过继转移后第8天，WT和Nr4aTKO  TIL的细胞 因子生产。顶部，流式细胞术图示出未刺激或用用PMA/离子霉素刺激的代表性CAR NGFR CD8 TIL生产的TNF和IFNγ。底部，柱状图示出过继转移后第8天，用PMA/离子霉素对CAR  NGFR CD8 T细胞再刺激后TNF和IFNγ单独和一起的产量。两组中均未检测到高于背景的 IL-2(未示出)。示出了五个独立实验的平均值和个体数值，其中每个点代表来自3-8只小鼠 的TIL。对于WT和Nr4aTKO，在未受刺激的样品之间以及在受刺激的样品之间，使用配对t检 验来计算双侧p值。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。 图6A-6F：Nr4a  TKO  CAR  CD8 TIL的基因表达和染色质可及性图谱表明与WT  CD8 TIL相比，效应子功能增强。(图6A)相对于WT  CAR  TIL，在Nr4a  TKO中差异表达的基因的平 均数(MA)图。差异表达的基因(调整的p值<0.1以及log2倍改变≥1或≤-1)用不同的颜色突 出显示(如颜色键所示)。将选定的基因标记。(图6B)在Nr4a缺失和Nr4a过表达之间具有相 反表达变化的基因的热图。将相对于WT  CAR  TIL在Nr4a  TKO中差异表达的所有基因的倍数 变化值(log2比例)与异位表达Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3的细胞中的相应基因值进行比较。通过 k平均值方法(k＝7)识别不同的聚类。突出显示的是在Nr4a缺失后下调而在Nr4a过表达后 上调的基因(例如Pdcd1、Havcr2和Tox)，以及在Nr4a缺失后上调而在Nr4a过表达后下调的 基因(例如Tnf和Il21)。(图6C)ATAC-seq密度(Tn5插入/kb)的成对比较的散点图。示出在 Nr4a  TKO和WT  CAR  TIL之间的差异可及区域和相关的从头识别的基序。(图6D)左侧，整合 所有先前提到的ATAC-seq样本及来自用CA-RIT-NFAT1转导的细胞的Pdcd1基因座的基因组 浏览器视图。灰色条示出位于Pdcd1转录起始位点5'端约～23kb处的耗竭特异性增强子。右 上方的柱状图示出在异位表达HA标记版本的Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3的细胞中的Nr4a的表达。 右下方的柱状图示出在位于Pdcd1的转录起始位点5'端 处的耗竭特异性增强子处 的背景之上的染色质免疫沉淀的HA标记Nr4a的富集。(图6E)来自Nr4a  TKO和WT  CAR  TIL的 ATAC-seq数据与来自异位表达CA-RIT-NFAT1、Nr4a1、Nr4a2或Nr4a3的细胞(从上到下)的 ATAC-seq数据的比较。底部图是来自Nr4a  TKO和WT  CAR  TIL的ATAC-seq数据与用PMA/离子 霉素刺激的细胞的ATAC-seq数据的比较。(图6F)示出Nr4a在经历慢性抗原刺激的T细胞中 的提议作用的示意图。 图7A-7H：在小鼠CD8 T细胞中与人类CD19反应的嵌合抗原受体(CAR)的表面表达 和功能评估。(图7A)表达huCD19的细胞系。左侧，EL4细胞；灰色＝亲代EL4，黑色＝表达 huCD19的EL4。左中，MC38细胞；灰色＝亲代MC38，黑色＝表达huCD19的MC38。右中，B16-OVA 细胞；灰色＝亲代B16-OVA，黑色＝表达huCD19的B16-OVA。右侧，体内的B16-OVA-huCD19细 胞；灰色＝同种型对照，黑色＝表达huCD19的B16-OVA细胞，该细胞分离自C57BL/6J荷瘤小 鼠并在分离后培养7天。(图7B)左侧，肿瘤生长曲线，示出接种250K  B16-OVA亲代肿瘤细胞 或250K  B16-OVA-huCD19肿瘤细胞的比较；两组的n＝15。普通双向方差分析示出在两组之 间在任何时间点均无显著差异。右侧，肿瘤生长曲线，示出接种250K或500K  B16-OVA- huCD19肿瘤细胞的比较；对于250K，n＝5；对于500K，n＝6。普通双向方差分析显示在第21天 两组之间存在显著差异；*p＝0.0146。(图7C)CAR构建体的示意图。LS＝前导序列；SS＝信号 序列；myc＝myc-标签；scFV＝抗人类CD19的单链可变片段；随后是小鼠CD28、小鼠CD3ζ信号 传导结构域；以及2A自裂解肽和小鼠Thy1.1报告基因。(图7D)以Thy1.1报告基因或myc标签 的表达进行监测的CAR的表面表达。模拟转导的CD8 T细胞用作对照。(图7E)流式细胞术图 10 CN 111601882 A 说　明　书 5/77 页 示出在用表达huCD19或PMA/离子霉素的EL4细胞再刺激之后，表达CAR的CD8 T细胞的细胞 因子产量(TNF和IFNγ)。数据代表三次独立的生物学重复试验。(图7F)(e)中所示数据的柱 状图；数据来自三次独立的生物学重复试验；使用双侧不配对t检验计算p值。*p≤0.05，**p ≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。(图7G)与模拟转导的CD8 T细胞相比，CD8 CAR  T细 胞的体外杀伤测定；使用普通的双向方差分析计算p值。(图7H)在用CAR转导或模拟转导并 体外培养5天的CD8 T细胞上的抑制性表面受体的表达；数据代表三个独立的生物学重复试 验。灰色阴影＝同种型对照，黑色线＝模拟或CAR。 图8A-6C：过继性转移的表达CAR的小鼠CD8 T细胞和浸润B16-OVA-huCD19肿瘤的 OT-I  TCR转基因T细胞展现出与内源性CD8 TIL的表型相似的表型。(图8A,图8B)用于CAR (图8A)和OT-I  CD8 TIL(图8B)的流式细胞术设门(gating)方案。(图8C)顶部，被过继转移 了CAR或OT-I  CD8 T细胞的荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；图是3次独立实验的汇总。在d＝7时， CAR  n＝24，OT-I  n＝21；在d＝21时，CAR  n＝17，OT-I  n＝20。底部，被CAR或PBS过继转移的 荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；图是3次独立实验的汇总。在d＝7时，CAR  n＝35，PBS  n＝8。在d ＝21时，CAR  n＝35，PBS  n＝6。肿瘤接种后第21天的肿瘤大小显示出，与OT-I相比，CAR的p 值为0.3527(顶部)；与CAR相比，PBS的p值＝0.6240(底部)；这些值是使用双侧不配对t检验 和Welch校正计算得出的。 图9：表达CAR的TIL和内源CD8 TIL基因表达图谱的比较。在所示的比较中被差异 化表达的基因的平均数图(MA)；如图例所示，将被差异化表达的基因(调整的p值<0.1，以及 log2倍数变化≥1或≤-1)使用不同颜色突出显示。将被选定的基因标记。顶部行，CAR  TIL 群体在其自身之间的比较以及与内源性PD-1lo  TIM3lo  TIL的比较；中间行，内源性TIL群 体之内的比较；底部行，CAR和内源性PD-1hi  TIM3hi  TIL(左)的比较，以及CAR和内源性PD- 1hi  TIM3lo  TIL(右)的比较。 图10A-10C：CAR  CD8 TIL、内源性CD8 TIL和OT-I  CD8 TIL的染色质可及性图谱的 比较。(图10A)在至少一个重复序列中可及的所有峰处，在所有重复序列之间的log2转换的 ATAC-seq密度(每千碱基插入Tn5)的成对欧几里德距离比较。(图10B)在所示样本之间的 ATAC-seq密度(每kb插入Tn5)的成对比较的散点图。(图10C)样本基因座Pdcd1(左)、Itgav (右)的基因组浏览器视图；所有轨道的标度范围为0-1000，数据为所有重复试验的平均值。 CD8 TIL群体如图1B、图1D所示和定义：(A)PD-1hi  TIM3hi  CAR、(B)PD-1hi  TIM3lo  CAR、 (C)内源性PD-1hi  TIM3hi、(D)内源性PD-1hi  TIM3hi、(E)内源性PD-1lo  TIM3hi。 图11A-11B：内源性小鼠CD8 T细胞和过继转移的浸润B16-OVA-huCD19肿瘤的表达 CAR的小鼠CD8 T细胞展现出水平升高的Nr4a。(图11A)用于CAR(左)和内源性(右)CD8 TIL 的流式细胞术设门方案。(图11B)PD-1hi  TIM3hi  TIL、PD-1hi  TIM3lo  TIL和PD-1loTIM3lo  TIL中的Nr4a蛋白的代表性流式细胞术柱图及其相应的荧光-1对照(呈灰白色)。 图12A-12C：人类CD8 TIL的单细胞RNA-seq的散点图。在单细胞中绘制PDCD1和 HAVCR2的表达(分别为x和y轴)，以及(以色标显示)相对于PD-1lo  TIM3lo  TIL在PD-1hi  TIM3hi  TIL中差异化上调的基因的表达(图12A)。(图12B)相对于PD-1lo  TIM3lo  TIL，在 PD-1hi  TIM3hi  TIL中被差异化下调的基因。(图12C)在PD-1hi  TIM3hi  TIL相对于PD-1hi  TIM3lo  TIL的比较中，编码所选择的转录因子的基因显示出差异化表达。每个点代表单个 细胞。人类CD8 TIL数据来自20。 11 CN 111601882 A 说　明　书 6/77 页 图13A-13C：产生WT和Nr4a  TKO  CAR  T细胞用于进行过继转移的强大的双重转导 效率。(图13A)在过继转移之前，仅CD8a染色的CAR  T细胞对照(先前被测试过与荧光-1对照 在CAR 表达和NGFR 表达上是相同的)。(图13B)过继转移之前CD8 WT  CAR  T细胞的CAR和 NGFR的表达。(图13C)过继转移之前CD8 Nr4a  TKO  CAR  T细胞的CAR和NGFR表达。 图14A-14D：与被转移了野生型CAR  CD8 T细胞或仅缺失三个Nr4a家族成员之一的 CAR  CD8 T细胞的小鼠相比，被过继转移了缺失三个Nr4a家族成员的CAR  CD8 T细胞的荷瘤 小鼠表现出更长的生存期。(图14A)用于监测肿瘤生长的实验设计；肿瘤接种后第7天过继 转移300万CAR  T细胞。(图14B)携带B16-OVA-huCD19肿瘤的个体小鼠中肿瘤生长的时程，每 种情况由17个或更多个生物学重复试验组成(这些数据包括来自图3的WT和Nr4a  TKO数 据)。在d7时，对于PBS小鼠数量n＝31；对于WT，n＝35；对于Nr4a1  KO，n＝17；对于Nr4a2  KO， n＝17；对于Nr4a3-/-，n＝32；对于Nr4a  TKO，n＝39。在第21天时，对于PBS，小鼠数量n＝14； 对于WT，n＝25；对于Nr4a1  KO，n＝12；对于Nr4a2  KO，n＝15；对于Nr4a3-/-，n＝22；对于 Nr4a  TKO，n＝36。(图14A)图示出在接种后第21天时B16-OVA-huCD19肿瘤大小的平均值± s.d.和个体值。p值使用普通单向ANOVA与Tukey的多重比较检验计算得出；PBS  vs  WT，*p＝ 0.0395；WT  vs  Nr4a1KO，p＝n.s＝0.0511；WT  vs  Nr4a2KO，**p＝0.002，WT  vs  Nr4a3-/-，* p＝0.0161；WT  vs  Nr4a  TKO，****p<0.0001。(d)小鼠的存活曲线。使用log-rank(Mantel- Cox)检验计算生存曲线的p值；****p<0.0001。在d90时，对于PBS小鼠数量n＝0；对于WT，n＝ 1；对于Nr4a1  KO，n＝0；对于Nr4a2  KO，n＝1；对于Nr4a3-/-，n＝11；对于Nr4a  TKO，n＝27。 图15A-15D：在小鼠CD8 T细胞中的Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3异位表达导致细胞因子产 量减少和抑制性表面标记物表达增加。将小鼠CD8 T细胞分离、活化并用空载体或具有人类 NGFR报告基因的HA标记的Nr4a1、Nr4a2或Nr4a3载体进行转导。在活化后第5天对细胞进行 测定。(图15A)以NGFR报告基因的恒定表达水平对CD8 NGFR 空载体对照、表达Nr4a1、Nr4a2 和Nr4a3细胞进行流式细胞术设门。(图15B)表面受体表达的定量(数据来自三次独立的生 物学重复试验)。(图15C)顶部，在用PMA/离子霉素再刺激时细胞因子产生的代表性流式细 胞术图；底部，在再刺激后细胞因子产量的定量(数据来自三个独立的生物学重复试验)。所 有p值都是使用邓尼特(Dunnett)的多重比较检验的普通单向ANOVA计算的；*p≤0.05，**p ≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。(图15D)转录因子的定量(来自三个独立的生物学重 复测验的数据)。 图16A-16B：在体外异位表达Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3的小鼠CD8 T细胞基因表达图谱 的比较。(图16A)来自在体外异位表达Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3和空载体对照的小鼠CD8 T细胞 的RNA测序(RNA-seq)数据的主成分分析(PCA)。示出了PC1和PC2的方差的百分比。(图16B) 在Nr4a1、Nr4a2或Nr4a3异位表达与空载体的比较中差异化表达的基因的平均均值(MA)图 (顶部行)，以及各种Nr4a家族成员的异位表达之间的成对比较(底部行)。如(a)中PCA图所 示，使用不同的颜色突出显示差异化表达的基因(被调整的p值<0.1和log2倍数变化≥1或 ≤-1)。将选定的基因进行标记。 图17：在体外异位表达Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3的小鼠CD8 T细胞的染色质可及性图谱 的比较。在所示样本之间成对比较ATAC-seq密度(每kb  Tn5插入)的散点图。 图18A-18D：从被过继转移缺乏全部三个Nr4a家族成员的Nr4a  TKO  CAR  CD8 T细 胞或WT  CAR  CD8 T细胞的荷瘤小鼠中分离的TIL的表型。(图18A)在肿瘤接种后第13天，延 12 CN 111601882 A 说　明　书 7/77 页 迟过继转移150万CAR  T细胞的肿瘤生长；从这些肿瘤中分离出用于表型分析的TIL。被过继 转移WT和Nr4aTKO  CAR  CD8 T细胞的Rag1-/-小鼠的肿瘤生长曲线；在d＝7时，WT＝47并且 Nr4aTKO＝41；在d＝21时，WT＝35并且Nr4aTKO＝32。p值使用Tukey多重比较检验的普通双 向ANOVA计算；对于WT  vs  Nr4aTKO，p值＝n.s＝0.6908。(图18B)用于由WT(顶部)和Nr4aTKO (底部)TIL表达的表面标记物、细胞因子和转录因子的测定的流式细胞术设门方案。在细胞 上对所有样本以在CAR NGFR 群体内设定水平的CAR表达(103-104)进行设门。(图18C)WT和 Nr4aTKO  CAR  TIL的TIL计数和Ki67的MFI的柱状图。(图18D)顶部，WT和Nr4aTKO  CAR  TIL转 录因子表达的柱状图。底部，在WT和Nr4aTKO  CAR  TIL中TIM3和TCF1表达的代表性流式细胞 术图。使用配对t检验计算双侧p值。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。 图19A-19C：与WT  CAR  CD8 TIL相比，Nr4a  TKO  CAR  CD8 TIL的基因表达表明效应 子功能增强。(图19A)来自Nr4a  TKO  CAR  TIL或WT  CAR  TIL的RNA测序(RNA-seq)数据的主 成分分析(PCA)。示出PC1和PC2的方差百分比。(图19B)由来自LCMV感染小鼠的效应子、记忆 和耗竭的CD8 T细胞限定的基因集的标准化富集分数(NES)17。(图19C)Nr4a  TKO  CAR  TIL和 WT  CAR  TIL的RNA-seq数据的基因集富集分析，通过在这些情况之间log2倍数变化进行基 因排名。 图20A-20B：Nr4a家族成员结合至预测的Nr4a结合基序，与Nr4a  TKO  CAR  TIL相比 该基序在WT  CAR  TIL中更容易接近。(图20A)右上方，代表性柱图示出在异位表达HA标记版 本的Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3的细胞中的Nr4a表达。中部，与Nr4a  TKO  CAR  TIL相比，WT  CAR  TIL的Ccr7、Ccr6、Ifng基因座的基因组浏览器视图，包括用于NFAT、Nr4a(Nur77)、bZIP、NFκ B的结合基序以及所用qPCR引物的位置。所有通道的标尺范围是0-1000，数据是所有重复试 验的平均值。右边，柱状图示出Nr4a在所探测区域的富集。(图20B)与Nr4a  TKO  CAR  TIL相 比，结合WT  CAR  TIL的Il21(左)、Tnf(右)基因座的基因组浏览器视图，包括NFAT、Nr4a (Nur77)、bZIP和NFκB的结合基序。所有轨道的标尺范围为0-1000，并且数据是所有重复试 验的平均值。 图21：Nr4a家族成员在来自用抗PDL1或IgG对照治疗的LCMV感染小鼠的抗原特异 性细胞中示出mRNA表达的中度降低。与用IgG对照处理的细胞相比，在用抗PDL1处理的细胞 中差异化表达基因的平均值(MA)图，突出显示了两种不同类型的差异化表达基因：调整后 的p值<0.1且log2倍数变化≥0.5或≤-0.5(浅色)；以及调整后的p值<0.1且log2倍数变化 ≥1或≤-1(较暗的颜色)。将选定的基因进行标记。所示出的为在每个类别中的基因数量。 该分析中的测序数据是从29获得的。 图22A-22D：与转移了WT  CAR  CD8 T细胞的小鼠相比，被过继转移缺乏全部三个 Nr4a家族成员的Nr4a  TKO  CAR  CD8 T细胞的免疫活性荷瘤小鼠表现出生存期延长。(图 22A)用于监测肿瘤生长的实验设计；在肿瘤接种后第7天过继转移了600万个CAR  T细胞。 (图22B)左边三幅图是携带B16-OVA-huCD19肿瘤的个体小鼠中肿瘤生长的时程，每种情况 包含13-15个生物学重复试验。在第7天时，对于PBS，小鼠数量n＝13；对于WT，n＝15；对于 Nr4a  TKO，n＝14。在第21天时，对于PBS，小鼠数量为n＝11；对于WT，n＝11，对于Nr4a  TKO，n ＝13。右边的三幅图是携带MC38-huCD19肿瘤的个体小鼠的肿瘤生长时程，每种情况包含10 个生物学重复试验。在d7时，对于PBS，小鼠数量n＝10；对于WT，n＝10；对于Nr4a  TKO，n＝ 10。在第19天时，对于PBS，小鼠数量n＝9；对于WT，n＝7；对于Nr4a  TKO，n＝10。(图22C)左 13 CN 111601882 A 说　明　书 8/77 页 侧，图示出在接种后第21天的B16-OVA-huCD19肿瘤大小的平均值±s.d.和个体值；p值使用 普通的单向ANOVA与Tukey的多重比较检验进行计算，没有示出任何显著性差异。右侧，图示 出接种后第19天的MC38-huCD19肿瘤大小的平均值±s .d .和个体值；p值使用普通的单向 ANOVA与Tukey的多重比较检验进行计算；*p＝0.012，***p＝0.0001。(图22D)携带B16-OVA- huCD19肿瘤(左)和MC38-huCD19肿瘤(右)的小鼠的存活曲线。使用log-rank(Mantel-Cox) 检验计算生存曲线的p值，****p<0.0001。对于在90天时携带B16-OVA-huCD19肿瘤的小鼠， 对于PBS，小鼠数量n＝0；对于WT，n＝0；对于Nr4a  TKO  n＝2；*p＝0.0026。对于携带MC38- huCD19肿瘤的小鼠，所有小鼠均在d23时死亡；*p＝0.0138。 图23A-23B：在实体肿瘤中，Tox和PD-1在CAR-T细胞中高度表达。实验方案：在注射 B16-huCD19肿瘤后12天，将CAR-T细胞进行过继转移，而在16、20和25天分离表达CD45.1 CD8 CAR的TIL。通过来自CAR-T细胞(第12天：转移之前)和表达CAR的TIL(第16、20和24天) 的流式细胞术分析PD-1和TOX表达水平(图23A-B)。 图24：与被转移WT  CAR-T细胞的小鼠相比，被过继转移缺乏TOX/TOX2的CAR-T细胞 的携带B16-huCD19肿瘤的C57BL/6N小鼠抑制肿瘤生长和延长生存期。在接种肿瘤后第7天， 过继转移300万CAR-T细胞。每2天通过游标卡尺测量肿瘤大小。 图25：在个体小鼠中肿瘤生长的时程和存活曲线。 图26：实验方案：在注射B16-huCD19肿瘤之后第12天过继性转移缺乏TOX和TOX2的 CAR-T细胞或WT  CAR  T细胞，并在第24天分离表达CD45.1 CD8 CAR的TIL，通过来自表达CAR 的TIL的流式细胞术分析PD-1、Tim-3、Lag-3和CD160表达水平。 图27：实验方案：在注射B16-huCD19肿瘤之后12天过继转移缺乏TOX和TOX  2的 CAR-T细胞或WT  CAR  T细胞，并在第24天分离表达CD45.1 CD8 CAR的TIL，在PMA/离子霉素 刺激(4小时)后通过来自表达CAR的TIL的流式细胞术分析IFN-γ和TNF-α表达水平。 图28：实验方案：在注射B16-huCD19肿瘤之后第12天过继转移缺乏TOX和TOX2的 CAR-T细胞或WT  CAR  T细胞，并在第24天分离表达CD45.1 CD8 CAR的TIL，通过来自表达CAR 的TIL的流式细胞术分析T-bet和Eomes表达水平。 图29：与被转移WT  CAR-T细胞的小鼠相比，被过继转移缺乏TOX/TOX2的CAR-T细胞 的携带B16-huCD19肿瘤的RAG1-/-小鼠抑制肿瘤生长并延长生存期。在接种肿瘤后第7天， 过继转移300万个CAR-T细胞。在个体小鼠中肿瘤生长的时程和存活曲线。每2天通过游标卡 尺测量肿瘤大小。 图30：携带CAR-2A-Thy  1.1构建体的质粒JC31的质粒图。 图31：携带CAR-2A-Thy  1 .1构建体的质粒JC31的质粒序列，具有以下元件：位于 579和920之间的MESV、位于987和1403之间的gag(截短)、位于1416和1425之间的Kozak序 列、位于1485和1514之间的Myc、位于1515和2900之间的CAR、位于2901和2957之间的P2A、位 于在2958和3446之间的小鼠Thy  1.1、位于3496和3010之间的3'LTR、位于4179和4195之间 的M13  rev、位于4203和4219之间的lac操纵子、位于4220和4271之间的lac启动子、位于 4272和4293之间的CAP结合位点、位于4581和5169之间的ori、位于5340和6200之间的AmpR 以及位于6201和6305之间的AmpR启动子。 详细说明 应该理解的是，本发明不限于所描述的特定方面，因为它们当然可以变化。还应理 14 CN 111601882 A 说　明　书 9/77 页 解的是，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制，所以本文中所使用的术语仅用于 描述特定实施方式的目的而非旨在限制性。 本发明的多个实施方式已经被描述。然而，应理解的是，在不脱离本发明的精神和 范围的情况下，可以做出各种修改。因此，以下的实施例旨在说明而非限制权利要求中所述 的公开范围。 在没有明确叙述的情况下应当推断出，并且除非另有意图，否则当本技术涉及多 肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物学等效物旨在被包括在本技术范围内。 在整个发明中，通过明确引用来引用各种出版物、专利和公开的专利说明书。引用 的完整的书目信息可紧接在权利要求书之前找到。本文所提及的所有出版物、专利申请、专 利和其他参考文献都明确地通过引用方式整体并入，就如同每个文献都单独通过引用方式 并入一样。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。 本文所引用的每个专利、专利申请、出版物或任何其他参考文献或文献都引用方 式整体并入本文。在冲突的情况下，以说明书(包括定义)为准。 任何专利、专利申请、出版物或任何其他文件的引用，并不意味着承认上述中的任 何内容是相关的现有技术，也不意味着承认这些出版物或文献的内容或日期。 除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可 以用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料。 本文所公开的所有特征可以以任何组合进行组合。在说明书中公开的每个特征可 以由具有相同、等同或相似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的 特征(例如抗体)是等同或相似特征的属的一个例子。 如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则所有数值或数值范围都包括在 这样的范围内的整数和在范围内的数值或整数的分数。此外，当本文对数值的列表进行描 述时(例如，大约50％、60％、70％、80％、85％或86％)，该列表包括其所有中间值和分数值 (例如54％、85.4％)。因此，举例来说，提及80％或更多同一性包括81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、 81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，依此类推。 提及大于(多于)或小于的整数分别包括大于或小于参考数字的任何数字。因此， 例如，提及小于100，包括99、98、97等，一直到数字一(1)；以及小于10包括9、8、7等，一直到 到数字一(1)。 如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则所有数值或范围都包括在这样 的范围内的值和整数的分数以及在这样的范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数字 范围，例如1-10，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，依此类推。因 此，提及1-50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最 多包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，依此类推。 提及一系列范围包括组成该系列内不同范围的边界值的范围。因此，为了对一系 列范围的参考进行说明，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100- 150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1, 500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500- 15 CN 111601882 A 说　明　书 10/77 页 5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000的范围包括10-50、50-100、 100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000的范围等。 在不脱离本技术的基本方面的情况下可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一 个或多个
技术实现要素：
对本技术进行了基本详细的描述，但是本领域普通技术人员将认识 到可以对本申请中具体公开的实施方式进行改变，且这些修改和改进是在本技术范围和精 神之内。 本文通常使用肯定性语言来公开本发明，以描述大量的实施方式和方面。本发明 还具体包括其中全部或部分地排除特定主题的实施方式，例如物质或材料、方法步骤和条 件、方案或程序。例如，在本发明的某些实施例或方面中，对材料和/或方法步骤进行排除。 因此，即使本发明在本文中一般不以本发明不包括哪些方面的方式进行表达，但本发明中 未明确排除的方面仍然在本文中公开。 本文说明性地描述的技术可以在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下适 当地被实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由... 组成”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任一个替换。已经采用的术语和表达被用 作描述性术语，而不是限制性的，并且这样的术语和表达的使用不排除所示出和描述的特 征或其片段的任何等同形式，并且在本技术要求保护的范围内可以进行各种修改。术语 “一”或“一个”可以指代其修饰的元素中一个或多个(例如，“一种试剂”可以表示一种或多 种试剂)，除非上下文中清楚地描述元素中一个或元素中的不止一个。如本文所用，术语 “约”是指在基础参数的10％以内的值(即，正或负10％)，并且在一串值的开头使用术语 “约”修饰这些值中的每一个(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量 可以包括90克至110克之间的重量。如本文所用，术语“基本上”是指值修饰语，其表示“至少 95％”、“至少96％”、“至少97％”、“至少98％”或“至少99％”和可能包含100％。例如，基本上 不含X的组合物可包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的X，和/或X可能不存 在或在该组合物中无法检测到。 因此，应当理解的是，尽管已经通过代表性实施方式和可选特征具体地已经公开 了本技术，但是可以通过本领域技术人员对本文公开的概念进行修改和变形，并且可以在 该技术的范围内考虑这样的修改和变形。 定义 如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该” 包括复数指示物。因此，例如，提及“NR4A转录因子”或“TOX转录因子”包括多个这样的NR4A 或TOX转录因子。 如本文所用，术语“包含”旨在表示所述组合物或方法包括所列举的步骤或元件， 但不排除其他。“基本上由...组成”应意为使权利要求仅对于那些不会实质性地影响所要 求保护的组合物和方法的基本和新颖特征的那些步骤或要素是开放式的。“由...组成”应 意为排除权利要求中未指定的任何要素或步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方 式都在本公开的范围内。 如本文所使用的，术语“约”用于表明包括用于确定该值的装置或方法的误差的标 准偏差的值。当在包括范围的数字标识(例如温度、时间、数量和浓度)之前使用时，术语 “约”表明近似值可能相差( )或(-)15％、10％、5％、3％、2％或1％。 16 CN 111601882 A 说　明　书 11/77 页 “真核细胞”包括除无核原虫类外的所有生命界。通过膜结合细胞核可以轻易地区 分它们。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或生物体，它们的细胞通过内膜和细胞骨 架组织成复杂的结构。最典型的膜结合结构是细胞核。除非具体叙述，否则术语“宿主”包括 真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性的 例子包括猿猴、牛、猪、小鼠、大鼠、禽类、爬行动物和人类。 如本文所用，“细胞的群体”意指在表型和/或基因型上相同(克隆)或不同的不止 一个细胞的集合。 如本文所用，“基本上同质”的细胞群体是通过预先选择的标记、表型或基因组性 状测定的具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％， 或至少98％的相同表型。在一方面，群体是克隆群体。 如本文所用，“异质”细胞群体是通过预先选择的标记、表型或基因组性状测定的 具有高达69％、或高达60％、或高达50％、或高达40％、或高达30％、或高达30％、或高达 20％、或最高10％，或高达5％、或高达4％、或高达3％、或高达2％、或高达61％、或高达 60％、或高达0.5％的相同表型的群体。 如本文所用，在对象中“治疗”疾病指(1)防止症状或疾病在易患或尚未表现出疾 病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；(3)改善或导致疾病或疾病的症状的消 退。如本领域中所理解的，“治疗”是一种用于获得有益的或所期望的结果(包括临床结果) 的方法。为了本技术的目的，无论是可检测的还是不可检测的，有益的或期望的结果都可以 包括(但不限于)以下一种或多种：减轻或改善一种或多种症状，缩小病症(包括疾病)的程 度，稳定(即不恶化)病况(包括疾病)的状态，延缓或减慢病况(包括疾病)、进程，改善和减 缓病况(包括疾病)状态和缓解(无论是部分还是全部)。含有所公开的组合物和方法的治疗 可以是一线、二线、三线、四线、五线疗法，并且旨在用作单独疗法或与其他合适的疗法组 合。在一方面，治疗排除预防。 短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗顺序。一线治疗方案是首先给 予的治疗，而二线或三线治疗则分别在一线治疗后或二线治疗后给予。美国国家癌症研究 所(National  Cancer  Institute)将一线疗法定义为“用于疾病或状况的第一疗法。在患有 癌症的患者中，主要治疗方法可以是手术、化学疗法、放射疗法或这些疗法的组合。对于本 领域的技术人员，一线疗法也被称为“主要治疗和主要疗法”。参见美国国家癌症研究所的 网站www.cancer.gov，最后访问于2008年5月1日。通常，因为患者对一线治疗未显示阳性临 床或亚临床响应或一线治疗已停止，随后给患者后续的化疗方案。 如本文所用，对象中的“抗肿瘤免疫力”是指易患或尚未表现癌症的对象中减轻或 预防症状或癌症出现。 如本文所用，在对象中提供“对病原体感染的免疫力”是指在易感或尚未表现出病 原体感染症状的对象中预防出现症状或病原体感染。在一方面，免疫降低或减少症状的进 程或严重程度以及感染的持续时间。 在一些实施方式中，对象需要本文所述治疗、细胞或组合物。在某些实施方式中， 对象患有或被怀疑患有瘤性病症、瘤形成、肿瘤、恶性肿瘤或癌症。在一些实施方式中，需要 本文所述的治疗、细胞或组合物的对象患有或被怀疑患有瘤性病症、瘤形成、肿瘤、恶性肿 瘤或癌症。在某些实施方式中，本文所述的工程化T细胞用于治疗患有或被怀疑患有瘤性病 17 CN 111601882 A 说　明　书 12/77 页 症、瘤形成、肿瘤、恶性肿瘤或癌症的对象。 在一些实施方式中，本文提供了治疗患有或被怀疑患有瘤形成、瘤性病症、肿瘤、 癌症或恶性肿瘤的对象的方法。在某些实施方式中，一种治疗对象的方法包含向对象施用 治疗有效量的工程化T细胞。在某些实施方式中，方法包含减少或抑制瘤性细胞、肿瘤、癌症 或恶性肿瘤细胞的增殖，其包含以足以减少或抑制瘤性细胞、肿瘤、癌症或恶性肿瘤细胞的 增殖的量，使该细胞、肿瘤、癌症或恶性肿瘤细胞与工程化T细胞接触。 在一些实施方式中，一种减少或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤转移至其他部 位或在远离原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的其他部位形成或建立转移性瘤形成、肿 瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，包括向对象施用一定量的工程化T细胞，该量足以减少或抑制 瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤向其他部位转移或在远离原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性 肿瘤的其他部位形成或建立转移性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。 瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的非限制性例子包括：癌、肉瘤、神经母 细胞瘤、宫颈癌、肝细胞癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、神 经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤或黑色素 瘤。瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤可包含或涉及造血细胞。肉瘤的非限制性例子 包括淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤或纤维肉瘤。在一些 实施方式中，瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤是骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。在一些 实施方式中，瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包含肺、甲状腺、头或颈、鼻咽、喉、鼻 或鼻窦、脑、脊柱、胸部、肾上腺、垂体、甲状腺、淋巴、胃肠道(嘴、食道、胃、十二指肠、回肠， 空肠(小肠)、结肠、直肠)、生殖泌尿道(子宫、卵巢、宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、阴茎、前列 腺)、肾脏、胰腺、肝脏、骨骼、骨髓、淋巴、血液、肌肉或皮肤的肿瘤形成、肿瘤或癌症。在一些 实施方式中，瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在 一些实施方式中，瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括干细胞瘤形成、肿瘤、癌症 或恶性肿瘤。在一些实施方式中，瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。 在一些实施方式中，一种方法抑制或减少瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿 瘤的复发或进展。在一些实施方式中，方法包含施用抗细胞增殖、抗瘤形成、抗肿瘤、抗癌症 或免疫增强的治疗或疗法。在一些实施方式中，治疗方法导致瘤形成、肿瘤、癌症或恶性细 胞团块的部分或完全的破坏；瘤形成、瘤性病症、肿瘤、癌症或恶性肿瘤团块的细胞体积、大 小或数量减少；刺激、诱导或增加瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤细胞的坏死、溶解或凋亡； 减少瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤细胞团块；抑制或预防瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的 体积、质量、大小或细胞数目的进展或增加；或延长寿命。在一些实施方式中，治疗方法导致 与瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤有关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时 间或频率减少或降低。在一些实施方式中，治疗方法导致疼痛、不适、恶心、虚弱或嗜睡的减 少或降低。在一些实施方式中，治疗方法导致精力、食欲增加，活动能力改善或心理健康。 术语“接触”意为两个或多个实体之间(例如，靶细胞群体与被工程化以减少或消 除所述细胞中的NR4A转录因子的表达和/或功能的T细胞之间)的直接或间接结合或相互作 用。直接的相互作用的特定例子是结合。间接的相互作用的特定例子是一个实体作用于中 间分子，而该中间分子转而作用于第二个所提及的实体。本文所用的接触包括在溶液中、在 固相中、在体外、离体、在细胞中和体内。体内接触可以称为施用或给药。 18 CN 111601882 A 说　明　书 13/77 页 如本文所用，术语“结合”或“抗体结合”或“特异性结合”意为抗体的抗原结合结构 域、抗体片段、CAR、TCR、工程化TCR、BCR、MHC、免疫球蛋白样分子、scFv、CDR或其他抗原呈递 分子与抗原、表位或肽以小于10-5M的结合亲和力(KD)接触。在某些方面，抗原结合结构域结 合至抗原和MHC分子的复合物。在一些方面，抗原结合结构域以约小于10-6M、10-6M的亲和力 进行结合，并且优选为10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在特定的方面，特异性结合指抗 原与MHC分子的结合，或工程化T细胞受体的抗原结合结构域与抗原或抗原-MHC复合物的结 合。 如本文所用，术语“耗竭的T细胞”或“耗竭的CAR  T细胞”是指由慢性抗原刺激触发 的低反应性7(“耗竭”8-11或“功能失调”12,13)状态，其特征在于几种抑制性受体的上调和效 应子功能的丧失14,15。 如本文所用，术语“施用”或“给药”用于表示将治疗剂(例如多核苷酸、载体、细胞、 修饰的细胞、群体)引入对象中。该物质的治疗性给药用于减轻任何症状，或预防出现其他 症状。当给药是为了预防或减少自身免疫性疾病或病症发展的可能性的目的时，可在出现 任何可见或可检测到的症状之前提供该物质。给药途径包括但不限于口服(例如片剂、胶囊 或混悬剂)、局部、透皮、鼻内、阴道、直肠、皮下静脉内、动脉内、肌内、骨内、腹膜内、硬膜外 和鞘内。 如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA 随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括在 真核细胞中剪接mRNA。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品中的mRNA或蛋白质的 量来确定。在一方面，可以将来自一个样本的基因的表达水平与来自对照或参比样本的该 基因的表达水平直接进行比较。在另一方面，在施用化合物之后，可以将来自一个样本的基 因的表达水平直接与来自相同样本的该基因的表达水平进行比较。当基因表达的上下文中 使用时，术语“上调”和“下调”及其变形分别是通常指相对于细胞(尤其细胞的亚型)的正常 或预期的阈值使基因表达增加和减少。 如本文所用，术语“基因表达图谱”是指测量多个基因的表达水平以建立特定样本 的表达图谱。 如本文所用，术语“减少或消除……表达和/或功能”是指减少或消除所述多核苷 酸向mRNA的转录，或减少或消除所述mRNA向肽、多肽或蛋白质的翻译，或减少或消除所述 肽、多肽或蛋白质的功能。在非限制性例子中，将多核苷酸向mRNA的转录降低至其在野生型 细胞中发现的正常水平的至少一半。 如本文所用，术语“增加...的表达”是指增加所述多核苷酸向mRNA的转录，或增加 所述mRNA向肽、多肽或蛋白质的翻译，或增加所述肽、多肽或蛋白质的功能。在非限制性例 子中，将多核苷酸向mRNA的转录增加至野生型细胞中发现的其正常水平的至少两倍。 如本文所用，术语“转录因子”是指能够与基因的或基因调节区域的一部分进行序 列特异性相互作用的多肽。该相互作用可以是直接的序列特异性结合，其中转录因子直接 接触核酸；或者是通过其他辅助蛋白介导或促进的间接的序列特异性结合，其中转录因子 通过直接核酸结合蛋白而被束缚在核酸上。另外，一些转录因子表现出诱导的或协同的结 合。转录因子影响基因转录的水平。在一方面，转录因子上调或增加基因表达。在另一方面， 转录因子下调或降低基因表达。 19 CN 111601882 A 说　明　书 14/77 页 如本文所用，术语“NR4A转录因子”是指与DNA结合并调节基因表达的细胞核激素 受体的NR4A亚家族的成员。NR4A转录因子家族成员的非限制性实例子是分别由SEQ  ID  NO: 3、SEQ  ID  NO:4和SEQ  ID  NO:5所提供的序列编码的人类NR4A1(Nur77)、NR4A2(Nurr1)和 NR4A3(NOR1)。 如本文所用，术语“TOX转录因子”是指与DNA结合并调节基因表达的细胞核激素受 体的TOX亚家族的成员。TOX转录因子家族成员的非限制性实例是分别由SEQ  ID  NO:6、SEQ  ID  NO:7、SEQ  ID  NO:8和SEQ  ID  NO:9所提供的序列编码的人类TOX1、TOX2、TOX3和TOX4。 如本文所用，术语“IL-21”(白介素21)是指具有免疫调节活性的细胞因子的共同 γ链家族的成员。非限制性例子是由SEQ  ID  NO:10所提供的序列编码的人类IL-21。 如本文所用，术语“抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能”是指减少或消除该通路 中的基因的转录，或者减少或消除所述mRNA翻译成通路肽、多肽、或蛋白质，或减少或消除 所述通路的肽、多肽或蛋白质的功能。抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能的非限制性例 子包括：抑制NR4A转录因子或TOX转录因子表达和/或功能，或增加IL-21的表达。 “有效量”是足以实现预期目的(其非限制性的例子包括：引发免疫应答、调节免疫 应答、抑制炎症反应和调节T细胞活性或T细胞群体)的量。在一方面，有效量是起到达到所 述治疗目的的作用的量，例如治疗有效量。如本文详细描述，有效的量或剂量取决于目的和 组成，并且可以根据本发明确定。 如本文所用，术语“T细胞”是指一类在胸腺中成熟的淋巴细胞。T细胞在细胞介导 的免疫中起重要作用，并通过在细胞表面上存在的T细胞受体与其他淋巴细胞(例如B细胞) 进行区分。T细胞可以是分离的，也可以是从商业渠道获得的。“T细胞”包括所有类型的表达 CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4 细胞)、细胞毒性T细胞(CD8 细胞)、自然杀伤性T细 胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞和 嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子 包括：BCL2(AAA)Jurkat( CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat( CRL-2900TM)、 BCL2(S87A)Jurkat( CRL-2901TM)、BCL2Jurkat( CRL-2899TM)、Neo  Jurkat( CRL-2898TM)、TALL-104细胞毒性人T细胞系(ATCC#CRL-11386)。另外的例子包括但 不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT  78、HUT  102、Karpas  384、Ki  225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF- CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas  45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT  3、MOLT-4、MOLT  13、MOLT-16、 MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、 SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、 TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3和-4、CCRF-HSB-2(CCL-120 .1)、J.RT3-T3 .5(ATCC  TIB- 153)、J45.01(ATCC  CRL-1990)、J.CaM1 .6(ATCC  CRL-2063)、RS4；11(ATCC  CRL-1873)、 CCRF-CEM(ATCC  CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系,例如HuT78(ATCC  CRM-TIB- 161)、MJ[G11](ATCC  CRL-8294)、HuT102(ATCC  TIB-162)。无白血病细胞系，包括但不限于 REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是另一种可商购获得的免疫细胞来源，以及源自于其他白血病 和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红细胞白 血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可以获得的细胞 20 CN 111601882 A 说　明　书 15/77 页 系的非限制性示例性来源包括美国典型培养物保藏中心(或AT C C) (h t t p : / / www.atcc.org/)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(https：//www.dsmz.de/)。 如本文所用，术语“工程化的T细胞受体”是指包含以下元件的分子：(a)细胞外抗 原结合结构域、(b)跨膜结构域和(c)细胞内信号传导结构域。在某些方面，工程化的T细胞 受体是基因修饰的TCR、修饰的TCR、重组TCR、转基因TCR、部分TCR、嵌合融合蛋白、CAR、第一 代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代TRUCK。在一些方面，工程化的T细胞受体包含抗体或 抗体的片段。在特定的方面，工程化T细胞受体是基因修饰的TCR或CAR。 如本文所用，术语“受体”或“T细胞受体”或“TCR”是指在T细胞上发现的细胞表面 分子，其功能是识别并结合由抗原呈递分子呈递的抗原。通常，TCR是α链(TRA)和β链(TRB) 的异质二聚体。一些TCR由替代性的γ(TRG)链和δ(TRD)链组成。表达此TCR版本的T细胞称 为γδT细胞。TCR是免疫球蛋白超家族的一部分。因此，如抗体一样，TCR的每条链都包含三 个高变CDR区域。在β链上还有一个高变区域(HV4)。TCR异质二聚体通常存在于八聚体复合 物中，该复合物还包含三个二聚体信号传导模块CD3γ/ε、CD3δ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η。人类 TCR-α链的非限制性示例性氨基酸序列：METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMN CSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCAPVLSGGGA DGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNS AVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLR LWSS。人类TCR-β链的非限制性示例性氨基酸序列：DSAVYLCASSLLRVYEQYFGPGTRLTVTEDLKN VFPPEVAVFEPPEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQP。 术语“修饰的TCR”是指已被基因工程化的TCR、和/或转基因TCR、和/或重组TCR。修 饰的TCR的非限制性例子包括单链VαVβTCR(scTv)，通过使用T细胞展示系统生产的全长 TCR，以及其中CDR区已经被工程化以识别特定抗原、肽、片段和/或MHC分子的TCR。开发和工 程化修饰的TCR的方法是本领域已知的。例如参见，Stone ,J .D .et  al .Methods  in  Enzymology  503:189-222(2012) ,PCT申请WO2014018863A1。 1型T调节(TR1)细胞是具有调节特性的CD4 T细胞的子集，并能够在体外和体内抑 制抗原特异性免疫反应。这些TR1细胞通过其独特的细胞因子图谱来定义，并产生高水平的 IL-10和TGF-β，但不产生IL-4或IL-2。由这些细胞产生的IL-10和TGF-β在体外介导了对原 始幼稚T细胞的抑制。也有证据表明TR细胞在体内存在，并且已有文献表明接受同种异体干 细胞移植的严重合并免疫缺陷患者中存在产生高水平IL-10的CD4( )T细胞。TR1细胞参与 外周耐受的调节，它们有可能被用作调节体内免疫应答的细胞疗法。参见例如,Levings , M.et  al.J.Allergy  Clin.Immunol.106(1Pt2):S109-12(2000)。 TR1细胞通过其产生高水平的IL-10和TGF-β的能力来定义。对各种抗原有特异性 的Tr1细胞在体内产生，但在存在IL-10的情况下也可能在体外从天然CD4 T细胞分化而来。 TR1细胞的增殖能力很低，可以通过IL-15克服。TR1细胞通过生产IL-10和TGF-β抑制初始和 记忆T辅助细胞1型或2型应答。TR1细胞在分子水平上的进一步表征将定义它们的作用机 制，并阐明它们与Tr细胞的其他子集的关系。可以预见到，使用TR1细胞鉴定新靶标用于开 发新的治疗剂，并将其作为调节外周耐受性的细胞疗法。参见例如，Roncarolo ,M .et  al.Immunol.Rev.182:68-79(2001)。 术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，以指动物，通常是哺乳 21 CN 111601882 A 说　明　书 16/77 页 动物。可以通过本文所述的方法、细胞或组合物治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限 制性例子包括：人类、非人类灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家 养动物(例如狗和猫)、农场动物(例如马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、 兔子、豚鼠)。在一些实施方式中，哺乳动物是人类。哺乳动物可以是任何年龄的或处于任何 发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性动物 或雌性动物。哺乳动物可以是怀孕的雌性动物。在一些实施方式中，对象是人类。在一些实 施方式中，人类患有或怀疑患有癌症或瘤性疾病。 “组合物”通常意指活性试剂(例如，工程化的免疫细胞(如T细胞、修饰的T细胞、NK 细胞、嵌合抗原细胞)、包含工程化的免疫细胞的细胞(例如T细胞、NK细胞、CAR  T细胞或CAR  NK细胞)、抗体、细胞因子IL-12、化合物或组合物)与天然存在或非天然存在的惰性(例如可 检测的试剂或标记)或活性载体的组合，所述载体例如是佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓 冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形 剂和添加剂、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二、三、四糖和低聚糖；衍 生糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它们可以单独或组合存在，其单 独或组合占重量或体积的1-99 .99％。示例性的蛋白质赋形剂包括例如人类血清白蛋白 (HSA)、重组人类白蛋白(rHA)的血清白蛋白、明胶、酪蛋白等。还可以以缓冲能力起作用的 代表性氨基酸/抗体成分包括：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天 冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸等。碳水 化合物赋形剂也应包含在该技术范围内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半 乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如 棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；醛糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、 乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。 根据本发明所使用的组合物包括细胞、治疗、疗法、药剂、药物和药物制剂，其可以 以剂量单位形式包装，以易于药物施用和剂量均匀度。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合 在对象中使用的物理上离散的单位，每个单位都包含被计算来产生与其施用(即适当的途 径和方案)相关的所期望的应答的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，给药量取决 于所期望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于执业医生的判断，并且是每个人所特 有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、给药途径、预期的治疗目标(缓解症状 与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制后，将以与剂量制剂相容的方式以 及以治疗或预防有效量的量来施用溶液。制剂易于以各种剂型(例如本文所述的可注射溶 液的类型)来施用。 如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物或细胞的材 料。在一方面，术语“分离的”是指与存在于天然来源的其他DNA或RNA、蛋白质或多肽、细胞 或细胞器、或组织或器官分离的核酸(例如DNA或DNA)、或蛋白质或多肽(例如，抗体或其衍 生物)、或细胞或细胞器、或组织或器官。术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时核酸 或多肽基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或当化学合成时基本不含化学前体或其他 化学物质。此外，“分离的核酸”意在包括天然情况下不以片段存在并且不会在天然状态下 被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用于指分离自其他细胞蛋白的多肽，并且意 在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还用于指与其他细胞或组织分离的细 22 CN 111601882 A 说　明　书 17/77 页 胞或组织，并且意在包括培养的和工程化的细胞或组织。 如本文所用，术语“分离的细胞”通常是指基本上与组织的其他细胞分离的细胞。 如本文所用，术语“动物”是指活的多细胞脊椎生物，这是一个包括例如哺乳动物 和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类和非人类哺乳动物，例如牛、犬、猫、大鼠、鼠类、猿 猴、马和人类。其他例子包括成人、少年和婴儿。 如本文所用，术语“抗体”(“Ab”)笼统地指免疫球蛋白(或“Ig”)或免疫球蛋白样分 子，包括但不限于以下同种型的抗体：IgM、IgA、IgD、IgE、IgG及其组合。免疫球蛋白样分子 包括但不限于在脊椎动物(例如人类、大鼠、山羊、兔和小鼠等哺乳动物)免疫应答过程中产 生的类似分子，以及例如鲨鱼免疫球蛋白的非哺乳动物种类(参见Feig e ,M .e t  al.Proc.Nat.Ac.Sci.41(22):8155-60(2014))。除非另有特别说明，否则术语“抗体”包括 完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，它们特异性地与目标分子(或与目标 分子高度相似的群组)结合，从而基本上排除结合其他分子(例如，抗体和抗体片段对目标 分子的结合常数比在生物样品中的其他分子的结合常数大至少103M-1、至少104M-1或至少 105M-1)。术语“抗体”还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源缀合物 抗体(例如双特异性抗体)。还参见，Pierce  Catalog  and  Handbook ,1994-1995(Pierce  Chemical  Co .,Rockford ,Ill .)；Kuby ,J .,Immunology ,3rd  Ed .,W .H .Freeman&Co .,New  York,1997. 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由细胞产生的抗体，其中单个抗体的轻链和 重链基因转染到该细胞中或更传统地通过B淋巴细胞的单个克隆转染。单克隆抗体通常对 单个表位具有亲和力(即它们是单价的)，但是可以被工程化以对两个或更多个表位具有特 异性(例如双特异性)。生产单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，例如通过将骨髓 瘤细胞与免疫脾细胞融合创建杂交瘤、噬菌体展示、从B细胞群体扩增单细胞、单浆细胞审 问技术(single  plasma  cell  interrogation  technologies)和单B细胞培养。单克隆抗体 包括重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。 抗体的一般结构由通过二硫键连接的重(H)链和轻(L)链组成。该结构还可包含在 保守氨基酸残基处连接的聚糖。每条重链和轻链均包含恒定区域和可变区域(也称为“结构 域”)。轻链有两种类型，λ和κ。决定了抗体分子的同种型(或类别)的重链有五种主要类型： γ、δ、α、μ和ε。重链的恒定区域也有助于抗体分子的效应子功能。包含重链μ、δ、γ3、γ1、α 1、γ2、γ4、ε和α2的抗体分别生成以下同种型：IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgA1、IgG2、IgG4、IgE 和IgA2。在爬行动物和鸟类中发现了与哺乳动物IgG相关的IgY同种型。在软骨鱼类中发现 了与哺乳动物IgD相关的IgW同种型。类别的转换是通过B细胞的重链基因座的重组用不同 的免疫球蛋白重链替换免疫球蛋白重链的恒定区域以生产不同同种型的抗体的过程。抗体 可以单体(例如IgG)、二聚体(例如IgA)、四聚体(例如鱼IgM)、五聚体(例如哺乳动物IgM)存 在和/或存在于与其他分子一起形成的复合物中。在一些实施方式中，抗体可以结合至细胞 表面或被细胞分泌。 免疫球蛋白重链和轻链的可变区特异性结合抗原。“框架”区域是Fab的一部分，其 起到作为被称为“互补决定区”(CDR)的三个高变区域的支架的作用。CDR的集合被称为互补 位。不同轻链或重链的框架区域在一个物种内相对保守。抗体的组合框架区域(包含来自轻 链和重链的区域)主要采用β-折叠构象，而CDR形成环，其连接β-折叠并在某些情况下形成 23 CN 111601882 A 说　明　书 18/77 页 β-折叠结构的一部分。因此，框架区域通过链间非共价的相互作用将CDR定位在正确的方向 上。已经定义了许多抗体的框架区和CDR，并且可以从在线维护的数据库中获得(Kabat  et  al.,Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,U.S.Department  of  Health  and  Human  Services,1991)。 重链和轻链可变区(VH和VL)的CDR负责与抗原表位结合。CDR中有限数量的氨基酸 位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。重链或轻链的CDR从 N端开始依次编号(即CDR1、CDR2和CDR3)。例如，VL  CDR3是位于抗体轻链可变域中的中间 CDR。VH  CDR1是抗体重链可变区域中的第一个CDR。结合特异性抗原的抗体将具有特异性VH 和VL区域序列，并且因此具有特异性CDR序列。具有不同特异性的抗体(即不同抗原的不同 结合位点)具有不同的CDR。 当用于抗体时，术语“人源化”意指抗体的氨基酸序列具有一个或多个互补决定区 (CDR)的非人类氨基酸残基(例如，小鼠、大鼠、山羊、兔等)，在受体人类免疫球蛋白分子中 该CDR特异性结合至所期望的抗原；以及在Fv框架区(FR)中一个或多个人类氨基酸残基，它 们是位于该CDR侧面的氨基酸残基。与从中获得一个或多个CDR的非人类亲本抗体相比，此 类抗体通常具有降低的免疫原性，因此在人体中的半衰期更长。 “抗原结合片段”(Fab)是指与木瓜蛋白酶消化产生的三个片段中的两个片段相对 应的抗体区域。Fab片段包含与抗原结合的区域，并且由来自重链和轻链的一个可变区域和 一个恒定区域组成。F(ab’)2片段是指被胃蛋白酶或酶IdeS(来自化脓性链球菌的免疫球蛋 白降解酶)消化的抗体的片段，其包含通过二硫键连接的两个Fab区域。单链可变片段 (“scFv”)是指融合蛋白，其包含通过在5至30个氨基酸之间的接头连接的至少一个VH和至 少一个VL区域。产生与特异性抗原结合的scFv的方法和技术是本领域已知的(参见例如 Ahmad,Z.A.et  al.,Clinical  and  Developmental  Immunology,2012:980250(2012)) . 如本文所用，术语“抗原”是指可以被特异性体液免疫产物或细胞免疫产物以及抗 原识别分子(包括但不限于抗体分子、单链可变片段(scFv)、细胞表面免疫球蛋白受体、B细 胞受体(BCR)、T细胞受体(TCR)、工程化的TCR、修饰的TCR或CAR)特异性结合和/或识别的化 合物、组合物或物质。术语“表位”是指由抗原识别分子识别的抗原和抗原的片段、区域、位 点或结构域。抗原可以是任何类型的分子，包括但不限于肽、蛋白质、脂质、磷脂半抗原、简 单的中间代谢物、糖(例如单糖或寡糖)、激素和例如复杂的碳水化合物(例如多糖)的大分 子。抗原的一些非限制性例子包括参与自身免疫疾病、变态反应和移植排斥的抗原(包括自 身抗原)、肿瘤抗原、毒素和其他抗原。肿瘤抗原的非限制性例子包括间皮素、ROR1和 EGFRvIII、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、白介素(IL)-13rα2、EGFR  VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩 藻糖基GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断点、Wilms肿瘤1、血液学分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂 (GM2)、生长因子受体、基质抗原、血管抗原或其组合。由病原体表达的抗原包括但不限于微 生物抗原，例如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原。 如本文所用，术语“靶细胞群体”是指呈递抗原的细胞群，其可以被工程化的T细胞 靶向。靶细胞群体的非限制性例子包括肿瘤细胞、癌症细胞和病原体感染的细胞。病原体的 非限制性例子包括病毒病原体和细菌病原体。 如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指可以特异性结合抗原靶标(包括抗原和 MHC分子的靶标复合物)的任何蛋白质或多肽结构域。 24 CN 111601882 A 说　明　书 19/77 页 如本文所用，对于细胞、组织和/或移植物，术语“自体的”是指分离自且随后施用 回相同对象、患者、接受者和/或宿主的细胞、组织和/或移植物。“同种异体”是指非自体细 胞、组织和/或移植物。 如本文所用，术语“B细胞”是指适应性免疫系统的体液免疫中的淋巴细胞的类型。 在通过抗原相互作用的激活之后，B细胞主要功能是制造抗体，充当抗原呈递细胞，释放细 胞因子并发展记忆B细胞。B细胞因在细胞表面存在B细胞受体而区别于其他淋巴细胞(例如 T细胞)。B细胞可以是分离的或从商业上可获得的来源获得。商业上可获得的B细胞系的非 限制性例子包括细胞系AHH-1( CRL-8146TM)、BC-1( CRL-2230TM)、BC-2( CRL-2231TM)、BC-3( CRL-2277TM)、CA46( CRL-1648TM)、DG-75[D.G.- 75]( CRL-2625TM)、DS-1( CRL-11102TM)、EB-3[EB3]( CCL-85TM)、Z- 138(ATCC#CRL-3001)、DB(ATCC  CRL-2289)、Toledo(ATCC  CRL-2631)、Pfiffer(ATCC  CRL- 2632)、SR(ATCC  CRL-2262)、JM-1(ATCC  CRL-10421)、NFS-5C-1(ATCC  CRL-1693)、NFS- 70C10(ATCC  CRL-1694)、NFS-25C-3(ATCC  CRL-1695)和SUP-B15(ATCC  CRL-1929)。另外的 例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6、 Karpas  299、Ki-JK、Mac-2A  Ply1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、 DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda  519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤的细胞系，例如DEV、 HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L  428、L  540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这 样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括：美国典型培养物保藏中心(或 ATCC)(www.atcc.org/)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(https://www.dsmz.de/)。 如本文所用，“靶细胞”是表达能被工程化的T细胞结合的抗原靶标的任何细胞。 如本文所用，“癌症”是一种疾病状态，其特征是在对象中存在表现出异常的不受 控制的复制的细胞，并且可以与术语“肿瘤”互换地使用。在一些实施方式中，癌症是白血病 或淋巴瘤。“与癌症相关的细胞”是指那些表现出异常的不受控制的复制的对象细胞。在某 些实施方式中，癌症是急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病。如本文所用，“白血 病”是特征在于未成熟白细胞异常增加的血液或骨髓癌症。急性髓细胞性白血病(AML)(也 称为急性骨髓性白血病或急性粒细胞性白血病)的特定病状是髓样来源血细胞的癌症，其 特征是异常骨髓样细胞的迅速生长，该异常骨髓样细胞积聚在骨髓中并干扰骨髓与正常血 细胞的产生。急性淋巴细胞性白血病(ALL)(也称为急性淋巴细胞性白血病或急性淋巴样白 血病)的具体病况是白细胞癌症，其特征是恶性、未成熟的白细胞(淋巴细胞)的过量生成和 积累，导致缺乏正常、健康的血细胞。如本文所用，“淋巴瘤”是血液的癌症，其特征在于血细 胞肿瘤的发展和淋巴结增大、发烧、湿汗、意外体重减轻、瘙痒和经常感到疲倦的症状。 如本文所用，“病原体感染的细胞群体”或“病原体感染的细胞”是指被病原体感染 的细胞群体或细胞。病原性感染的例子包括但不限于：细菌的感染，例如A群链球菌、结核分 枝杆菌、弗氏志贺菌、肠道沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、土拉弗朗西斯菌；以及病 毒的感染，例如单纯疱疹病毒。 本领域技术人员可以使用例如RNA测序、DNA微阵列、实时PCR或染色质免疫沉淀 (ChIP)等方法来监测转录因子的表达。可以使用例如流式细胞仪、免疫印迹、2D凝胶电泳或 免疫测定等方法来监测蛋白质的表达。 本领域技术人员可以使用例如RNA干扰(RNAi)、CRISPR、TALEN、ZFN的方法或靶向 25 CN 111601882 A 说　明　书 20/77 页 特定序列以减少或消除NR4A或TOX转录因子的表达和/或功能的其他方法。CRISPR、TALEN、 ZFN或其他基因组编辑工具也可以用于增加IL-21的表达和/或功能。 如本文所用，“RNAi”(RNA干扰)是指通过靶向特定的mRNA序列用于通过引入短链 的双链RNA(dsRNA)和小的干扰RNA(例如siRNA、shRNA或miRNA等)进行降解以减少或消除细 胞中基因表达的方法(Agrawal,N.et  al.；Microbiol  Mol  Biol  Rev.2003；67:657-685, Arenz,C.et  al.；Naturwissenschaften.2003；90:345-359,Hannon  GJ .；Nature .2002； 418:244-251)。 如本文所用，术语“CRISPR”是指依赖于成簇的规律间隔的短回文重复通路的序列 特异性基因操作的技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调节，以及仅将蛋白质靶向 特定的基因组位置。“基因编辑”是指一种类型的基因工程，其中通过将缺失、插入、单链或 双链断裂或碱基置换引入至多核苷酸序列以改变靶多核苷酸的核苷酸序列。在某些方面， CRISPR介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的通路以执行编辑。基因调 节是指增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。 如本文所用，术语“gRNA”或“向导RNA”是指用于靶向特定多核苷酸序列以采用 CRISPR技术进行基因编辑的向导RNA序列。设计用于靶标特异性的gRNA和供体治疗性多核 苷酸的技术是本领域已知。例如Doench,J.,et  al.Nature  biotechnology  2014；32(12): 1262-7 ,Mohr,S.et  al.(2016)FEBS  Journal  283:3232-38和Graham ,D.,et  al.Genome  Biol.2015；16:260。gRNA包含CRISPR  RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR  RNA(tracrRNA)的融 合多核苷酸，或基本上由该融合多核苷酸组成，或由该融合多核苷酸组成，或gRNA包含具有 CRISPR  RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR  RNA(tracrRNA)的多核苷酸。在某些方面，gRNA是 合成的(Kelley,M.et  al.(2016)J  of  Biotechnology  233(2016)74-83) . 术语“Cas9”是指该名称所指的CRISPR相关的核酸内切酶。非限制性的示例性Cas9 包括金黄色葡萄球菌Cas9、核酸酶失活的Cas9以及其每一个直系同源物和生物等效物。直 系同源物包括但不限于化脓性链球菌Cas9(“spCas9”)；来自嗜热链球菌、嗜肺军团杆菌、乳 酸奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella  novicida)的Cas9；以及来自 包括氨基酸球菌属(Acidaminococcus  spp)和新凶手弗朗西丝菌U112(Francisella  novicida  U112)的各种细菌的Cpf1(执行与Cas9类似的切割功能)。 如本文所用，“TALEN”(转录激活因子样效应因子核酸酶)是指工程化的核酸酶，其 包含被融合至TALE  DNA结合结构域的非特异性DNA切割核酸酶，其可以靶向DNA序列并用于 基因组编辑。Boch(2011)Nature  Biotech.29:135-6；Boch  et  al .(2009)Science  326: 1509-12；Moscou  et  al.(2009)Science  326:3501。TALE是黄单胞菌属细菌分泌的蛋白质。 DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列(第12和13个氨基酸除外)。这 两个位置是高度可变的，显示出与特异性核苷酸识别的强的相关性。因此，它们可以被工程 化来结合至所期望的DNA序列。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，该核酸酶是 野生型或突变的Fok1核酸内切酶。已经对Fokl的做出几种突变以将其用于TALEN，这些突变 例如改善切割特异性或活性。Cermak  et  al.(2011)Nucl.Acids  Res.39:e82；Miller  et  al.(2011)Nature  Biotech.29:143-8；Hockemeyer  et  al.(2011)Nature  Biotech.29: 731-734；Wood  et  al.(2011)Science  333:307；Doyon  et  al.(2010)Nature  Methods  8: 74-79；Szczepek  et  al .(2007)Nature  Biotech .25:786-793；以及Guo  et  al .(2010) 26 CN 111601882 A 说　明　书 21/77 页 J.Mol.Bio.200:96。Fokl结构域以二聚体形式起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的 构建体，以适当的方向和间距在靶基因组中形成位点。在TALE  DNA结合结构域和Fok1切割 结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量显得对于获 得高水平活性都是重要参数。Miller  et  al.(2011)Nature  Biotech.29:143-8。对免疫细 胞中的序列呈特异性的TALEN可以使用本领域已知的任何方法来构建，包括使用模块化组 件的各种方案。Zhang  et  al.(2011)Nature  Biotech.29:149-53；Geibler  et  al.(2011) PLoS  ONE  6:e19509。 如本文所用，“ZFN”(锌指核酸酶)指工程化的核酸酶，其包含与锌指DNA结合结构 域融合的非特异性DNA切割核酸酶，其可以靶向DNA序列并用于基因组编辑。像TALEN一样， ZFN包含与DNA结合结构域融合的Fok1核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结 合结构域包含一个或多个锌指。Carroll  et  al .(2011)Genetics  Society  of  America  188:773-782；以及Kim  et  al.(1996)Proc.Natl.Acad .Sci.USA  93:1156-1160。锌指是由 一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别 约3bp的序列。可以将各种已知特异性的锌指结合以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多 指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，该技术 包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交系统和双杂交系统以及哺乳动物细胞。像 TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。该两个单 独的ZFN必须结合至DNA的相反链，并且它们的核酸酶被适当地间隔开。Bitinaite  et  al. (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  95:10570-5。对免疫细胞中的序列呈特异性的ZFN可以使 用本领域已知的任何方法来构建。参见例如，Provasi(2011)Nature  Med .18:807-815； Torikai(2013)Blood  122:1341-1349；Cathomen  et  al.(2008)Mol.Ther.16:1200-7；Guo  et  al.(2010)J.Mol.Bioi.400:96；美国专利公开201110158957；以及美国专利公开2012/ 0060230。 “细胞毒性细胞”是指能够杀死其他细胞或微生物的细胞。细胞毒性细胞的例子包 括但不限于：CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导 细胞毒性反应。 如本文所用，术语“可检测标记”是指至少一种能够直接或间接产生可检测信号的 标记。该标记的非穷举清单包括：产生可检测信号(例如通过比色法、荧光、发光)的酶，例如 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光、发 光染料，通过电子显微镜或通过其电学性质(例如电导率、安培法、伏安法、阻抗)被检测到 的电子密度的基团；可检测基团，例如其分子大小足以在其物理和/或化学性质中诱导可检 测的修饰的可检测基团，这样检测可通过光学方法(例如衍射、表面等离子体共振、表面变 化、接触角变化)或物理方法(例如原子力光谱法、隧道效应)或放射性分子(例如32P、35S或 125I)完成。 如本文所用，“疾病相关抗原”或指与疾病过程或机制有关的抗原、表位或其片段。 例如，与炎症有关的抗原是当被呈递时产生免疫反应的抗原或其片段。选择产生这种作用 的炎症相关抗原来治疗炎症。类似地，自身免疫相关抗原是与自身免疫疾病相关的抗原，并 且不会被选择用于治疗自身免疫以外的疾病或疾病，例如癌症。本文公开了非限制性的示 例性疾病相关抗原，并且进一步地，可以基于本文所述的表位筛选技术、机制和方法对特定 27 CN 111601882 A 说　明　书 22/77 页 疾病确定此类抗原。 当应用于核酸序列时，术语“编码”是指如果以其天然状态或当通过本领域技术人 员已知的方法操作时，该核酸可以被转录和/或翻译以产生功能性RNA(例如，miRNA、siRNA、 RNAi、tRNA、rRNA、snRNA等)、mRNA或多肽和/或其片段，则称多核酸“编码”RNA或多肽。反义 链是这种核酸的互补物，并且可以从其推导该编码序列。 如本文所用，术语“增强子”表示增加、改善或减轻核酸序列的转录的调节序列元 件，而不论其相对于要表达的核酸序列的位置和方向。增强子可以增强从单个启动子开始 的转录或同时增强从多个启动子开始的转录。只要保留或基本保留了改善转录的功能(例 如，至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性(即全长序列活性))，野生型增 强子序列的任何截短、突变或其他修饰的变体也在上述定义之内。 在核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“嵌合”意指该序列含有至少一个取代单元 (例如片段、区域、部分、结构域、多核苷酸或多肽)或由至少一个取代单元组成，该取代单元 衍生自、获得自或分离自、或基于其他不同物理或化学实体。例如，两种或更多种不同蛋白 质的嵌合体可以包含来自被融合至细胞信号传导分子的跨膜结构域的抗体的可变区结构 域的序列。在一些方面，嵌合体是指该序列由来自至少两个不同物种的序列组成。 如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指一种融合蛋白，其包含能够结合抗原 的细胞外结构域、衍生自多肽(不同于衍生出细胞外结构域的多肽)的跨膜结构域以及至少 一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体 (CIR)”。“能够结合抗原的细胞外结构域”是指可以结合某种抗原的任何寡肽或多肽。“细胞 内结构域”或“细胞内信号传导结构域”是指已知作为结构域起作用的任何寡肽或多肽，该 结构域在细胞中传递信号以引起生物过程的激活或抑制。在某些实施方式中，除主要信号 传导域外，细胞内结构域还可包含一个或多个共刺激信号传导域，或基本上由一个或多个 共刺激信号传导域组成，或进一步包含一个或多个共刺激信号传导域。“跨膜结构域”是指 任何已知横跨细胞膜的寡肽或多肽，其可起连接细胞外结构域和信号传导结构域的作用。 嵌合抗原受体可以可选地包含“铰链结构域”，其充当细胞外结构域和跨膜结构域之间的接 头。本文公开了编码每个结构域的组分的非限制性示例性多核苷酸序列，例如： 铰链结构域：IgG1重链铰链的多核苷酸序列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCG，以及可选的其等效物。 跨膜结构域：CD28跨膜区域的多核苷酸序列：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC CTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG，以及可选的其等效物。 细胞内结构域：4-1BB共刺激信号区的多核苷酸序列：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT GTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCA GAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG，以及可选的其等效物。 细胞内结构域：CD28共刺激信号区域的多核苷酸序列：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCC TGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGGCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACC ACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC，以及可选的其等效物。 细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域的多核苷酸序列：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA GACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATG TTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTA 28 CN 111601882 A 说　明　书 23/77 页 CAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAG GGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC CCCCTCGCTAA，以及可选的其等效物。 能够结合抗原的CAR胞外结构域的非限制性例子是：如US20140271635申请中所公 开，特异性结合CD19抗原的抗CD19结合结构域序列。 每个示例性结构域组分的其他实施方式包括具有相似生物学功能的其他蛋白质， 其与由以上公开的核酸序列编码的蛋白质有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性， 优选为90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列同一性。此外，本文提供了这样结构域 的非限制性例子。 如本文所用，术语“CD8α铰链结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段以及任 何其他具有相似生物功能的分子，该分子与如本文所示的CD8α铰链结构域具有至少70％或 至少80％的氨基酸序列同一性，优选为90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列同一 性。Pinto,R.D.et  al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177提供了人、小鼠和 其他 物 种的 C D 8α铰 链结 构域的 示 例序列。P i n t o ,R .D .e t  a l . ( 2 0 0 6 ) Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177提供了与CD8α铰链结构域相关的序列。这样的序 列的非限制性例子包括： 人类CD8α铰链结构域氨基酸序列：PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAV HTRGLDFACDIY，以及可选的其等效物。 小鼠CD8α铰链结构域氨基酸序列：KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKG TGLDFACDIY，以及可选的其等效物。 猫CD8α铰链结构域氨基酸序列：PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEA SGLDLSCDIY，以及可选的其等效物。 如本文所用，术语“CD8α跨膜结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和具有 相似生物功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的CD8α跨膜结构域具有至少70％或至 少80％的氨基酸序列同一性，优选地为90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列同一 性。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank登录号：NP_001759.3)第183至203位的氨基酸 相关的片段序列、或与小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank登录号：NP_001074579.1)的 第197至217位氨基酸相关的片段序列、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank登录号： NP_113726.1)的第190至210位氨基酸相关的片段序列提供了CD8α跨膜结构域的其他示例 序列。与列出的登录号中每一个相关的序列提供如下： 人类CD8α跨膜结构域的氨基酸序列：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT，及可选的其等效 物。 小鼠CD8α跨膜结构域的氨基酸序列：IWAPLAGICVALLLSLIITLI，及可选的其等效 物。 大鼠CD8α跨膜结构域的氨基酸序列：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI，及可选的其等效 物。 如本文所用，术语“CD28跨膜结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和具有 类似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少 70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或者至少90％的序列同一性，或至少95％的序列同 29 CN 111601882 A 说　明　书 24/77 页 一性。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列提供了CD28跨 膜结构域的其他非限制性示例序列。 如本文所用，术语“4-1BB共刺激信号传导区域”是指与此名称相关的特定蛋白质 片段和具有相似生物功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的4-1BB共刺激信号传导 区域序列具有至少70％或至少80％氨基酸序列同一性，优选具为90％的序列同一性，更优 选为至少95％的序列同一性。在美国公开20130266551A1(作为美国专利申请号13/826,258 提交)中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的非限制性示例序列，例如下面提供的示例性序 列和4-1BB共刺激信号区域氨基酸序列编码的序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRF PEEEEGGCEL，以及可选的其等效物。 如本文所用，术语“ICOS共刺激信号传导区”是指与此名称相关的特定蛋白质片段 和具有相似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示ICOS共刺激信号区域序列具 有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，优选为90％的序列同一性，更优选为至少 95％的序列同一性。美国专利申请公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区 域的非限制性例子的序列。示例性多核苷酸序列提供如下。 ICOS共刺激信号传导区域的多核苷酸序列：ACAAAAAAGA  AGTATTCATC  CAGTGTGCAC  GACCCTAACG  GTGAATACAT  GTTCATGAGA  GCAGTGAACA  CAGCCAAAAA  ATCCAGACTC  ACAGATGTGA  CCCTA，以及可选的其等效物。 如本文所用，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与此名称相关的特定蛋白质片 段和具有相似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示OX40共刺激信号区域序列 具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或至少95％的序列 同一性。在美国专利申请公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非 限制性示例序列，并且其包括以下提供的示例性序列。 OX40共刺激信号传导区域的多核苷酸序列：AGGGACCAG  AGGCTGCCCC  CCGATGCCCA  CAAGCCCCCT  GGGGGAGGCA  GTTTCCGGAC  CCCCATCCAA  GAGGAGCAGG  CCGACGCCCA  CTCCACCCTG  GCCAAGATC，以及可选的其等效物。 如本文所用，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与此名称相关的特定蛋白质片 段和具有相似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的CD28共刺激信号传导区 域序列具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或者至少 95％的序列同一性。在美国专利第5,686,281号中提供了示例序列CD28共刺激信号传导区 域。Geiger,T.L.et  al.(2001)Blood  98:2364-2371；Hombach,A.et  al.(2001)J  Immunol  167:6123-6131；Maher,J.et  al.(2002)Nat  Biotechnol  20:70-75；Haynes,N.M.et  al. (2002)J  Immunol.169:5780-5786(2002)；Haynes ,N.M.et  al.(2002)Blood  100:3155- 3163.(2001)Blood  98:2364-2371；Hombach,A.et  al.(2001)J  Immunol  167:6123-6131； Maher ,J .et  al .(2002)Nat  Biotechnol  20:70-75；Haynes ,N .M .et  al .(2002)J  Immunol.169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.et  al.(2002)Blood100:3155-3163。非限制 性例子包括由以下序列编码的序列：CD28氨基酸序列：MLRLLLALNL  FPSIQVTGNK  ILVKQSPMLV  AYDNAVNLSC  KYSYNLFSRE  FRASLHKGLDSAVEVCVVYG  NYSQQLQVYS  KTGFNCDGKL  GNESVTFYLQ  NLYVNQTDIY  FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG  TIIHVKGKHL  CPSPLFPGPS  KPFWVLVVVG  GVLACYSLLVTVAFIIFWVR  SKRSRLLHSD  YMNMTPRRPG  PTRKHYQPYA  PPRDFAAYRS,以及其等效 30 CN 111601882 A 说　明　书 25/77 页 物。 如本文所用，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和 具有类似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的CD3ζ信号传导域序列具有至 少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或至少95％的序列同一性。 在美国申请号13/826,258中提供了CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列的非限制性示例序 列，例如：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。 如本文所用，“第一代CAR”是指包含能够结合抗原的细胞外结构域、衍生自与衍生 出细胞外结构域的多肽不同的多肽的跨膜结构域和至少一个细胞内结构域的CAR。“第二代 CAR”是指还包括一个共刺激结构域(例如4-1BB或CD28)的第一代CAR。“第三代CAR”是指还 包括两个共刺激结构域(例如，CD27、CD28、ICOS、4-1BB或OX40)的第一代CAR。“第四代CAR” (也称为“TRUCK”)是指被进一步工程化以分泌另外的因子(例如促炎细胞因子IL-12)的CAR  T细胞。在Maus,M.et  al.Clin.Cancer  Res.22(3):1875-84(2016)中可以找到对这些CAR技 术和细胞疗法的综述。 如本文所用，术语“信号肽”或“信号多肽”是指通常存在于新合成的分泌或膜多肽 或蛋白质的N-末端的氨基酸序列。它起引导多肽穿过细胞膜或进入细胞膜中的作用，然后 被移除。这样的例子是本领域众所周知的。非限制性例子是在美国专利号8,853 ,381和5, 958,736中描述的那些。 如本文中针对调节性多核苷酸所用，术语“可操作地连接”是指当调节性多核苷酸 和其所连接的多核苷酸序列之间的结合，从而当特定蛋白质结合至调节性多核苷酸时，被 连接的多核苷酸被转录。 术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式， 即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以 执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如，探 针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核 酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何 序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷 酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷 酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组 分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则该技术的多核苷酸任何方 面都包括双链形式和已知或被预测组成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。 如本文所用，术语“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸 的聚合形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多 链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或 生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。 如本文所用，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。例 如，启动子可以是组成性的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是控制序列，是 多核苷酸序列的一个区域，其控制转录的起始和频次。它可能包含调节蛋白和分子(例如 RNA聚合酶和其他转录因子)可以结合的基因元件。 31 CN 111601882 A 说　明　书 26/77 页 术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广义上是指具有两个或多 个亚基氨基酸，氨基酸类似物或模拟肽的化合物。亚基可以通过肽键进行连接。在另一方 面，亚基可以通过其他键(例如酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且 在可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数量方面没有限制。如本文所用，术语“氨基 酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L旋光异构体、氨基酸类似物 和模拟肽。 如本文所用，术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对性术语。因此， 例如纯化的核酸、肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物是与蛋白质或其他污染物全部 或部分分离的。通常，本公开内容中使用的基本上纯化的肽、蛋白质、生物复合物或其他活 性化合物，相对于在该肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲 液、吸收增强剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其他共混物混合或配制成完整的药物制剂用于治 疗给药之前的制剂来说，包含超过其中80％的所有大分子物种。更典型地，在与其他制剂成 分混合之前，将肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物纯化，以代表纯化的制剂中存在 的所有大分子种类的大于90％，通常大于95％。在其他情况下，纯化的制剂可以是基本上均 质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术检测到。 如本文所用，术语“纯化标记”是指至少一种可用于纯化或识别的标记。此标记的 非详尽列表包括：His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、 樱桃红、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5、Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag1、Softag  3、链球菌 或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记包含：FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy5、 Cy5.5、Cy  7、DNP、AMCA、生物素、洋地黄毒苷、Tamra、德克萨斯红、罗丹明、Alexa  fluors、 FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。 如本文所用，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡的基因；非限制性例子包括： HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450或 PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或可诱导的胱天蛋白酶(“iCasp”)。自杀基因可能沿 着多种通路起作用，并且在某些情况下，可以通过例如小分子的诱导剂进行诱导。例如， iCasp自杀基因包含与被优化来结合诱导剂的蛋白可操作地连接的胱天蛋白酶蛋白的一部 分；将诱导剂引入包含自杀基因的细胞中，导致胱天蛋白酶的活化和随后所述细胞的凋亡。 当应用于嵌合抗原受体细胞的生产时，术语“转导”是指将外源核苷酸序列引入细 胞的过程。在一些实施方式中，该转导通过载体来完成。 如本文所用，术语“载体”是指被设计用于在不同宿主之间转移的核酸构建体，包 括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。“载体”被定义为重组产生的病毒或病毒 颗粒，其包含要在体内、离体或体外被递送至宿主细胞的多核苷酸。在一些实施方式中，质 粒载体可以从市售载体中制备。在其他实施方式中，病毒载体可以根据本领域已知的技术 用杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生。在一个实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。 病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体，α病毒载体等。基于传 染性烟草花叶病毒(TMV)的载体可用于制造蛋白质，并且已经报道在烟草叶片中表达 Griffithsin(O'Keefe  et  al.(2009)Proc.Nat.Acad.Sci.USA  106(15):6099-6104)。甲病 毒载体(例如基于Semliki  Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体)也已被开发用于 基因治疗和免疫治疗。参见Schlesinger&Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434- 32 CN 111601882 A 说　明　书 27/77 页 439和Ying  et  al.(1999)Nat.Med .5(7):823-827。在逆转录病毒载体介导基因转移的方 面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分以及目标基因(例如编码CAR的多核苷 酸)的多核苷酸。关于用于基因转移的载体的现代方法的进一步细节可以在例如Kotterman  et  al.(2015)Viral  Vectors  for  Gene  Therapy:Translational  and  Clinical  Outlook  Annual  Review  of  Biomedical  Engineering  17中找到。包含启动子和可将多核苷酸可操 作地连接到其中的克隆位点的载体是本领域众所已知的。这样的载体能够在体外或体内转 录RNA，并且可以从例如Agilent  Technologies(Santa  Clara,Calif.)和Promega  Biotech (Madison,Wis.)的来源购买获得。 如本文所用，术语“T2A”和“2A肽”可互换使用，是指任何2A肽或其片段、任何2A样 肽或其片段、或包含必需氨基酸的人工肽，该必需氨基酸具有共有多肽基序D-V/I-E-X-N- P-G-P的相对短(根据来源的病毒，约20个氨基酸长度)的肽序列，其中X是指通常被认为是 自剪切的任何氨基酸。 如本文所用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术生产的多肽，其中通常将编码 该多肽的DNA插入合适的表达载体中，该表达载体又用于转化宿主细胞以生产异源蛋白质。 如本文所用，术语“可检测标记”是指至少一种能够直接或间接产生可检测信号的 标记。该标记的非穷举列表包括：产生可检测信号(例如通过比色法、荧光、发光)的酶，例如 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光、发 光染料；通过电子显微镜或通过其电学性质(例如电导率、安培法、伏安法、阻抗)可检测到 的电子密度的基团，例如其分子大小足以在其物理和/或化学性质上诱导可检测到的修饰 的基团，可以通过光学方法(例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化)或物理 方法(例如原子力谱、隧道效应)完成检测；或放射性分子(例如32P、35S或125I)。在一方面，可 检测的标记排除天然荧光多核苷酸。 在一方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”是指通过ELISA或其他合适的方 法测量的抗体选择性结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效抗体包括但不限于：结合 至与参比抗体相同的表位的那些抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。 在没有明确叙述的情况下，应当推断出，并且除非另有意图，否则当本公开内容涉 及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物学等效物属于本公开内容的范围内。 如本文所用，术语“其生物等效物”在当指参比蛋白质、抗体、多肽或核酸时旨在与“其等效 物”同义，意指具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能的那些蛋白质、抗体、多肽或核 酸。除非本文具体叙述，否则预期本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效 物。例如，等效物意指至少约70％的同源性或同一性，或至少80％的同源性或同一性，或者 至少约85％、或者至少约90％、或者至少约95％、或者98％的同源性或同一性；并且表现出 与参比蛋白、多肽或核酸基本相等的生物学活性。或者，当提及多核苷酸时，其等效物是在 严格条件下与参比多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸。 与另一序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多 核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)是指在比对时，在进行比较的两个序列中，该 百分比的碱基是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和序列同源性或同一 性百分数，例如《分子生物学实验指南》((Ausubel  et  al.,eds.1987)附录30,7.7.18节,表 7.7.1.1987)。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是使用默认参数的BLAST。 33 CN 111601882 A 说　明　书 28/77 页 特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准，过滤器＝无， 链＝双链；临界值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分； 数据库＝非冗余，GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank  CDS翻译 SwissProtein SPupdate PIR。这些程序的详细信息可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。 如本文所用，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，“同源性”或 “相同”、“同一性”百分比或“相似性”是指两个或更多相同或具有相同的序列或子序列，其 是相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，例如在指定区域上至少60％同一 性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更高的同一性(例如，编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的 氨基酸序列)。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述位置可以为了比较的目 的而被比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源 的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函数。可以使用本领域已 知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分数，例如在《分子生物学实验指南》 ((Ausubel  et  al.,eds.1987)附录30,7.7.18节,表7.7.1。优选地，默认参数用于比对。优 选的比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，优选程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默 认参数：遗传密码＝标准，过滤器＝无，链＝双链，临界值＝60，期望值＝10，矩阵＝ BLOSUM62，描述＝50个序列，排序方式＝高分，数据库＝非冗余，GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank  CDS翻译 SwissProtein SPupdate PIR。这些程序的详细信息可以在以下网址找 到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同”，“同一性”或“相似性”百分 比也指或可用于被测试序列的互补序列。该术语还包括具有缺失和/或添加的序列以及具 有取代的序列。如本文所述，优选算法可以解决间隙等问题。优选地，同一性存在于长度至 少约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选地存在于长度至少50-100个氨基酸或核苷酸的 区域。“无关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中一个共有小于40％的同一性，或小 于25％的同一性。 “杂交”是指一种或多种多核苷酸反应形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键而 稳定的复合物的反应。氢键可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他 序列特异性方式存在。该复合物可以包含形成双链体结构的两条链，形成多链复合物的三 条或更多条链，单一的自杂交链或它们的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一 个步骤，例如PCR反应的启动或核酶对多核苷酸的酶促切割。 严格杂交条件的例子包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x  SSC至约10x  SSC的 杂交缓冲液浓度；约0％至约25％甲酰胺浓度；和约4xSSC至约8xSSC的洗涤溶液。中等杂交 条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x  SSC至约2x  SSC缓冲液浓度；约30％至 约50％甲酰胺浓度；和约5x  SSc至约2x  SSC的洗涤溶液。高严格条件的例子包括：约55℃至 约68℃的孵育温度；约为1x  SSC至约0.1x  SSC缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度； 以及约1x  SSC、0.1x  SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具 有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M  NaCl和15mM柠 檬酸盐缓冲液。应当理解，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。 “对应于癌症组织类型的正常细胞”是指来自与癌症组织相同的组织类型的正常 细胞。非限制性例子是来自患者(例如白血病患者)的正常白细胞。 34 CN 111601882 A 说　明　书 29/77 页 如本文所用，术语“NK细胞”，也称为自然杀伤细胞，是指起一类源于骨髓并在先天 免疫系统中起关键作用的淋巴细胞。即使在细胞表面不存在抗体和主要组织相容性复合物 的情况下，NK细胞也能对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞提供快速的免疫反应。 NK细胞可以是分离的，也可以从商业渠道获得。商业NK细胞系的非限制性例子包括细胞系 NK-92( CRL-2407TM)、NK-92MI( CRL-2408TM)。其他例子包括但不限于NK细胞 系HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT。此类市售细胞系的非限制性示例性来源包括美 国典型培养物保藏中心(或ATCC)(http://www.atcc.org/)和德国微生物和细胞培养物保 藏中心(https://www.dsmz.de/)。 如本文所用，术语“过表达”是指细胞、组织或器官的表达的蛋白质的量大于对照 细胞、对照组织或器官中产生的量。过表达的蛋白质对于宿主细胞来说可以是内源的或外 源的。 如本文所用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码 该多肽的DNA插入合适的表达载体中，该表达载体转而用于转化宿主细胞以产生异源蛋白。 如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体与抗原之间的结合亲和力为至少10-6M。 在某些方面，抗体以至少约10-7M的亲和力结合，优选为10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。 “实体肿瘤”是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或 恶性的，转移性或非转移性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型进行命名。实体 肿瘤的例子包括肉瘤、癌症和淋巴瘤。 与上文列出的GenBank登录号，UniProt参考号和参考文献中的每一个相关的序列 通过引用并入本文。 如本文所用，术语“主要组织相容性复合物”(MHC)是指抗原呈递分子，其充当免疫 系统的一部分以结合抗原和其他肽片段并将它们展示在细胞表面上用于通过抗原识别分 子(例如TCR)来识别。当提及人MHC使用时，MHC可与术语“人类白细胞抗原”(HLA)互换使用； 因此，MHC是指所有HLA亚型，除了其所有变体、同工型、同种型及其他生物学等效物之外，还 包括但不限于本文所公开的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA- DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。MHC  I类(MHC-I)和MHC  II类(MHC-II)分子利用不同 的抗原加工途径。通常，源自细胞内抗原的肽通过在几乎所有细胞上表达的I类MHC分子呈 递给CD8 T细胞，而源自细胞外抗原的肽则通过MHC-II分子呈递给CD4 T细胞。但是，已经发 现了这种二分法的几个例外。在本文所公开的某些实施方式中，特定的抗原、肽和/或表位 在合适的I类或II类MHC蛋白的背景下被识别并呈递在抗原-MHC复合物中。可以评估对象的 遗传组成以确定哪个MHC等位基因适合于具有特定抗原集合的特定患者、疾病或病况。在小 鼠中，MHC基因被称为组织相容性2(H-2)基因。鼠类经典的MHC  I类亚型包括H-2D、H-2K和H- 2L。鼠类非经典MHC  I类亚型包括H-2Q、H-2M和H-2T。鼠类经典的MHC  II类亚型包括H-2A(I- A)和H-2E(1-E)。非经典鼠类MHC  II类亚型包括H-2M和H-2O。犬MHC分子被称为犬白细胞抗 原(DLA)。猫MHC分子被称为猫白细胞抗原(FLA)。在一些实施方式中，选择直系同源或同源 MHC分子以将涉及特定抗原-MHC复合物的疗法或治疗从一种物种过渡到不同物种。 如本文所用，短语“免疫应答”或其等效的“免疫学应答”指细胞介导(例如由抗原 特异性T细胞或其分泌产物介导的)的应答的发展。呈递与I类或II类MHC分子结合的多肽表 位可引发细胞免疫应答，以治疗或预防病毒感染，扩展抗原特异性Breg细胞、TC1、CD4 T辅 35 CN 111601882 A 说　明　书 30/77 页 助细胞和/或CD8 细胞毒性T细胞和/或由疾病产生的、自调节性T细胞和B细胞“记忆”细胞。 该应答还可能涉及其他组分的激活。在一些方面，术语“免疫应答”可用于包含免疫细胞的 调节网络的形成。因此，术语“调节网络形成”可以指所引起的免疫反应，因而免疫细胞(优 选为T细胞，更优选为T调节细胞)触发其他免疫细胞的进一步分化，其他免疫细胞例如是， 但不限于，B细胞或抗原呈递细胞(非限制性例子包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)。 在某些实施方式中，调节网络的形成涉及将B细胞分化为调节B细胞。在某些实施方式中，调 节网络的形成涉及致耐受性抗原呈递细胞的形成。 “免疫细胞”包括由造血干细胞(HSC)产生的所有细胞，包括但不限于HSC、白血细 胞(白细胞)、淋巴细胞(包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)和骨髓来源的细胞(嗜中性 粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。“白细胞”包括但 不限于淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。 本文所用的术语“炎症反应”和“炎症”表示个体或对象的免疫细胞、体液因子和血 管组织对例如病原体、受损细胞或刺激物等外源或内源性刺激和/或例如促炎细胞因子的 炎症信号的复杂生物反应。炎性反应包括细胞因子的分泌，并且更特别地是促炎性细胞因 子的分泌，即主要由活化的免疫细胞产生并参与炎症反应放大的细胞因子。示例性促炎细 胞因子和趋化因子包括但不限于IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-8、IL-6、IL-12、IL-15、IL-16、 IL-17(包括家族成员IL17A、IL17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F)、IL-18、GM-CSF、IL- 21、IL-23、IL-27和TGF-β。示例性抗炎细胞因子包括但不限于TGF-β、IL-1Rα、IL-4、IL-6、 IL-10、IL-11、IL-13、IL-35、INF-α。细胞因子可能根据特定的生物学环境具有促炎或抗炎 特性(Cavaillon,J.M(2001)Cell  Mol.Biol  47(4):695-702)。示例性的炎症包括急性炎症 和慢性炎症。急性炎症指特征在于由于通过血浆和白细胞浸润组织引起的典型炎症的迹象 (肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失)的短期过程。只要存在伤害性刺激，通常就会发生急性 炎症，一旦刺激被疤痕(纤维化)移除、破坏或被隔离，刺激就会停止。慢性炎症指以特征在 于同时发生的活动性炎症、组织破坏和修复尝试的病况。慢性炎症的特征不在于上文所列 急性炎症的典型症状。相反，慢性发炎的组织的特征在于单核免疫细胞(单核细胞、巨噬细 胞、淋巴细胞和浆细胞)的浸润，组织破坏和愈合尝试，包括血管生成和纤维化。在本发明的 意义上，可以通过影响并且特别是抑制个体中形成与炎症相关的复杂生物反应的任何事件 来抑制炎症。 “自身免疫性疾病或病症”包括由个人自身的组织或器官引起的、或针对个人自身 的组织或器官的疾病或病症，或其表现形式，或由此导致的病症。在一个实施方式中，它是 指由与正常身体组织和抗原反应的T细胞产生引起的病症或由其加重的病症。自身免疫性 疾病或的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎，例如急性关节炎、慢性类风湿性关节 炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行 性关节炎，II型胶原蛋白诱发性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病 关节炎、斯蒂尔氏病、椎骨关节炎和青少年型类风湿性关节炎、骨关节炎，慢性关节炎 (arthritis  chronica  progrediente)、变形性关节炎、慢性多发性关节炎(polyarthritis  chronica  primaria)、原发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)；炎性过度增殖性皮 肤疾病，牛皮癣(如斑块状牛皮癣、古塔特牛皮癣、脓疱型牛皮癣和指甲的牛皮癣)；特应性 疾病，包括例如花粉症和乔布斯综合症等特应性疾病；皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性 36 CN 111601882 A 说　明　书 31/77 页 皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹状皮炎、numerical皮炎、脂溢性皮 炎、非特异性皮炎、原发性接触性皮炎和特应性皮炎；x连锁性高IgM综合征；过敏性眼内炎 性疾病；荨麻疹，例如慢性变应性荨麻疹和包括慢性自身免疫性荨麻疹的慢性特发性荨麻 疹；肌炎，多发性肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎；中毒性表皮坏死症；硬皮病(包括全身性硬皮 病)，例如全身性硬化症的硬化症，例如旋光性MS的多发性硬化症(MS)、原发性进行性MS (PPMS)和复发缓发性MS(RRMS)、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、弥散性硬 化症、共济失调性硬化症、视神经脊髓炎光谱症(NMO，也称为Devic病或Devic综合征)；炎性 肠病(IBD)(例如，克罗恩病，自身免疫介导的胃肠道疾病，结肠炎例如溃疡性结肠炎的炎、 溃疡性结肠炎、微观性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉性结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性 结肠炎，以及自身免疫性炎症性肠病)，肠炎；脓性脓皮病；结节性红斑；原发性硬化性胆管 炎；呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸道综合征窘迫综合征(ARDS)；脑膜炎；全部或部 分葡萄膜炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液病；类风湿性脊柱炎，类风湿性滑膜炎； 遗传性血管性水肿；颅神经损伤，如脑膜炎；疱疹性妊娠，天疱疮妊娠、阴囊炎、自身免疫性 卵巢早衰；由于自身免疫性疾病导致的突然听力下降；IgE介导的疾病，例如过敏反应、变应 性和特应性鼻炎；脑炎，例如拉斯穆森氏脑炎和边缘和/或脑干脑炎；葡萄膜炎，例如前葡萄 膜炎、急性前路葡萄膜炎，肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、吞噬抗原性葡萄膜炎、 后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜；患有或不患有肾病综合症(GN)例如慢性或急性肾小球肾 炎，例如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病，包 括I型和II型放入膜性或膜性增生性GN(MPGN)，以及进程快速的GN，增生性肾炎，自身免疫 性多腺内分泌衰竭；包皮炎；包皮龟头炎；包皮龟头炎；环状红斑；多发性红斑性红斑，红斑， 环形肉芽肿，地衣针，萎缩性硬萎病，萎缩性地衣，慢性扁平苔藓，扁平苔藓，扁平苔藓，层状 鱼鳞病，表皮溶解性角化过度，恶变前角化病，坏疽性脓皮病，过敏性疾病和反应，变态反应 性过敏，湿疹，湿疹，湿疹湿疹，肌营养不良性湿疹和水泡掌跖湿疹，哮喘(如支气管哮喘，支 气管哮喘和自身免疫性哮喘)，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的疾病，针对外源抗原(如妊 娠期间胎儿ABO血型的免疫反应)，慢性肺炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附不足， 狼疮，包括狼疮肾炎，狼疮性脑炎，小儿狼疮，非肾性狼疮，肾外性狼疮，盘状狼疮和盘状红 斑狼疮，红斑狼疮，脱发性狼疮，系统性红斑狼疮(LE)皮肤SLE或亚急性皮肤SLE，新生儿狼 疮综合征(NLE)和红斑狼疮，I型糖尿病，II型糖尿病，成人潜伏性自身免疫性糖尿病(或1.5 型糖尿病)。还考虑了与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应，结节病，肉 芽肿病(包括淋巴瘤肉芽肿)，韦格纳肉芽肿，粒细胞缺乏症，血管炎包括血管炎，大血管血 管炎(包括多发性肌痛))，中型血管炎(包括川崎病和结节性多发性结节/结节性动脉炎)， 显微镜下的多发炎，免疫性脉管炎，中枢神经系统脉管炎，皮肤性脉管炎，超敏性血管炎，坏 死性脉管炎，例如全身性坏死性血管炎，Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)和与ANCA相 关的小血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯阳性贫血， Diamond  Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血 (AIHA)，艾迪生氏病，自身免疫性中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及 白细胞透析的疾病，CNS炎性疾病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多器官损伤综合症，例如 继发于败血病，创伤或出血的那些，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗 磷脂抗体综合症，抗磷脂综合症，过敏性神经炎，贝塞特氏病/综合症，卡斯曼综合症，古德 37 CN 111601882 A 说　明　书 32/77 页 帕斯氏综合症，雷诺氏综合症，舍格伦氏综合症，史蒂文斯-约翰逊综合症，类天疱疮如类天 疱疮，类天疱疮，(包括寻常性天疱疮，叶蝇天疱疮，天疱疮粘液膜天疱疮和红斑天疱疮)，自 身免疫性多发性内分泌病，雷特氏病或综合症，热损伤，先兆子痫，免疫性复杂性疾病如免 疫性复杂性肾炎，免疫性复杂性肾炎，抗体介导的肾炎，IgM多神经病等神经病哮喘或IgM介 导的神经病，自身免疫或免疫介导的血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)， 包括慢性或急性ITP，后天性血小板减少性紫癜，巩膜炎，例如特发性角膜-巩膜炎，巩膜炎， 自身免疫性疾病(包括睾丸和卵巢)睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺 功能低下，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎，例如自身免疫性甲状腺炎，桥本氏病，慢 性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺 功能低下，Graves病，多腺综合征等(或多腺内分泌病综合征)，副肿瘤综合征，包括神经系 统副肿瘤综合征，例如Lambert-Eaton重症肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征，僵硬人 或僵硬人综合征，脑脊髓炎，例如过敏性脑脊髓炎或脑脊髓炎变应性和实验性变应性脑脊 髓炎(EAE)，重症肌无力，如胸腺瘤相关的重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，肌阵挛或 肌阵挛性肌阵挛综合征(OMS)，以及感觉神经病，多灶性运动神经炎，自身免疫性肝炎， Sheehan氏综合症，类脂性肝炎，巨细胞肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝 炎，淋巴性间质性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)vs  NSIP，格林-巴利综合征，伯杰 氏病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性发热性嗜中性粒细胞性皮肤病，角膜 下脓疱性皮肤病，短暂性棘皮病性皮肤病，肝硬化(如原发性胆汁性肝硬化和肺炎性肝炎)， 自身免疫性肠病综合征，腹腔或乳糜泻，腹腔灌流性鼻窦炎(麸质肠病)，顽固性肠病，低温 球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou  Gehrig氏病)，自身免疫性耳部疾病，例如自身 免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性听力损失，多发性软骨炎(例如难治性或复发性或复发 性多软骨炎)，肺泡肺泡蛋白沉着症，科根氏综合症/非梅毒间质性角膜炎，贝尔氏麻痹，糖 尿综合症/综合征，酒渣鼻自身免疫，带状疱疹相关性疼痛，淀粉样变性，非癌性淋巴细胞增 多，原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病 和意义不明的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病变，副肿瘤综合征，癫痫，偏头痛，心 律不齐，肌肉疾病，耳聋，失明，失明，周期性麻痹和中枢神经系统的通道病，自闭症，炎症性 肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)等通道病，内分泌性眼病，葡萄膜 视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝炎疾病，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综 合征，肾上腺炎，胃萎缩，早衰性痴呆，脱髓鞘疾病，例如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎症 性脱髓鞘性多发性神经病，德勒斯勒综合征，巨大脱发，总脱发，CREST综合征(钙化，食道运 动障碍，硬化症和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育，例如由于抗精子虫抗体，混 合性结缔组织病，恰加斯病，风湿热，反复流产，农民的肺部，多形性红斑，心脏切开术后综 合征，库欣氏综合症，鸟类爱好者的肺，过敏性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿 尔波特氏综合症，过敏性肺泡炎和纤维化性肺泡炎等肺炎，间质性肺病，输血反应，麻风病， 疟疾，寄生虫病，诸如血吸虫病等，曲霉病，Sampter氏综合征，Caplan氏综合征，登革热，心 内膜炎，心内膜纤维化，弥漫性间质性肺纤维化，间质性肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维 化，囊性纤维化，眼内炎，红斑增高等症，线粒体化，胎儿红细胞增多症Felty氏综合症，丝虫 病(flariasis)，诸如慢性睫状体炎，异时性睫状体炎，虹膜睫状体炎(急性或慢性)等睫状 体炎或Fuch氏睫状体炎，过敏性紫癜，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷 38 CN 111601882 A 说　明　书 33/77 页 综合症(AIDS)，回波病毒感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺功能亢进症，细小病毒 感染，风疹病毒感染，疫苗接种后综合症，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔病毒感染，腮腺 炎，埃文氏综合症，自身免疫性腺功能衰竭，Sydenham氏舞蹈症，链球菌性肾炎，血栓性血管 炎，泛滥，甲状腺毒症，背侧小肠，慢性脉络膜炎，gianT细胞多变性干燥性角结膜炎，流行性 角膜结膜炎，特发性肾病综合征，微小病变性肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器 官的再灌注，视网膜自身免疫，关节发炎，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺疾病，矽肺，口疮， 口腔溃疡，动脉硬化症，无精子症，自身免疫性溶血，博克氏病，冷球蛋白血症，杜普耶氏挛 缩症，眼内吞噬性眼炎，肠炎变应原，结节性红斑麻风，特发性面瘫，慢性疲劳综合征，风湿 热，Hamman-Rich氏病，感音性耳聋，性腺机能减退，区域性回肠炎，白细胞减少症，传染性单 核细胞增多症，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎，睾丸炎肉芽肿， 胰腺炎，多发性放射神经炎，非结节性脓疱性肌萎缩症，非后天性小肌萎缩症，后天体变质 症，潮红毒性休克综合症，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾病，白细胞粘附缺乏，由细胞因子 和T淋巴细胞介导的与急性和迟发型超敏反应有关的免疫反应，涉及白细胞透析的疾病，多 器官损伤综合症，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，过敏性神经炎，自身 免疫性多发性内分泌病，卵泡炎，原发性粘液性水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎， 风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛素岛炎，多内分泌衰竭，自身免疫性多腺 综合征I型，成人发作性特发性甲状旁腺功能低下(AOIH)，心肌病，如扩张型心肌病，大疱表 皮性大疱性水肿(EBA)，血色素沉着症，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性 或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，额叶，上颌或蝶窦炎，嗜酸性粒细胞相关疾病，例如 嗜酸性粒细胞增多，肺部浸润嗜酸性粒细胞增多，嗜酸性粒细胞肌痛综合征，洛夫勒氏综合 症，慢性嗜酸性粒细胞性肺炎，热带性肺嗜酸性粒细胞增多症，支气管肺炎性曲霉菌性嗜酸 粒细胞增多症，含曲霉菌，血清阴性脊椎侧关节炎，多内分泌自身免疫性疾病，硬化性胆管 炎，巩膜，上巩膜，慢性粘膜皮肤念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿的短暂性低球蛋白血症， Wiskott-Aldrich综合征，共济失调性毛细血管扩张综合征，血管扩张，伴有自身免疫性风 湿病，自身免疫性疾病，淋巴结炎，血压降低，血管功能障碍，组织损伤，痛觉过敏，肾缺血， 脑缺血以及伴随血管生成的疾病，过敏性超敏反应，肾小球磷脂，再灌注损伤，淋巴瘤性气 管支气管炎，炎症性皮肤病，具有急性炎症成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质 坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病，眼和眼眶炎性疾病，粒细胞输血相 关综合征，细胞因子诱导的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性顽固性炎症，肾炎，动脉 内膜增生，消化性溃疡，瓣膜炎，肺气肿，斑秃，II型脂肪组织炎症/糖尿病，肥胖相关的脂肪 组织炎症/胰岛素抵抗和子宫内膜异位。 应用于产生修饰的细胞(例如嵌合抗原受体细胞)的方法的术语“引入”指将外源 (即外源或细胞外)试剂引入宿主细胞从而产生包含外源试剂的细胞的过程。引入核酸的方 法包括但不限于转导、逆转录病毒基因转移、转染、电穿孔、转化、病毒感染和本领域已知的 其他重组DNA技术。在一些实施方式中，转导通过载体(例如病毒载体)完成。在一些实施方 式中，转染通过化学载体、DNA/脂质体复合物或胶束(例如Lipofectamine,Invitrogen)完 成。在一些实施方式中，病毒感染通过用包含目的多核苷酸的病毒颗粒(例如AAV)感染细胞 来完成。在一些实施方式中，引入还包含CRISPR介导的基因编辑或类转录激活因子效应物 核酸酶(TALEN)介导的基因编辑。引入非核酸外源试剂(例如可溶性因子、细胞因子、蛋白 39 CN 111601882 A 说　明　书 34/77 页 质、肽、酶、生长因子、信号传导分子、小分子抑制剂)的方法包括但不限于在外源试剂存在 下培养细胞，使细胞与试剂接触，使细胞与包含试剂和赋形剂的组合物接触，以及使细胞与 包含试剂的囊泡或病毒颗粒接触。 术语“培养”是指在有利于细胞扩增和增殖的条件下在培养基中使T细胞生长。术 语“培养基”在本领域中是公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制剂。当用 于细胞培养时，术语“培养基”包括细胞周围环境的组份。培养基可以是固体、液体、气体或 各种相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。 培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性的气体介质 包括气相，使在培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞暴露于该气相。术语“培养 基”还指旨在用于细胞培养的材料，即使该物质与细胞未接触。换句话说，被制备用于培养 的富含营养的液体是培养基。类似地，当与水或其他液体混合后适合用于细胞培养的粉末 混合物可以称为“粉状培养基”。“确定的培养基”是指由化学成分确定的(通常是纯化的)成 分制成的介质。“确定的培养基”不包含未充分表征的生物提取物，例如酵母提取物和牛肉 汤。“丰富的培养基”包括被设计来支持特定物种的大多数或所有可行形式的生长的培养 基。“丰富的培养基”通常包含复杂的生物提取物。“适合于高密度培养物生长的培养基”是 当其他条件(例如温度和氧气传输速率)允许细胞培养物达到OD600为3或更高的任何培养 基。术语“基础培养基”是指促进许多类型的微生物生长的培养基，不需要任何特殊的营养 补充剂。大多数基础培养基通常包含四个基本化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维 生素。基础培养基通常用作更复杂培养基的基础，向其中添加了补充剂，例如血清、缓冲液、 生长因子、脂质等。在一方面，生长培养基可以是具有必需生长因子的复杂培养基，以支持 本发明细胞的生长和扩增，同时保持其自我更新能力。基础培养基的例子包括但不限于 Eagles基础培养基、最低必需培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、培养基199、营养混合 物Ham's  F-10和Ham's  F-12、McCoy氏5A、Dulbecco氏MEM/FI  2，RPMI  1640以及Iscove氏改 良Dulbecco培养基(IMDM)。 “低温保护剂”是本领域已知的，并且包括但不限于例如蔗糖、海藻糖和甘油。通常 使用在生物系统中表现出低毒性的冷冻保护剂。 用于实施本发明的方式 为了鉴定在实体肿瘤中导致CAR  T细胞功能减弱的转录调控因子和其他调控因 子，开发了小鼠模型，其中携带表达huCD19抗原的鼠黑色素瘤的受体小鼠被过继转移 huCD19反应性CAR  T细胞。低效应子功能和抑制性表面受体PD-1和TIM3高表达的CD8 表达 CAR肿瘤浸润性T细胞(CAR  TIL)和内源性TIL表现出相似的基因表达和染色质可及性图谱， 通过起始转录因子NFAT(活化T细胞的核因子)16-18，其与三个Nr4a(核受体亚家族4组)的转 录因子Nr4a1(Nur77)、Nr4a2(Nurr1)和Nr4a3(Nor1)的次级激活相关。通过对来自人类CD8 TIL19 ,20和来自具有慢性感染的人类的病毒抗原特异性CD8 T细胞21的数据进行类似比较， 观察到Nr4a转录因子的高表达和Nr4a结合基序在独特的染色质区域中的富集。与过继转移 了Nr4a充足(WT)CAR  T细胞的小鼠相比，用缺失所有三种Nr4a转录因子(Nr4a  TKO)的CAR  T 细胞治疗荷瘤小鼠会导致肿瘤消退并延长生存期。Nr4a  TKO  CAR  TIL表现出CD8 效应T细 胞特征性的表型和基因表达图谱，与野生型相比，Nr4a  TKO  CAR  TILs中独特地可及的染色 质区域富集了经典参与T细胞活化的转录因子的结合基序。如本文所述，Nr4a转录因子被识 40 CN 111601882 A 说　明　书 35/77 页 别为T细胞低反应性的细胞内在程序中的主要参与者，并且指出Nr4a抑制是癌症免疫疗法 的有前途的策略。 工程化的免疫细胞 为此，本发明提供了被工程化以减少或消除NR4A转录因子在细胞中的表达和/或 功能的细胞。在一方面，细胞被工程化以减少或消除细胞中NR4A转录因子的表达和/或功 能，其中NR4A转录因子包含NR4A1(Nur77)、NR4A2(Nurr1)或NR4A3(NOR1)中一个、两个或全 部三个，或基本上其组成，或由其组成。与野生型细胞相比，表达可以被减少至少10％或更 多、或20％或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或85％、或90％、或95％、或 99％、或100％。细胞的非限制性例子是免疫细胞，例如T细胞和NK细胞。 在另一方面，细胞被工程化以减少或消除该细胞中的NR4A转录因子的表达和/或 功能，其包含表1和/或表2所示的基因表达图谱，或基本上由其组成，或由其组成。与野生型 细胞相比，表达可以减少至少10％或更多、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或 70％、或80％、或85％、或90％、或95％、99％或100％。细胞的非限制性例子是免疫细胞，例 如T细胞和NK细胞。 本发明还提供了被工程化以减少或消除细胞中TOX转录因子的表达和/或功能的 细胞。在一方面，细胞被工程化以减少或消除TOX转录因子的表达和/或功能，其中TOX转录 因子包含TOX1、TOX2、TOX3或TOX4，或基本上由其组成，或其组成。在另一方面，细胞被工程 化来减少或消除TOX1、TOX2、TOX3或TOX4中的两个或更多个的表达和/或功能。在另一方面， 细胞被工程化以减少或消除TOX1、TOX2、TOX3或TOX4中的四种的表达和/或功能。与野生型 细胞相比，表达可以减少至少10％或更多、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或 70％、或80％、或85％、或90％、或95％、99％或100％。细胞的非限制性例子是免疫细胞，例 如T细胞和NK细胞。 本发明还提供了被工程化以减少或消除所述免疫细胞中NR4A和TOX转录因子的表 达和/或功能的免疫细胞。在一方面，免疫细胞被工程化以减少或消除所述免疫细胞中NR4A 和TOX转录因子的表达和/或功能；其中NR4A转录因子包含NR4A(Nur77)、NR4A2(Nurr1)或 NR4A3(NOR1)，或基本上由其组成，或由其组成；其中TOX转录因子包含TOX1、TOX2、TOX3或 TOX4，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，其中免疫细胞被工程化以减少或消除 NR4A1(Nur77)、NR4A2(Nurr1)和NR4A3(NOR1)中两个或多个、或三个或多个的表达和/或功 能。或者，该细胞可以被工程化以减少一种、两种、三种或全部四种TOX因子，以及所有四种 NR4A转录因子中的一种、两种、三种。与野生型细胞相比，表达可以减少至少10％或更多、或 20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或85％、或90％、或95％、或99％、或 100％。 本发明还提供了被工程化以减少或消除NR4A和TOX转录因子的表达和/或功能(如 上所述并通过引用并入此处)并增加所述T细胞中IL-21的表达的免疫细胞。如本文所用，术 语“IL-21”(白介素21)指具有免疫调节活性的细胞因子的共同γ链家族的成员。非限制性 例子是由SEQ  ID  NO：10所提供的序列编码的人类IL-21。与比较野生型相比，表达增加包括 例如至少约2％、或约5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少100％或更多、或 150％、或200％、或250％、或300％、或350％、或400％、或450％、或500％、或550％、或 600％、或650％、或700％。 41 CN 111601882 A 说　明　书 36/77 页 本文还提供被工程化以抑制免疫细胞中NFAT/AP-1通路的表达和/或功能的所述 免疫细胞。与野生型细胞相比，表达可以减少至少10％或更多或20％、或30％、或40％、或 50％、或60％、或70％、或80％、或85％、或90％、或95％、或99％、或100％。 如本文所用，术语“抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能”指减少或消除该通路中 基因的转录，或减少或消除所述mRNA翻译成通路径肽、多肽或蛋白质，或减少或消除所述通 路的肽、多肽或蛋白质的功能。抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能的非限制性例子包括 抑制NR4A转录因子和/或TOX转录因子的和/或功能，或增加IL-21的表达。与野生型细胞相 比，表达增加包括例如至少约2％、或约5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少 100％或更多、或150％、或200％、或250％、或300％、或350％、或400％、或450％、或500％、 或550％、或600％、或650％、或700％或更多。 本领域的技术人员可以使用例如RNA测序、DNA微阵列、实时PCR或染色质免疫沉淀 (ChIP)等方法来监测转录因子的表达。可以使用例如流式细胞术、免疫印迹、二维凝胶电泳 或免疫测定等方法来监测蛋白质的表达。 [0200] 本领域技术人员可以使用例如RNA干扰(RNAi)、CRISPR、TALEN、ZFN或靶向特定序 列以减少或消除NR4A或TOX转录因子的表达和/或功能的其他方法。CRISPR、TALEN、ZFN或其 他基因组编辑工具也可以用于增加IL-21的表达和/或功能。 [0201] 可以从宿主或培养的免疫细胞中分离细胞。这样的非限制性样品包括如本发明所 定义的哺乳动物和人类细胞。在一方面，免疫细胞是NK细胞或T细胞。当用于治疗时，它们对 于被治疗的对象可以是自体的或同种异体的。为了本发明的目的，“T细胞”包括表达CD3的 所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4 细胞)、细胞毒性T细胞(CD8 胞)、自然杀伤T细 胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞和 嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子 包括：BCL2(AAA)Jurkat( CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat( CRL-2900TM)、 BCL2(S87A)Jurkat( CRL)-2901TM)、BCL2Jurkat( CRL-2899TM)、Neo  Jurkat( CRL-2898TM)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC#CRL-11386)。其他例子包括但 不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT  78、HUT  102、Karpas  384、Ki  225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；和未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL，Be13，CCRF-CEM， CML-T1，DND-41，DU.528，EU-9，HD-Mar，HPB-ALL，H-SB2，HT-1，JK-T1，Jurkat，Karpas  45， KE-37，KOPT-K1，K-T1，L-KAW，Loucy，MAT，MOLT-1,MOLT  3,MOLT-4,MOLT  13,MOLT-16,MT-1, MT-ALL,P12/Ichikawa,Peer,PER0117,PER-255,PF-382,PFI-285,RPMI-8402,ST-4,SUP-T1 至T14,TALL-1 ,TALL-101 ,TALL-103/2,TALL-104 ,TALL-105,TALL-106,TALL-107 ,TALL- 197 ,TK-6 ,TLBR-1、-2、-3和-4 ,CCRF-HSB-2(CCL-120 .1) ,J .RT3-T3 .5(ATCC  TIB-153) , J45.01(ATCC  CRL-1990) ,J.CaM1.6(ATCC  CRL-2063) ,RS4；11(ATCC  CRL-1873) ,CCRF-CEM (ATCC  CRM-CCL-119)；和皮肤T细胞淋巴瘤细胞系,例如HuT78(ATCC  CRM-TIB-161)、MJ [G11](ATCC  CRL-8294)、HuT102(ATCC  TIB-162)。无白血病细胞系，包括但不限于REH、 NALL-1、KM-3、L92-221，是另一种可商业上可获得的免疫细胞来源，其衍生自其他白血病和 淋巴瘤，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红细胞白血病、HL60白 血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可购买的细胞系的非限制性示 例性来源包括美国典型培养物保藏中心(或ATCC)(http://www.atcc.org/)和德国微生物 42 CN 111601882 A 说　明　书 37/77 页 和细胞培养物保藏中心(https://www .dsmz.de/)。这些细胞可以来自任何多细胞脊椎动 物，例如哺乳动物和鸟类。术语“哺乳动物”包括人类和非人类哺乳动物，例如牛、犬、猫、大 鼠、鼠类、猿猴、马和人类。其他例子包括成人、少年和婴儿。 [0202] 在一些实施方式中，本发明的工程免疫细胞是CD8  T细胞。在其他实施方式中，本 发明的工程免疫细胞是CD3细胞、T辅助细胞(CD4 胞)、自然杀伤(NK)T细胞、T调节细胞 (Treg)、γ-δT细胞或嗜中性粒细胞。 [0203] 在一些实施方式中，上述工程化的免疫细胞表达结合肿瘤抗原或由病原体表达的 抗原的受体。在其他实施方式中，上述工程化T细胞表达与肿瘤抗原结合的受体，其中该肿 瘤抗原包含间皮素、ROR1或EGFRvIII，A型肝配蛋白受体2(EphA2)、白介素(IL)-13rα2、EGFR  VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩藻糖基GM1、PSCA、PLAC1、肉瘤断点、Wilms肿瘤1、血液学分化抗 原、表面糖蛋白、神经节苷脂(GM2)、生长因子受体、基质抗原、血管抗原或其组合，或基本上 由其组成，或由其组成。 [0204] 在特定的实施方式中，本发明的工程化的免疫细胞，其中还包含自杀基因，或基本 上由自杀基因组成，或由自杀基因组成。如本文所用，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡 的基因；非限制性例子包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、 羧酸酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或诱导型胱天蛋白酶 (“iCasp”)。自杀基因可能沿着多种通路起作用，并且在某些情况下，能够通过例如小分子 的诱导剂进行诱导。 [0205] 在一方面，本发明的工程化的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合 抗原受体(CAR)组成，或由嵌合抗原受体(CAR)组成，因此，工程化细胞是CAR细胞。因此，本 发明的工程化的免疫细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合抗原受体(CAR) 组成，或由嵌合抗原受体(CAR)组成，其中CAR还包含以下组分、或基本上由以下组分组成， 或由以下组分组成：(a)抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；和(d)细胞内结 构域。 [0206] 在一方面，本发明的工程化的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合 抗原受体(CAR)组成，或由嵌合抗原受体(CAR)组成，其中嵌合抗原受体(CAR)包括以下组 分、或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：(a)抗CD19结合结构域；(b)铰链结构域； (c)CD28或CD8α跨膜结构域；(d)选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区 域、ICOS共刺激信号传导区域和OX40共刺激区域中的一个或多个共刺激区域；和(e)CD3ζ信 号传导结构域。以下序列仅是可用于制备如本文所述的细胞的示例性序列： [0207] 铰链结构域：IgG1重链铰链多核苷酸序列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCG，及可选的其等价物。 [0208] 跨膜结构域：CD28跨膜区域多核苷酸序列：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCT GGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG，以及可选的等效物。 [0209] 细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域核苷酸序列：AAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTC CAGAAGAAGAAGAAGGAGAGGATGTGAACTG，以及可选的等效物。 [0210] 细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域核苷酸序列：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCC TGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGGCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACC 43 CN 111601882 A 说　明　书 38/77 页 ACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC，以及可选的等效物。 [0211] 细胞内结构域：CD3ζ信号传导区多核苷酸序列：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACG CCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTT GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAAT GAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCC TCGCTAA，和可选的等效物。 [0212] 每个示例性结构域组分的其他实施方式包括：具有相似生物学功能的其他蛋白 质，其与由上文所公开核酸序列编码蛋白有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性，优 选为90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列同一性。此外，本文提供了此类结构域的 非限制性例子。 [0213] 能够结合抗原的CAR细胞外结构域的非限制性例子是如US20140271635申请中所 公开，特异性结合CD19抗原的抗CD19结合域序列。因此，多核苷酸将编码该结合结构域。 [0214] 如本文所用，术语“CD8α铰链结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和具有 相似生物功能的任何其他分子，该分子与如本文所示的CD8α铰链结构域序列具有至少70％ 或至少80％的氨基酸序列同一性，优选为90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列同 一性。Pinto,R.D.et  al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177提供了人类、小 鼠 和其他物种的C D 8α铰链结构域的示例序列。Pi n t o ,R .D .e t  a l .( 2 0 0 6) Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177提供了与CD8α铰链结构域相关的序列。这样的非 限制性例子包括： [0215] 人类CD8α铰链结构域氨基酸序列：PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAV HTRGLDFACDIY，以及可选的其等效物。 [0216] 小鼠CD8α铰链结构域氨基酸序列：KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKG TGLDFACDIY，以及可选的其等效物。 [0217] 猫CD8α铰链结构域氨基酸序列：PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEA SGLDLSCDIY及可选的其等效物。 [0218] 因此，编码这些肽的多核苷酸包含在编码CAR的多核苷酸内。 [0219] 如本文所用，术语“CD8α跨膜结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和具有 相似生物功能的任何其他分子，该分子与如本文所示CD8α跨膜结构域序列具有至少70％或 至少80％的氨基酸序列同一性，优选为具有90％的序列同一性，更优选为至少95％的序列 同一性。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank登录号：NP_001759.3)的氨基酸第183至 203位置相关的片段序列、或与小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank登录号：NP_ 001074579.1)的第197至217位氨基酸相关的片段序列，以及与大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α 链(GenBank登录号：NP_113726.1)的第190至210位氨基酸相关的片段序列提供了CD8α跨膜 结构域的其他示例序列。与列出的每个登录号相关的序列如下： [0220] 人类CD8α跨膜结构域氨基酸序列：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT，及可选的其等效物。 [0221] 小鼠CD8α跨膜结构域氨基酸序列：IWAPLAGICVALLLSLIITLI，及可选的其等效物。 [0222] 大鼠CD8α跨膜结构域氨基酸序列：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI，及可选的其等效物。 [0223] 因此，编码这些肽的多核苷酸包含在多肽内。 44 CN 111601882 A 说　明　书 39/77 页 [0224] 如本文所用，术语“CD28跨膜结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和具有 类似生物学功能的任何其他分子，所述分子与如本文所示CD28跨膜结构域序列具有至少 70％或至少80％的氨基酸序列同一性，至少具有90％的序列同一性，或至少95％的序列同 一性。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列提供了CD28跨 膜结构域的其他非限制性示例序列。 [0225] 如本文所用，术语“4-1BB共刺激信号传导区”是指与此名称相关的特定蛋白质片 段和具有相似生物功能的任何其他分子，该分子与如本文所示4-1BB共刺激信号传导区序 列具有至少70％或至少80％氨基酸序列同一性、优选具为90％的序列同一性，更优选为至 少95％的序列同一性。在美国公开20130266551A1(作为美国专利申请号13/826,258提交) 提供了4-1BB共刺激信号传导区域的非限制性示例序列，例如下述提供的示例性序列。 [0226] 4-1BB共刺激信号传导区域氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCEL，以及可选的其等效物。因此，编码该序列的多核苷酸被编码在该多核苷酸内。 [0227] 如本文所用，术语“ICOS共刺激信号传导区域”指与此名称相关的特定蛋白质片段 和具有相似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示ICOS共刺激信号传导区域序 列具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，优选具有90％的序列同一性，更优选至 少95％的序列同一性。美国专利申请公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导 区域的非限制性示例序列，在下面提供的示例性多核苷酸序列。 [0228] ICOS共刺激信号传导区域的多核苷酸序列：ACAAAAAAGA  AGTATTCATC  CAGTGTGCAC  GACCCTAACG  GTGAATACAT  GTTCATGAGA  GCAGTGAACA  CAGCCAAAAA  ATCCAGACTC  ACAGATGTGA  CCCTA，以及可选的其等效物。 [0229] 如本文所用，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与此名称相关的特定蛋白质片 段和具有相似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示OX40共刺激信号传导区域 序列具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或至少95％的 序列同一性。OX40共刺激信号传导区域的非限制性示例序列在美国专利申请公开号2012/ 20148552A1中公开，并且包括以下提供的示例性序列。 [0230] OX40共刺激信号传导区域的多核苷酸序列：AGGGACCAG  AGGCTGCCCC  CCGATGCCCA  CAAGCCCCCT  GGGGGAGGCA  GTTTCCGGAC  CCCCATCCAA  GAGGAGCAGG  CCGACGCCCA  CTCCACCCTG  GCCAAGATC，以及可选的其等效物。 [0231] 如本文所用，术语“CD28共刺激信号传导区”是指与此名称相关的特定蛋白质片段 和具有相似生物学功能的任何其他分子，所述分子与本文所示的CD28共刺激信号传导区域 序列具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或者至少95％ 的序列同一性。在美国专利第5,686 ,281号；Geiger,T.L .et  al .(2001)Blood  98:2364- 2371；Hombach,A.et  al.(2001)J  Immunol  167:6123-6131；Maher,J .et  al.(2002)Nat  Biotechnol  20:70-75；Haynes ,N .M .et  al .(2002)J  Immunol  169:5780-5786(2002)； Haynes,N.M.et  al.(2002)Blood  100:3155-3163中提供了示例性序列CD28共刺激信号传 导结构域。非限制性例子包括以下序列：CD28氨基酸序列：MLRLLLALNL  FPSIQVTGNK  ILVKQSPMLV  AYDNAVNLSC  KYSYNLFSRE  FRASLHKGLDSAVEVCVVYG  NYSQQLQVYS  KTGFNCDGKL  GNESVTFYLQ  NLYVNQTDIY  FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG  TIIHVKGKHL  CPSPLFPGPS  KPFWVLVVVG  GVLACYSLLVTVAFIIFWVR  SKRSRLLHSD  YMNMTPRRPG  PTRKHYQPYA  PPRDFAAYRS以及可选的其 45 CN 111601882 A 说　明　书 40/77 页 等效物。因此，编码这些多肽的多核苷酸包括在编码CAR的多肽内。 [0232] 如本文所用，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与此名称相关的特定蛋白质片段和 具有类似生物学功能的任何其他分子，该分子与如本文所示CD3ζ信号传导域序列具有至少 70％或至少80％的氨基酸序列同一性，或90％的序列同一性，或至少95％的序列同一性。在 美国申请号13/826,258中提供了CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列的非限制性示例序列， 例如：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。因此，编码这些多肽的多核苷酸包含在编 码CAR的多核苷酸内。 [0233] 在一方面，本发明的工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合抗原受 体(CAR)组成，或由嵌合抗原受体(CAR)组成；其中该CAR的抗CD19结合结构域包含特异性识 别人源化抗CD19结合域的单链可变片段(scFv)，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在 另一方面，本发明的工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合抗原受体(CAR) 组成，或进一步由嵌合抗原受体(CAR)组成；其中该CAR的抗CD19结合结构域scFv包含重链 可变区和轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。能够结合抗原的CAR细胞外结构域 的非限制性例子是如US20140271635申请中所公开的特异性结合CD19抗原的抗CD19结合结 构域序列。 [0234] 在一个特定的实施方式中，本发明的工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、或基本 上由嵌合抗原受体(CAR)组成、或由嵌合抗原受体(CAR)组成，其中CAR的抗CD19结合结构域 scFv包括位于抗CD19结合结构域scFv重链可变区和抗CD19结合结构域scFv轻链可变区之 间的接头多肽，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，本发明的工程化T细胞包含嵌 合抗原受体(CAR)，或基本上由嵌合抗原受体(CAR)组成，或进一步地由嵌合抗原受体(CAR) 组成，其中该CAR的接头多肽包含n是1到6的整数的(GGGGS)n的序列，或基本上由其组成，或 由其组成。可选地，“接头序列”是指包含1至10个氨基酸、或8个氨基酸、或6个氨基酸、或5个 氨基酸的任何氨基酸序列，该序列可以重复1至10次、或1至约8次、或1至约6次、或约5次、或 4次、或3次、或2次。例如，接头可包含由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。一方 面，接头序列是(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头，其包含三拷贝的gly-gly-gly-gly-ser-， 其以单字母序列符号表示为GGGGS。 [0235] 在一个特定的实施方式中，本发明的工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，或基本 上由嵌合抗原受体(CAR)组成，或由嵌合抗原受体(CAR)组成，其中该CAR进一步包含与CAR 相连或由CAR表达的可检测标记或纯化标记，或基本上由该标记组成，或由该标记组成。 [0236] 可检测标记的非限制性例子包括产生可检测信号(例如通过比色法、荧光、发光) 的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例 如荧光、发光染料；通过电子显微镜或通过其电学性质(例如电导率、安培法、伏安法、阻抗) 被检测到的电子密度的基团；可检测基团，例如其分子大小足以在其物理和/或化学性质中 诱导可检测的修饰的可检测基团，这样检测可通过光学方法(例如衍射、表面等离子体共 振、表面变化、接触角变化)或物理方法(例如原子力光谱法、隧道效应)或放射性分子(例 如32P、35S或125I)完成。 [0237] 纯化标记的非限制性例子包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c- myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃红、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5、Snap、HA、几丁质结合蛋白、 46 CN 111601882 A 说　明　书 41/77 页 Softag  1、Softag  3、链球菌或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记包含：FLAG、GFP、YFP、 RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy  7、DNP、AMCA、生物素、洋地黄毒苷、Tamra、德克萨 斯红、罗丹明、Alexa  fluors、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。 [0238] 一方面，本发明的工程化细胞包含编码CAR的多核苷酸，或基本上由编码CAR的多 核苷酸组成，或由编码CAR的多核苷酸组成，并且可选地，其中该多核苷酸进一步编码抗 CD19结合域。 [0239] 本发明的CAR细胞可以通过将编码CAR的多核苷酸插入工程化的免疫细胞中，然后 在细胞中表达CAR而产生。因此，在一方面，本发明的工程化T细胞包含编码CAR的多核苷酸、 或基本上由其组成、或由其组成，其中该多核苷酸还包含可操作地连接至该多核苷酸以在 细胞中表达该多核苷酸的启动子，或基本上由其组成，或由其组成。启动子的非限制性例子 包括组成性的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的启动子。启动子以“可操作地连接”的方 式来转录所连接的多核苷酸。 [0240] 一方面，多核苷酸还包含编码2A自切割肽(T2A)的序列，或基本上由其组成，或进 一步由其组成，该序列可选地位于编码抗原结合结构域(例如抗-CD19结合域)的多核苷酸 的上游。“T2A”和“2A肽”可互换使用，是指任何2A肽或其片段、任何2A样肽或其片段、或包含 必需氨基酸的人工肽，其中所述必需氨基酸是含有共有多肽基序D-V/I-E-X-N-P-G-P的相 对短(根据所来源的病毒，约20个氨基酸长度)的肽序列，其中X是指通常被认为是自剪切的 任何氨基酸。 [0241] 在一些实施方式中，本发明的工程化细胞包含编码CAR的多核苷酸，或基本上由其 组成，或由其组成，其中该多核苷酸还包含位于编码抗CD19结合结构域的多核苷酸的上游 的信号肽，或基本上由其组成，或由其组成。在一个特定的实施方式中，本发明的工程化细 胞包含编码CAR的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成，其中该多核苷酸进一步包含 小鼠Thy1.1报道基因信号多肽、或基本上由组成、或由其组成。 [0242] 在一些实施方式中，本发明的工程化细胞包含编码CAR的多核苷酸，或基本上由其 组成，或由其组成，其中该多核苷酸还包含SEQ  ID  NO:1的序列、或基本上由其组成，或由其 组成。 [0243] 在一些实施方式中，本发明的工程化的T细胞包含编码CAR的多核苷酸，或基本上 由编码CAR的多核苷酸组成，或由编码CAR的多核苷酸组成，其中该多核苷酸编码SEQ  ID  NO：2的氨基酸序列。 [0244] 编码CAR的多核苷酸可以被包含在例如质粒的载体内。在单独的方面，载体是选自 逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体的病毒载体。 [0245] 在一些实施方式中，已经从对象中分离了本发明的细胞。在一个特定的实施方式 中，已经从对象中分离了本发明的细胞，其中所述对象患有癌症。 [0246] 在一个特定的实施方式中，已经从对象中分离了本发明的细胞，其中所述对象患 有癌症，并且所述肿瘤抗原由与所述癌症相关的细胞表达。 生产细胞 [0247] 本发明还提供了生产工程化的免疫细胞的方法，该方法包含减少或消除该细胞中 NR4A转录因子的表达和/或功能，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，生产工程化的 免疫细胞的方法还包括，或基本上由以下组成，或进一步由以下组成：从对象分离细胞，减 47 CN 111601882 A 说　明　书 42/77 页 少或消除细胞中NR4A转录因子的表达和/或功能，以及在有利于细胞扩增和增殖的条件下 培养细胞。 [0248] 本发明还提供了生产工程化的免疫细胞的方法，该方法包括减少或消除该细胞中 TOX转录因子的表达和/或功能。一方面，生产工程化的免疫细胞的方法还包括，或基本上由 以下组成，或由以下组成：从对象中分离免疫细胞，减少或消除该细胞中TOX转录因子的表 达和/或功能，在有利于细胞扩增和增殖的条件下培养免疫细胞。 [0249] 免疫细胞包括但不限于NK细胞和T细胞。如本文所用，术语“T细胞”是指在胸腺中 成熟的淋巴细胞的类型。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并通过在细胞表面存在T 细胞受体而与其他淋巴细胞(例如B细胞)进行区分。T细胞可以是分离的，也可以是从商业 渠道获得的。“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4 细胞)，细 胞毒性T细胞(CD8 细胞)，自然杀伤性T细胞，T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细 胞”包括CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。 商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括：BCL2(AAA)Jurkat( CRL-2902TM)、 BCL2(S70A)Jurkat( CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat( CRL-2901TM)、 BCL2Jurkat( CRL-2899TM)、Neo  Jurkat( CRL-2898TM)、ALL-104细胞毒性人T 细胞系(ATCC#CRL-11386)。另外例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、 HPB-MLp-W、HUT  78、HUT  102、Karpas  384、Ki  225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及 未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL,Be13,CCRF-CEM,CML-T1 ,DND-41 ,DU.528,EU-9,HD-Mar, HPB-ALL,H-SB2,HT-1,JK-T1,Jurkat,Karpas  45,KE-37,KOPT-K1,K-T1,L-KAW,Loucy,MAT, MOLT-1,MOLT  3,MOLT-4,MOLT  13,MOLT-16,MT-1,MT-ALL,P12/Ichikawa ,Peer,PER0117, PER-255,PF-382,PFI-285,RPMI-8402,ST-4,SUP-T1至T14,TALL-1,TALL-101,TALL-103/2, TALL-104,TALL-105,TALL-106,TALL-107,TALL-197,TK-6,TLBR-1、-2、-3和-4,CCRF-HSB-2 (CCL-120.1) ,J.RT3-T3.5(ATCC  TIB-153) ,J45.01(ATCC  CRL-1990) ,J.CaM1.6(ATCC  CRL- 2063) ,RS4；11(ATCC  CRL-1873) ,CCRF-CEM(ATCC  CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细 胞系,例如HuT78(ATCC  CRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC  CRL-8294)、HuT102(ATCC  TIB-162)。 无白血病细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是另一种可商购获得的免疫细 胞来源，以及源自于其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白 血病、U937淋巴瘤、HEL红细胞白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。 这样的商业上可以获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国典型培养物保藏中心(或 ATCC) (http://www .atcc .org/)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(https:// www.dsmz.de/)。 [0250] 术语“减少或消除……表达和/或功能”旨在减少或消除所述多核苷酸向mRNA的转 录，或减少或消除所述mRNA向肽、多肽或蛋白质的翻译，或减少或消除所述肽、多肽或蛋白 质的功能。在非限制性例子中，将多核苷酸向mRNA的转录降低至其在野生型细胞中发现的 正常水平的至少一半。 [0251] 在一个方面，本发明提供了生产工程化的免疫细胞的方法，该方法包括以下步骤， 或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：减少或消除细胞中NR4A和TOX转录因子的表 达和/或功能。一方面，生产工程化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或基本上由以下步 骤组成，或由以下步骤组成：从对象中分离免疫细胞，减少或消除所述细胞中NR4A转录因子 48 CN 111601882 A 说　明　书 43/77 页 的表达和/或功能，在有利于细胞扩增和增殖的条件下培养该细胞。在另一方面，生产工程 化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：从对 象中分离免疫细胞，减少或消除细胞中TOX转录因子的表达和/或功能，在有利于细胞扩增 和增殖的条件下培养该细胞。 [0252] 可以在使细胞生长和扩增的条件下培养被转导的细胞。 [0253] 为了该方法的目的，术语“NR4A转录因子”是指与DNA结合并调节基因表达的细胞 核激素受体的NR4A亚家族的成员。NR4A转录因子家族成员的非限制性例子是分别由SEQ  ID  NO:3、SEQ  ID  NO:4和SEQ  ID  NO:5所提供的序列编码的人类NR4A1(Nur77)、NR4A2(Nurr1) 和NR4A3(NOR1)。同样出于本公开的目的，术语“TOX转录因子”是指与DNA结合并调节基因表 达的细胞核激素受体的TOX亚家族的成员。TOX转录因子家族成员的非限制性例子是分别由 SEQ  ID  NO:6、SEQ  ID  NO:7、SEQ  ID  NO:8和SEQ  ID  NO:9所提供的序列编码的人类TOX1、 TOX2、TOX3和TOX4。进一步出于本公开的目的，术语“IL-21”(白介素21)是指具有免疫调节 活性的细胞因子的共同γ链家族的成员。非限制性例子是由SEQ  ID  NO：10提供的序列编码 的人类IL-21。 [0254] 免疫细胞包括但不限于NK细胞和T细胞。如本文所用，术语“T细胞”是指一类在胸 腺中成熟的淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并通过在细胞表面存在T细 胞受体而与其他淋巴细胞(例如B细胞)进行区分。T细胞可以是分离的，也可以从商业渠道 获得。“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4 细胞)、细胞毒性T 细胞(CD8 细胞)、自然杀伤性T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括 CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上 可获得的T细胞系的非限制性例子包括：BCL2(AAA)Jurkat( CRL-2902TM)、BCL2 (S70A)Jurkat( CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat( CRL-2901TM)、BCL2  Jurkat( CRL-2899TM)、Neo  Jurkat( CRL-2898TM)、ALL-104细胞毒性人T细胞 系(ATCC#CRL-11386)。另外例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB- MLp-W、HUT  78、HUT  102、Karpas  384、Ki  225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成 熟的T细胞系，例如ALL-SIL,Be13,CCRF-CEM,CML-T1 ,DND-41 ,DU.528,EU-9,HD-Mar,HPB- ALL ,H-SB2 ,HT-1 ,JK-T1 ,Jurkat ,Karpas  45 ,KE-37 ,KOPT-K1 ,K-T1 ,L-KAW ,Loucy ,MAT , MOLT-1,MOLT  3,MOLT-4,MOLT  13,MOLT-16,MT-1,MT-ALL,P12/Ichikawa ,Peer,PER0117, PER-255,PF-382,PFI-285,RPMI-8402,ST-4,SUP-T1至T14,TALL-1,TALL-101,TALL-103/2, TALL-104,TALL-105,TALL-106,TALL-107,TALL-197,TK-6,TLBR-1、-2、-3和-4,CCRF-HSB-2 (CCL-120.1) ,J.RT3-T3.5(ATCC  TIB-153) ,J45.01(ATCC  CRL-1990) ,J.CaM1.6(ATCC  CRL- 2063) ,RS4；11(ATCC  CRL-1873) ,CCRF-CEM(ATCC  CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细 胞系,例如HuT78(ATCC  CRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC  CRL-8294)、HuT102(ATCC  TIB-162)。 无白血病细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是另一种可商购获得的免疫细 胞来源，以及源自于其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白 血病、U937淋巴瘤、HEL红细胞白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。 这样的商业上可以获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国典型培养物保藏中心(或 ATCC) (http://www .atcc .org/)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(https:// www.dsmz.de/)。 49 CN 111601882 A 说　明　书 44/77 页 [0255] 在另一方面，本公开提供了生成工程化的免疫细胞的方法，该方法包括以下步骤， 或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：减少或消除NR4A和TOX转录因子的表达和/ 或功能，以及增加IL-21在细胞中的表达。在一方面，生产工程化细胞的方法还包括以下步 骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：从对象中分离免疫细胞，减少或消除该 细胞中NR4A转录因子的表达和/或功能，以及在有利于细胞扩增和增殖的条件下培养该细 胞。在另一方面，生产工程化的免疫细胞的方法进一步包括以下步骤，或基本上由以下步骤 组成，或由以下步骤组成：从对象分离免疫细胞，减少或消除该细胞中TOX转录因子的表达 和/或功能，以及在有利于细胞扩增和增殖的条件下培养该细胞。在又一方面，生产工程化 的免疫细胞的方法进一步包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤 组成：从对象分离免疫细胞，增加细胞中IL-21的表达和/或功能，以及在有利于细胞扩增和 增殖的条件下培养该细胞。 [0256] 本领域技术人员可以使用例如RNA测序、DNA微阵列、实时PCR或染色质免疫沉淀 (ChIP)等方法来监测转录因子的表达。可以使用例如流式细胞仪、免疫印迹、2D凝胶电泳或 免疫测定等方法来监测蛋白质的表达。 [0257] 本领域技术人员可以使用例如RNA干扰(RNAi)、CRISPR、TALEN、ZFN的方法或靶向 特定序列以减少或消除NR4A或TOX转录因子的表达和/或功能的其他方法。CRISPR、TALEN、 ZFN或其他基因组编辑工具也可以用于增加IL-21的表达和/或功能。 [0258] 在另一方面，生产工程化的免疫细胞的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由以 下步骤组成，或由以下步骤组成：抑制细胞中NFAT/AP-1通路的表达和/或功能。一方面，生 产工程化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组 成：从对象中分离免疫细胞，抑制该细胞中NFAT/AP-1通路的表达和/或功能，以及在有利于 细胞扩增和增殖的条件下培养该细胞。 [0259] 如本文所用，术语“抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能”是指减少或消除该通路 中的基因的转录，或者减少或消除所述mRNA翻译成通路肽、多肽、或蛋白质，或减少或消除 所述通路的肽、多肽或蛋白质的功能。抑制NFAT/AP-1通路的表达和/或功能的非限制性例 子包括：抑制NR4A转录因子或TOX转录因子表达和/或功能，或增加IL-21的表达。 [0260] 术语“减少或消除……表达和/或功能”是指减少或消除所述多核苷酸向mRNA的转 录，或减少或消除所述mRNA向肽、多肽或蛋白质的翻译，或减少或消除所述肽、多肽或蛋白 质的功能。在非限制性例子中，将多核苷酸向mRNA的转录降低至其在野生型细胞中发现的 正常水平的至少一半。 [0261] 免疫细胞包括但不限于NK细胞和T细胞。如本文所用，术语“T细胞”是指一类在胸 腺中成熟的淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并通过在细胞表面上存在的 T细胞受体与其他淋巴细胞(例如B细胞)进行区分。T细胞可以是分离的，也可以是从商业渠 道获得的。“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4 细胞)、细胞 毒性T细胞(CD8 细胞)、自然杀伤性T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞” 包括CD8 T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，其中这些细胞能够介导细胞毒性反 应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括BCL2(AAA)Jurkat( CRL-2902TM)， BCL2(S70A)Jurkat( CRL-2900TM)，BCL2(S87A)Jurkat( CRL)-2901TM)， BCL2Jurkat( CRL-2899TM)，Neo  Jurkat( CRL-2898TM)，TALL-104细胞毒性人 50 CN 111601882 A 说　明　书 45/77 页 T细胞系(ATCC#CRL-11386)。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括：BCL2(AAA) Jurkat( CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat( CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat ( CRL-2901TM)、BCL2  Jurkat( CRL-2899TM)、Neo  Jurkat( CRL- 2898TM)、ALL-104细胞毒性人T细胞系(ATCC#CRL-11386)。另外例子包括但不限于成熟的T细 胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT  78、HUT  102、Karpas  384、Ki  225、My-La、Se-Ax、 SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL,Be13,CCRF-CEM,CML-T1,DND-41, DU.528,EU-9,HD-Mar,HPB-ALL,H-SB2,HT-1,JK-T1,Jurkat,Karpas  45,KE-37,KOPT-K1,K- T1 ,L-KAW ,Loucy ,MAT ,MOLT-1 ,MOLT  3 ,MOLT-4 ,MOLT  13 ,MOLT-16 ,MT-1 ,MT-ALL ,P12/ Ichikawa,Peer,PER0117,PER-255,PF-382,PFI-285,RPMI-8402,ST-4,SUP-T1至T14,TALL- 1,TALL-101,TALL-103/2,TALL-104,TALL-105,TALL-106,TALL-107,TALL-197,TK-6,TLBR- 1、-2、-3和-4,CCRF-HSB-2(CCL-120.1) ,J.RT3-T3.5(ATCC  TIB-153) ,J45.01(ATCC  CRL- 1990) ,J .CaM1 .6(ATCC  CRL-2063) ,RS4；11(ATCC  CRL-1873) ,CCRF-CEM(ATCC  CRM-CCL- 119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系,例如HuT78(ATCC  CRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC  CRL- 8294)、HuT102(ATCC  TIB-162)。无白血病细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92- 221，是另一种可商购获得的免疫细胞来源，以及源自于其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例 如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红细胞白血病、HL60白血病、HMC- 1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。此类市售细胞系的非限制性示例性来源包括美国典型 培养物保藏中心(ATCC)(http://www .atcc .org/)和德国微生物和细胞培养物保藏中心 (https://www.dsmz.de/)。 [0262] 在另一方面，如上所述的生产工程化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或者基 本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：从对象分离免疫细胞，其中从该对象分离的所 述细胞结合靶抗原。一方面，靶抗原是肿瘤抗原或病原体表达的抗原。在另一方面，所述肿 瘤抗原包含以下成分、或基本上由其组成、或由其组成：间皮素、ROR1或EGFRvIII，A型肝配 蛋白受体2(EphA2)、白介素(IL)-13rα2、EGFR  VIII、PSMA、EpCAM、GD3、岩藻糖基GM1、PSCA、 PLAC1、肉瘤断点，Wilms肿瘤1、血液学分化抗原、表面糖蛋白、神经节苷脂(GM2)、生长因子 受体、基质抗原、血管抗原或其组合。 [0263] 术语“受体”或“T细胞受体”或“TCR”是指在T细胞上发现的细胞表面分子，其功能 是识别并结合抗原呈递分子呈递的抗原。通常，TCR是α链(TRA)和β链(TRB)的异二聚体。一 些TCR由替代性的γ(TRG)和δ(TRD)链组成。表达此TCR版本的T细胞被称为γδT细胞。TCR是 免疫球蛋白超家族的一部分。因此，像抗体一样，TCR每条链都包含三个高变CDR区域。β链上 还有一个高变区域(HV4)。TCR异二聚体通常存在于八聚体复合物中，其进一步包含三个二 聚体信号传导模块CD3γ/ε、CD3δ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η。人类TCR-α链的非限制性示例性氨基 酸序列：METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILI RSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCAPVLSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQL RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF PSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS。人类TCR-β链的非限制性示 例性氨基酸序列：DSAVYLCASSLLRVYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPPEAEISHTQKATLVCLA TGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQP。 [0264] 一方面，生产本公开的工程化的免疫细胞的方法还包含以下步骤，或者基本上由 51 CN 111601882 A 说　明　书 46/77 页 该步骤组成，或由该步骤组成：将编码嵌合抗原受体的多核苷酸(多核苷酸CAR)引入细胞 中。在一个实施方式中，多核苷酸CAR包含以下组分，或基本上由以下组分组成，或由以下组 分组成：(a)抗原结合结构域，(b)铰链结构域，(c)跨膜结构域，以及(d)细胞内结构域。 [0265] 一方面，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法还包括引入多核苷酸CAR，或基本 上由该步骤组成，或由该步骤组成；其中该多核苷酸CAR还包含以下组分，或基本上由以下 组分组成，或由以下组分组成：(a)抗CD19结合结构域；(b)铰链结构域；(c)CD28或CD8α跨膜 结构域；(d)选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传 导区域和OX40共刺激信号传导区域中的一个或多个共刺激区域；和(e)CD3ζ信号传导结构 域。 [0266] 嵌合抗原受体可以可选地包含“铰链结构域”，其充当细胞外结构域和跨膜结构域 之间的接头。本文描述了编码这些组分的非限制性示例性多核苷酸序列。 [0267] 能够结合抗原的CAR细胞外结构域的非限制性例子是如US20140271635申请中所 公开的特异性结合CD19抗原的抗CD19结合域序列。 [0268] 在一个特定的方面，产生本公开的工程化的免疫细胞的方法还包括引入多核苷酸 CAR，或基本上由该步骤组成，或由该步骤组成，其中多核苷酸CAR的抗CD19结合结构域是特 异性识别人源化抗CD19结合域的单链可变片段(scFv)。在另一方面，多核苷酸CAR的抗CD19 结合结构域scFv包含重链可变区和轻链可变区，或基本上由重链可变区和轻链可变区组 成，或由重链可变区和轻链可变区组成。 [0269] 嵌合抗原受体可以可选地包含“铰链域”，其充当细胞外和跨膜域之间的接头。 [0270] 能够结合抗原的CAR细胞外结构域的非限制性实例是特异性结合CD19抗原的抗 CD19结合域序列，如US20140271635申请中所公开。 [0271] 在一个特定的方面，产生本发明的工程化的T细胞的方法还包括以下步骤，或基本 上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中多核苷酸CAR的抗CD19结合 结构域scFv包含位于抗CD19结合结构域scFv重链可变区和抗CD19结合结构域scFv轻链可 变区之间的接头多肽，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，生产本发明的工程化T 细胞的方法还包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入具有接头 的多核苷酸CAR，其中所述多核苷酸CAR接头多肽包含其中n是1至6的整数的(GGGGS)n的序 列，或基本上由其组成，或由其组成。 [0272] 一方面，生产本发明工程化T细胞的方法还包含以下步骤，或基本上由以下步骤组 成，或由以下步骤组成：导入多核苷酸CAR，其中多核苷酸还包含可检测标记和/或纯化标 记。 [0273] 在另一方面，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或基本上 由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中该多核苷酸进一步包含与多 核苷酸可操作地连接的启动子以在所述的免疫细胞中表达多核苷酸。 [0274] 在另一方面，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法还包括以下步骤，或基本上 由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中该多核苷酸还包含以下组分， 或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：编码2A自切割肽(T2A)的多核苷酸序列，该 序列可选地位于编码抗CD19结合结构域的多核苷酸的上游。 [0275] 在一些实施方式中，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法包括以下步骤，或基 52 CN 111601882 A 说　明　书 47/77 页 本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中多核苷酸序列包括SEQ  ID  NO：1，或基本上由其组成，或由其组成。 [0276] 在一个实施方式中，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法包含以下步骤，或基 本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中多核苷酸编码SEQ  ID  NO：2的氨基酸序列。 [0277] 在另一个实施方式中，生产本发明的工程化的免疫细胞的方法包括以下步骤，或 基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：引入多核苷酸CAR，其中该多核苷酸还包含载 体，或基本上由载体组成，或由载体组成。一方面，载体还包含含有SEQ  ID  NO：1的分离的核 酸序列，或基本上由该核酸序列组成，或由该核酸序列组成。在另一方面，载体是质粒。在单 独的方面，载体是选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体的病毒 载体。 [0278] 本发明还提供了通过上述公开的生产工程化的免疫细胞的方法中任一种制备的 免疫细胞。 [0279] 本发明还提供了本发明的工程化的免疫细胞中任一种的基本上同质的细胞群体。 [0280] 本发明还提供了本发明的任何工程化的免疫细胞的异质细胞群体。 组合物 [0281] 在一方面，本文提供了组合物，其包含载体以及一个或多个本发明的工程化的免 疫细胞或本发明工程免疫细胞中任一种的细胞群体，或基本上由这些组成，或由这些组成。 在另一方面，所述载体是药学上可接受的载体。 [0282] “组合物”通常意指活性试剂与天然存在或非天然存在的惰性(例如可检测的试剂 或标记)或活性载体的组合，其中活性试剂例如是工程化的T细胞受体、修饰的T细胞受体、 嵌合抗原受体、包含工程化的T细胞受体的细胞、CAR  T细胞或CAR  NK细胞，抗体、化合物或 组合物，其中载体例如是佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐 剂等并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂，肽、氨基酸、脂质和 碳水化合物(例如，包括单糖、二、三、四寡糖和低聚糖；例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等的衍生 的糖；以及多糖或糖聚合物)，它们可以单独或组合存在，其单独或组合占重量或体积的1- 99.99％。示例性的蛋白质赋形剂包括例如人类血清白蛋白(HSA)、重组人类白蛋白(rHA)的 血清白蛋白、明胶、酪蛋白等。还可以以缓冲能力起作用的代表性氨基酸/抗体成分包括：丙 氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸等。碳水化合物赋形剂也应包含在该技 术范围内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨 糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、 右旋糖酐、淀粉等；醛糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡 萄糖醇)和肌醇。 [0283] 根据本发明所使用的组合物包括细胞、治疗、疗法、药剂、药物和药物制剂，其可以 以剂量单位形式包装，以易于给药和剂量均匀。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在对象 中使用的物理上离散的单位，每个单位都包含被计算来产生与其施用(即适当的途径和方 案)相关的所期望的应答的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，给药量取决于所期 望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于执业医生的判断，并且是每个人所特有的。 53 CN 111601882 A 说　明　书 48/77 页 影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、给药途径、预期的治疗目标(缓解症状与治 愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制后，将以与剂量制剂相容的方式以及以 治疗或预防有效量的量来施用溶液。制剂易于以各种剂型(例如本文所述的可注射溶液的 类型)来施用。 [0284] 在另一方面，本文提供了一种组合物，其包含载体以及一个或多个本发明的任何 工程免疫细胞或本发明的任何工程化的免疫细胞的细胞群体，或基本上由这些组成，或还 由这些组成；其中所述组合物还包含冷冻保护剂，或可选地基本上由冷冻保护剂组成，或由 冷冻保护剂组成。 [0285] 根据本发明使用的组合物包括细胞、治疗、疗法、药剂、药物和药物制剂，其可以以 剂量单位形式包装，以易于给药和剂量均匀。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在对象中 使用的物理上离散的单位，每个单位都包含被计算来产生与其施用(即适当的途径和方案) 相关的所期望的应答的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，给药量取决于所期望 的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于执业医生的判断，并且是每个人所特有的。影 响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、给药途径、预期的治疗目标(缓解症状与治愈) 以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制后，将以与剂量制剂相容的方式以及以治疗 或预防有效量的量来施用溶液。制剂易于以各种剂型(例如本文所述的可注射溶液的类型) 来施用。 [0286] “低温保护剂”是本领域已知的，并且包括但不限于例如蔗糖、海藻糖和甘油。通常 使用在生物系统中表现出低毒性的冷冻保护剂。 [0287] 本发明提供了结合至靶细胞的免疫细胞，其中该免疫细胞是本发明的工程化的免 疫细胞中任一个。 试剂盒 [0288] 还提供了一种试剂盒，其包含用于制备本发明的任何工程免疫细胞的载体和说明 书，以及可选地用于其诊断或治疗用途的说明书，或基本上由这些组成，或由这些组成。 使用方法 [0289] 本文还提供了刺激细胞介导的对靶细胞群体的免疫应答的方法，该方法包括使靶 细胞群体与本发明的工程化细胞接触或本发明的细胞群体接触，或者基本上由该步骤组 成，或者由该步骤组成。在另一方面，提供了刺激细胞介导的对靶细胞群体的免疫应答的方 法，该方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由步骤组成：使靶细胞群体与 本发明的细胞或本发明的细胞群体接触，其中接触是在体外或体内进行。接触可以是两个 或多个实体之间(例如，靶细胞群体与被工程化以减少或消除所述细胞中的NR4A转录因子 的表达和/或功能的T细胞之间)的直接或间接结合或相互作用。直接的相互作用的特定例 子是结合。间接的相互作用的特定例子是一个实体作用于中间分子，而该中间分子转而作 用于第二个所提及的实体。本文所用的接触包括在溶液中、在固相中、在体外、离体、在细胞 中和在体内。体内接触可以称为施用或给药。靶细胞可以是病原体感染的细胞或癌症细胞 或肿瘤细胞。在另一方面，癌症的特征在于是反应低性的。一方面，选择细胞以与靶细胞特 异性结合。细胞可以来自任何物种，例如哺乳动物或人类细胞。它们可以从对象(例如，从活 检组织中)或培养的细胞中分离。 [0290] 在另一方面，提供了刺激细胞介导的对靶细胞群体的免疫应答的方法，该方法包 54 CN 111601882 A 说　明　书 49/77 页 括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：使靶细胞群与本发明的细 胞或本发明的细胞群体接触，其中所述接触是体内的并且靶细胞群是对象中的癌症细胞群 体。在另一方面，癌症的特征在于是低反应性的。 [0291] 通过这种方法靶向的癌症细胞包括血液癌症，例如急性髓细胞性白血病或急性淋 巴细胞白血病，以及实体瘤，例如癌症、肉瘤、神经母细胞瘤、子宫颈癌、肝细胞癌、间皮瘤、 成胶质细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母 细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤或黑色素瘤。 [0292] 该方法可用于治疗人类、非人类灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、 猕猴等)、家养动物(例如狗和猫)、农场动物(例如马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如 小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。哺乳动物可以是任何年龄的或处于任何发育阶段(例如，成年、青 少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方式中， 人类患有或怀疑患有癌症或瘤性疾病。该方法可以用作一线、二线、三线、四线或五线疗法， 并且可与其他合适的疗法(例如手术切除)组合。在另一方面，癌症的特征在于是低反应性 的。 [0293] 在另一方面，本文公开了一种在对象中刺激针对病原体感染的细胞的细胞介导的 免疫应答的方法，该方法包括以下步骤，或者基本上由该步骤组成，或者由该步骤组成：向 该对象施用本公开内容的细胞或本公开内容的细胞群，其量可有效刺激细胞介导的免疫应 答。一方面，细胞或群体特异性结合病原体感染的细胞群体。通过该方法处理的病原体感染 的细胞群体或病原体感染的细胞包括但不限于被由A群链球菌、结核分枝杆菌、弗氏志贺 菌、肠道沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、土拉弗朗西斯菌引起的细菌感染，以及由 例如单纯疱疹病毒引起的病毒感染。该方法可用于治疗动物，通常是哺乳动物。可以通过本 文所述的方法、细胞或组合物治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限制性人类、非人类 灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家养动物(例如狗和猫)、农场动 物(例如马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。在一些实施方式 中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年，青少年，儿 童，婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。 在一些实施方式中，对象是人。 [0294] 在另一方面，用于刺激细胞介导的对癌症靶细胞群体的免疫应答的方法，该方法 包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：以有效刺激细胞介导的 免疫反应的量向对象施用本发明的细胞或细胞群。一方面，对象患有癌症、已经患有癌症或 需要治疗癌症。在另一方面，癌症的特征在于是低反应性的。 [0295] 本发明还提供了在对象中提供抗肿瘤免疫力的方法，该方法包含以下步骤，或者 基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：以向对象有效提供免疫力的量向对象施用本 发明的细胞或细胞群体。一方面，所述对象是哺乳动物。在另一方面，所述对象是人类。提供 该细胞或群体以防止在易感或尚未表现出癌症症状的对象中出现症状或癌症。 [0296] 本文发明的一个方面是治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、病症或病况 的对象的方法，该方法包括以下步骤、或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成： 以有效治疗对象的量向该对象施用本发明的细胞或细胞群体。在另一方面，肿瘤的特征在 于低反应性。 55 CN 111601882 A 说　明　书 50/77 页 [0297] 通过这些方法靶向的癌症细胞和与癌症相关的抗原包括血液癌症，例如急性髓细 胞性白血病或急性淋巴细胞白血病，以及实体瘤，例如癌症、肉瘤、神经母细胞瘤、子宫颈 癌、肝细胞癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、神经胶质瘤、胶 质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤或黑色素瘤。一方面， 细胞或群体特异性结合癌症靶细胞群体。在另一方面，癌症的特征在于低反应性。 [0298] 所述方法可用于治疗人类、非人类灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴 子、猕猴等)、家养动物(例如狗和猫)、农场动物(例如马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例 如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年，青 少年，儿童，婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方式中， 人类患有或怀疑患有癌症或瘤性疾病。该方法可以用作一线、二线、三线、四线或五线疗法， 并且可与其他合适的疗法(例如手术切除)组合。 [0299] 在某些实施方式中，对象患有或怀疑患有瘤性疾病、瘤形成、肿瘤、恶性肿瘤或癌 症。在一些实施方式中，需要本文所述的治疗、细胞或组合物的对象患有或被怀疑患有瘤性 疾病、瘤形成、肿瘤、恶性肿瘤或癌症。 [0300] 一方面，提供了在对象中刺激对病原体感染的靶细胞群体的细胞介导的免疫应答 的方法，该方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：向该对 象施用本发明的细胞或本发明的细胞群体。一方面，对象患有病原体感染、已经患有病原体 感染或需要治疗病原体感染。用这种方法治疗的病原体感染的细胞群体或病原体感染的细 胞包括但不限于由A群链球菌、结核分枝杆菌、弗氏志贺菌、肠道沙门氏菌、单核细胞增多性 李斯特氏菌、土拉弗朗西斯菌引起的细菌感染，以及由例如单纯疱疹病毒引起的病毒感染。 用这种方法治疗的对象包括动物，通常是哺乳动物。可以通过本文所述的方法、细胞或组合 物治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限制性例子包括人类、非人类灵长类动物(例如 猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家养动物(例如狗和猫)、农场动物(例如马、牛、山 羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。在一些实施方式中，哺乳动物是人 类。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴儿或子宫 内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。在一些实施方 式中，对象是人类。该方法可以与其他合适的疗法或治疗相结合。 [0301] 在一些实施方式中，对象需要本文所述的治疗、细胞或组合物。在某些实施方式 中，对象患有或怀疑患有病原体感染。在一些实施方式中，需要本文所述的治疗、细胞或组 合物的对象患有或怀疑患有病原体感染。 [0302] 对于上述方法，施用有效的量，并且细胞或细胞群体的给药用于减轻任何症状或 预防出现其他症状。当给药是为了预防或减少癌症复发或转移或病原体感染的可能性的目 的时，可在出现任何可见或可检测到的症状之前施用该细胞或组合物。给药途径包括但不 限于口服(例如片剂、胶囊或混悬剂)、局部、透皮、鼻内、阴道、直肠、皮下静脉内、动脉内、肌 内、骨内、腹膜内、硬膜外和鞘内。 [0303] 这些方法提供以下效果中一个或多个：(1)在易患或尚未表现出疾病症状的对象 中预防症状或疾病出现；(2)抑制疾病或阻止其发展；(3)改善或导致疾病或疾病症状的消 退。如本领域中所理解，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。为 了本技术的目的，无论是可检测的还是不可检测的，有益的或期望的结果都可以包括(但不 56 CN 111601882 A 说　明　书 51/77 页 限于)以下一种或多种：减轻或改善一种或多种症状，缩小病症(包括疾病)的程度，稳定(即 不恶化)病况(包括疾病)的状态，延缓或减慢病况(包括疾病)、进程，改善和减缓病况(包括 疾病)状态和缓解(无论是部分还是全部)。含有所公开的组合物和方法的治疗可以是一线、 二线、三线、四线、五线疗法，并且旨在用作单独疗法或与其他合适的疗法组合。在一方面， 治疗排除预防。 [0304] 本文还提供了在对象中提供对病原体感染的免疫力的方法，该方法包括以下步 骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：以提供免疫力的量向对象施用本发明的 任何细胞或细胞群体。一方面，所述方法防止症状或病原体感染在易感或尚未显示病原体 感染的症状的对象中出现。该方法可用于治疗动物，通常是哺乳动物。可以通过本文所述的 方法、细胞或组合物治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限制性人类、非人类灵长类动 物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家养动物(例如狗和猫)、农场动物(例如 马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。在一些实施方式中，哺乳 动物是人类。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴 儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。所述 方法可以与其他合适的疗法组合，并且可以用于治疗病毒、细菌、真菌和原生动物。病原感 染的例子包括但不限于由A群链球菌、结核分枝杆菌、弗氏志贺菌、肠道沙门氏菌、单核细胞 增多性李斯特氏菌、土拉弗朗西斯菌引起的细菌感染，以及由例如单纯疱疹病毒引起的病 毒感染。 讨论 [0305] 许多现有用于工程化过继性T细胞疗法的方法集中于通过表达特异性T细胞受体 或嵌合抗原受体来使T细胞识别肿瘤抗原。输注后，细胞的功能在进入肿瘤环境后会受到影 响。发明人从体外的模型发现，常规的T细胞和CAR-T细胞迅速获得低反应性、“耗竭”状态并 且对被植入的黑素瘤肿瘤清除不良。本发明提供基因工程化以缺失Nr4a转录因子的CAR-T 细胞，从而在肿瘤内保持功能并促进肿瘤清除。 [0306] 这种“耗竭”状态的特征在于独特的基因表达和表观遗传学图谱，包括Nr4a家族转 录因子(Nr4a1  aka  Nur77、Nr4a2  aka  Nurr1、Nr4a3  aka  Nor1)的活性增加和表达改变。使 用可植入黑素瘤的小鼠模型，发明人发现在内源性、多克隆肿瘤浸润性T细胞、被过继转移 的单克隆转基因T细胞和表达嵌合抗原受体的T(CAR-T)细胞之间存在类似的“耗竭”图谱。 工程化以缺失Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3转录因子的CAR-T细胞可清除被植入的黑色素瘤，而未 被修饰的CAR-T细胞则不会限制肿瘤的生长。再刺激时，缺失Nr4a的CAR-T细胞比表达Nr4a 的CAR-T细胞产生更多的IFN-γ和TNF。因此，Nr4a的缺失是改善过继细胞治疗预后的潜在 策略，尤其是针对实体肿瘤的CAR-T细胞而言。 [0307] 为了识别CAR  T细胞浸润实体肿瘤中基因表达和相关调控元件的变化，并比较三 种不同类别的CD8 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的性质：识别人类CD19(huCD19)的CAR  TIL、识 别来自由H-2Kb呈递的鸡卵清白蛋白(OVA)的SIINFEKL肽的OT-I  T细胞受体(TCR)-转基因 TIL(OT-I  TIL)和来自受体同系小鼠的内源TIL(图7)。作为CAR  T细胞的靶标，使B16-OVA小 鼠黑素瘤细胞系、EL4小鼠胸腺瘤细胞系和MC38结肠腺癌细胞系工程化以表达人类CD19 (huCD19)(图1A，左图)；所生成的B16-OVA-huCD19细胞通过OVA反应性OT-I  T细胞以及 huCD19反应性的表达CAR  CD8 T细胞来识别。已证实，在同系C57BL/6J小鼠中皮下生长18天 57 CN 111601882 A 说　明　书 52/77 页 并随后离体培养7天后，B16-OVA-huCD19细胞系稳定地维持huCD19表达(图7A，右图)。Bf16- OVA和B16-OVA-huCD19细胞在体内的生长速率相同，表明加入huCD19抗原不会引起肿瘤细 胞的排斥(图1B，左)。根据小鼠中肿瘤的生长速度，向小鼠接种500,000个B16-OVA-huCD19 肿瘤细胞(图7B，右)。 [0308] CAR  T细胞表达第二代CAR，其中将对huCD19特异的、myc表位标记的单链可变片 段22,23与鼠CD28的跨膜结构域以及小鼠CD28和CD3ζ1的细胞内信号传导部分融合，在该逆转 录病毒构建体中，随后是2A自裂解肽和小鼠Thy1.1报告基因(图7C)。在小鼠CD8 T细胞中实 现了CAR逆转录病毒的95.5±4.0％的转导效率(图1D)。CAR  T细胞是有功能的，因为在用培 养物中的EL4-huCD19靶细胞再刺激后它们会产生细胞因子TNF和IFNγ(图7E，7F)，并在体 外表现出针对B16-OVA-huCD19细胞的剂量依赖性的靶细胞裂解(图7G)。在静息条件下，CAR  T细胞在PD-1、TIM3和LAG3的表面表达方面与模拟转导的细胞类似(图7H)。 [0309] 为了评估CAR  T细胞功能，用CAR逆转录病毒转导CD45.1 CD8 T细胞，并在肿瘤接 种后13天过继转移到携带B16-OVA-huCD19肿瘤的C57BL/6J小鼠中(图7A)。过继转移后八 天，分离CD8 CD45.1 Thy1.1 CAR  TIL和内源性CD45.2 宿主T细胞(图7B，左)。为了进行比 较，对浸润过继转移CD45.1 CD8 OT-I  TCR转基因细胞的相同B16-OVA-huCD19肿瘤进行了 平行分析(1C、1D；设门方案参见图8A、8B)。在接受CAR或OT-I  CD8 T细胞的小鼠中，肿瘤的 生长速率相当(图8C，顶部图)，从而可以直接比较这两个TIL群体；将转移的CAR  T细胞的数 量保持在低水平，以最小化肿瘤排斥(图8C，底部图)，从而可以更容易观察到基因操纵的效 果。平均而言，CAR和OT-I  T细胞占肿瘤中CD8 TIL的 和 (图7E)。 [0310] 转移后第8天，全部三个TIL群体在再刺激后均产生低水平的细胞因子TNF和IFNγ (图7F，7G)，确认了其功能已降低。全部三个TIL群体都还含有被认为高度耗竭的PD-1高TIM3 高细胞(图7B、7D中A、C和F群体，右上方)，以及被认为在用抗PD-1/PD-L1处理后增殖的抗原 特异性记忆前体的PD-1高TIM3低细胞(群体B和D)。内源性TIL还含有PD-1低TIM3低T细胞的群体 (图7B，7D，右下)，其类似于初始T细胞(参见以下的ATAC-seq数据)。因此，全部三个TIL群体 (CAR、OT-I和内源性)均发展出细胞因子生产减少和抑制性受体表达增加的相似表型。 [0311] 将RNA测序24(RNA-seq)和ATAC-seq25(转座酶可及染色质测定，然后进行测序)用 于比较CAR  T细胞系统中不同群体(A-F)的CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的基因表达和染色质可 及性图谱26-28(图7B，7D)。RNA-seq数据的主成分分析表明，PD-1高TIM3高CAR  TIL群体(A)的转 录谱与内源性PD-1高TIM3高TIL群体(C)的转录谱相似，但与CAR和内源性PD-1高TIM3低TIL群体 (B，D)和内源性PD-1低TIM3低细胞(E)的转录谱不同(图8A、图9)。相似地，ATAC-seq分析显示， 内源性OT-I和CAR  PD-1高TIM3高和PD-1高TIM3低TIL亚集的全基因组染色质可及性图谱彼此相 似，但与PD-1低TIM3低内源性TIL的染色质可及性图谱不同(图8B，图10)。 [0312] 与PD-1低TIM3低肿瘤非反应性P14  TIL18相比，具有肿瘤反应性的OT-I  TIL(PD-1高 TIM3高)的B16-OVA黑色素瘤模型显示，编码转录因子Nr4a2和Tox、各种抑制性表面受体以及 效应基因(包括颗粒酶和细胞因子)的基因表达增加。与这些发现一致的是，与内源性PD-1低 TIM3低TIL(群体E)相比，编码转录因子(Nr4a2、Tox、Tbx21)、抑制性受体(Pdcd1、Ctla4、 Havrc2、Tigit)、几种颗粒酶、细胞因子(Il21、Ifng、Tnf)和细胞因子受体(Il2ra、Il10ra) 的基因在PD-1高CAR  TIL和内源性TIL(群体A-D)中上调(图9，比较群体A  vs  E、B  vs  E、C  vs  E和D  vs  E的图)。与PD-1高TIM3低(群体B、D)相比，耗竭的PD-1高TIM3高CAR和内源性TIL(群体 58 CN 111601882 A 说　明　书 53/77 页 A、C)在Nr4a  mRNA表达上未示出显著性差异(图9，比较群体A  vs  B、C  vs  D的图)；但与后者 (B、D)相比，在前者的TIL群体(A、C)中Nr4a蛋白的表达明显增加(见下文)。最后，与已发表 的文献9,17 ,18一致，与耗竭的PD-1高TIM3高TIL相比，PD-1高TIM3低抗原特异的记忆前体在表达 更高水平的Tcf7、Il7r、Ccr7和Sell(编码CD62L(L-选择素))mRNA方面与初始CD8 T细胞类 似(图3，比较群体A  vs  E、B  vs  E、C  vs  E和D  vs  E的图)。 [0313] ATAC-seq数据的分析表明，内源性PD-1低TIM3低TIL(群体E)在染色质可及性方面与 初始CD8 T细胞类似，且不同于PD-1高TIM3高和PD-1高TIM3低TIL(群体A-D)(图8B，顶部图；图 10)。此外，在群体A-D(PD-1高CAR和内源性TIL)中选择性可及的区域富集了共同Nr4a结合基 序，以及NFAT、NFKB、bZIP和IRF-bZIP基序的共同结合基序(图8B，聚类8和9；讨论如下)。再 次与已发表的文献9,17 ,18一致，记忆前体PD-1高TIM3低TIL(群体B、D)的染色质可及性图谱与 初始CD8 T细胞的染色质可及性图谱类似，表现在Tcf7结合基序的显著富集(图8B，聚类6)。 [0314] 如上所述，PD-1高TIM3高和PD-1高TIM3低TIL群体在mRNA水平上的Nr4a家族成员的表 达方面没有显示出显著差异(图9，比较群体A  vs  B、C  vs  D图)。然而，流式细胞仪分析清楚 地显示，与PD-1高TIM3低TIL群体相比，在蛋白质水平上，全部三个Nr4a转录因子的表达均较 高。综合来看，与PD-1高TIM3低TIL群体相比，耗竭的PD-1高TIM3高的Nr4a家族成员的表达增加， 以及Nr4a结合基序在这些细胞差异化可及的区域中的富集，强烈指示出，Nr4a家族成员是 CD8 T细胞对慢性抗原刺激的应答的潜在转录效应子。 [0315] 来自人类TIL和来自慢性感染HIV患者的T细胞的数据为我们关注Nr4a家族提供了 进一步的依据。衍生自CD8 T细胞浸润人类黑素瘤的单细胞RNA-seq数据20揭示：NR4A1和 NR4A2表达显示出与PDCD1(编码PD-1)和HAVCR2(编码TIM3)表达呈强正相关，而NR4A3显示 出中等程度的正相关(图8E)。与我们的小鼠RNA-seq数据一致，观察到PDCD1和HAVCR2  mRNA 表达与编码表面受体CD38、TIGIT和CTLA4的mRNA表达呈正相关(图12A)；与编码转录因子 TCF1、细胞表面受体SELL(L-选择蛋白或CD62L)和趋化因子受体CCR7的mRNA表达呈负相关 (图12B)。编码其他目标转录因子TOX、TOX2和IRF4的mRNA的表达也与PDCD1和HAVCR2  mRNA 的表达呈正相关(图12C)。人类ATAC-seq数据19,21的分析表明，在来自黑色素瘤和非小细胞 肺癌的CD8 PD-1高TIL和来自被感染人类的HIV抗原特异性CD8 T细胞中唯一可及区域中，富 集了Nr4a细胞核受体、NFAT、bZIP和IRF:bZIP基序。综上，图12显示出Nr4a家族成员被上调， 并且Nr4a细胞核受体结合基序富集于暴露至慢性抗原刺激的人类和小鼠CD8 T细胞中的 PD-1hi  T细胞可及的区域17,18,21,29。 [0316] Nr4a家族的全部三个成员对于调节性T细胞的发育是必不可少的30，表明它们可能 在其他生物学环境中发挥冗余作用。考虑到这种预期的冗余性，将Nr4a充足(WT)的CAR  TIL 与全部三个Nr4a转录因子的三重缺失的CAR  TIL(Nr4a  TKO)进行了比较(图9)。因为Nr4a基 因破坏的小鼠最初来自129/SvJ  ES细胞31，并且尽管回交严格但它们的遗传背景可能与近 交C57BL/6J小鼠的遗传背景不完全相容，所以Rag1基因缺陷的小鼠作为肿瘤接种受体应避 免CAR  T细胞的可变的排斥。同时用两种逆转录病毒转导来自Nr4a1  fl/fl  Nr4a2  fl/fl  Nr4a3-/-小鼠的初始CD8 T细胞，第一种逆转录病毒编码CAR-2A-Thy1.1(图7C)和第二种编 码Cre，随后是IRES-NGFR盒，以产生Nr4a三重敲除(Nr4a  TKO)CAR  T细胞(图7A)。作为对照， 将来自Nr4a1  fl/fl  Nr4a2  fl/fl  Nr4a3 / 小鼠的初始CD8 T细胞分别用CAR-2A-Thy1.1 逆转录病毒和仅有IRES-NGFR的空逆转录病毒进行转导，以产生Nr4a  WT  CAR  T细胞(WT) 59 CN 111601882 A 说　明　书 54/77 页 (图13A)。将CAR  T细胞过继转移到7天前已注射B16-OVA-huCD19黑色素瘤细胞的小鼠中，另 外再监测肿瘤生长83天。与通过WT  CD8 CAR  T细胞过继转移的对照小鼠相比，缺乏所有三 种Nr4a转录因子的Nr4a  TKO  CD8 CAR  T细胞过继转移的小鼠显示出明显的肿瘤消退和存 活率的提高(图9B，9C)，三组(PBS、WT和Nr4a  TKO)之间的肿瘤大小差异最早在肿瘤接种后 第21天(即过继转移后14天)出现(图9B，底部图)。因此，Nr4a转录因子抑制CAR  T细胞模型 中的肿瘤排斥。 [0317] 为了探索Nr4a家族成员在体内CD8 T细胞功能中的冗余性，将缺失单个Nr4a蛋白 的CD8 CAR  T细胞的抗肿瘤作用与WT和Nr4a  TKO  CAR  T细胞的抗肿瘤作用进行了比较(图 14)。将CAR  T细胞过继转移到7天前已注射B16-OVA-huCD19黑色素瘤细胞的Rag1缺陷型小 鼠中，再另外监测肿瘤生长83天(图14A)。肿瘤生长曲线和存活曲线显示，与来自缺失任何 单一Nr4a蛋白的小鼠的CAR  T细胞相比，Nr4a  TKO  CAR  T细胞表现出优异的抗肿瘤活性(图 14B、14C)。再次，早在肿瘤接种后第21天就观察到WT和各种Nr4a基因敲除之间的肿瘤大小 差异。 [0318] 为了进一步确认这三个Nr4a家族成员在CD8 T细胞功能中的冗余功能，在体外使 用了在小鼠CD8 T细胞中表达Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3的逆转录病毒(图15-17)。三种Nr4a转录 因子中任何一种的异位表达都导致抑制性表面受体PD-1、TIM3、2B4和GITR的表达增加，并 在再刺激时降低了细胞因子TNF和IFNγ的生产(图15)。对表达任何给定Nr4a转录因子或空 载体对照的细胞的RNA-seq数据进行主成分分析表明，这些组之间的大部分差异在于，与空 载体相比，表达Nr4a家族成员的细胞中的相似图谱的基因(图16A)。在RNA-seq和ATAC-seq 中，成对比较显示，Nr4a家族成员之间几乎没有差异(图16B，17A)。因此，所有三种Nr4a蛋白 在体外以及体内都诱导CD8 T细胞的基因表达图谱和调节元件可及性图谱的重叠性变化。 [0319] 为了评估与Nr4a  TKO和WT中抗肿瘤功能相关的表型和全基因组变化，将实验条件 改变以延缓肿瘤消退(图9D)并确保两组之间的肿瘤大小相似(图18A)，对于TIL的设门方 案，参见图18B。每克肿瘤Nr4a  TKO  TIL恢复的数量与WT  TIL恢复的数量没有显著差异(图 18C)。在接种肿瘤后第21天(过继转移后8天)，当比较WT和Nr4a  TKO  TIL时，PD-1表达轻微 降低但统计学上有显著性，并且总PD-1高群体向TIM3低表达显著倾斜(图9E，顶部图)；在 Nr4a  TKO  TIL中，TIM3低群体向着TCF1低表达倾斜(图18D，底部)。在效应子功能测试中，与 WT  TIL相比，Nr4a  TKO中表达TNF以及IFNγ和TNF的细胞百分比显著更高(图9F)。从总体上 看，TCF1、Tbet或Eomes的MFI没有显著差异(图18D，顶部)。 [0320] 通过RNA-seq和ATAC-seq分析Nr4a  TKO和WT  TIL中与效应子功能相关的全基因组 变化。RNA-seq识别了1,076个差异表达基因，其中536个基因在Nr4a  TKO  TIL中表达更高， 而540个基因在WT  TIL中表达更高(图10A、图19A)。使用来自从感染LCMV的小鼠17分离的效 应子、记忆和耗竭(PD-1高TIM3高)群体的基因集进行的基因集富集分析(GSEA)32表明，Nr4a  TKO  TIL广泛地富集了与效应子功能相关的基因(图10A、图19B、19C)。具体地，在Nr4aTKO  TIL中上调编码IL-2Rα、TNF和颗粒酶的mRNA，这与在再刺激时观察到的TNF的生产增加相一 致(图9G)。相反，与WT  TIL相比，在天然/记忆T细胞中与效应子群体相比通常被上调的基因 (例如Sell(编码L-选择蛋白/CD62L)和Ccr7)在Nr4a  TKO中被下调(图10A)。与WT  TIL相比， Nr4a  TKO中通常在低反应性T细胞(包括Pdcd1、Havcr2、Cd244、Tigit和Cd38)中上调的抑制 性表面受体也下调(图10A)。 60 CN 111601882 A 说　明　书 55/77 页 [0321] 为了识别单个Nr4a蛋白的转录靶标，考虑了在Nr4aTKO  TIL中与WT  TIL相比差异 表达的基因(图10)，并根据Nr4a异位表达时它们的表达是否改变来聚类(图10B)。聚类1和2 含有在不存在Nr4a的情况下被下调而在异位表达Nr4a的细胞中被上调的基因,这些基因包 括在聚类1中的Pdcd1、Havcr2、Cd244和在聚类2中的Tox、Tigit和Cd38。聚类4包含的基因， 特别是Tnf和Il21，在不存在Nr4a的情况下被上调，而在异位表达Nr4a的细胞中被下调。值 得注意的是，Runx3并非在Nr4a  TKO与WT  TIL相比差异化表达的基因之中，尽管先前的出版 物已将其识别为CD8 T细胞发育过程中Nr4a的下游靶标33，并且其过表达有助于肿瘤消 退34。 [0322] ATAC-seq揭示了WT和Nr4a  TKO  TIL之间约2500个差异可及的区域(图10C)。在 Nr4a  TKO  TIL中丢失的区域中，相当一部分 含有Nr4a结合基序，较小的子集含有 NFAT结合位点(图10C)。在Nr4a  TKO的比WT  TIL更易可及的区域中，～71％富集了共有bZIP 家族基序，约25％富集了共有Rel/NFKB结合基序，证实了bZIP(Fos、Jun、ATF、CREB等)和 Rel/NFKB家族成员在T细胞活化和效应功能的已确定的作用。这些数据也与以前的出版物 是一致的，表明Nr4a和NFKB之间存在负串扰35,36。因此，Nr4a  TKO  TIL通过几种独立的措施 展示出强大的效应子功能：改变基因表达谱，从而降低抑制性受体的表达且增加细胞因子 的产生；以及在可及的染色质区域中强烈富集与效应子功能有关的转录因子的结合基序。 [0323] 为了确定富集Nr4a基序的差异化可及区域是否实际上结合Nr4a，使用CD8 T细胞 中异位表达的单个带有HA标签的Nr4a蛋白，并通过使用抗HA抗体的染色质免疫沉淀确认 Nr4a的结合，然后对所选择的被差异化表达的基因座中的差异化可及区域进行qPCR。例如， 在初始和记忆T细胞中高表达而在效应细胞中表达降低37的基因Ccr7，在效应子样的Nr4a  TKO中的表达比在WT(更耗竭)TIL中的少(图20A)；与较低的表达一致，Ccr7的远端5'区域具 有至少两个ATAC-seq峰，这在Nr4a  TKO中不如在WT  TIL中突出，并且包含相邻的NFAT和 Nr4a结合基序(图20A，左图，黑线)。ChIP-qPCR显示异位表达的Nr4a结合这两个Ccr7增强子 区域(图20A，左图，黑线；以及右图，柱状图)。相反，Ccr7的近端启动子区域和第一内含子具 有ATAC-seq峰，与WT  TIL相比，其在Nr4a  TKO中更为突出，并包含bZIP和NFKB基序(图20，左 图，蓝线)。在图19A中示出了其他例子(Ifng、Ccr6)(Ifng、Ccr6：左图，基因组浏览器视图， 桃红色标记的NFAT和Nr4a基序，蓝色标记的bZIP和NFkB基序；右图，ChIP-qPCR，Nr4a结合至 所示的可及区域)。在差异可及的区域富集bZIP基序的基因的例子包括Il21，它编码参与效 应子功能的细胞因子38，并且与WT  TIL相比在Nr4a  TKO中表达更高(图10A)；与WT  TIL相比， Il21启动子的两个区域在Nr4a  TKO中获得可及性，其中一个含有bZIP基序(图20B)。类似 地，在Nr4a  TKO  TIL中，细胞因子TNF在mRNA(图10A)和蛋白质(图10A)水平上都更高地表 达，并且Tnf基因座在Nr4a  TKO  TIL的整个启动子和整个基因中都显示出广泛增加的可及 性(图20B)。 [0324] 在Pdcd1基因座(编码PD-1)的染色质可及性检查显示，Nr4a家族成员中每一个都 至少部分负责增加位于Pdcd1转录起始位点(图10C，灰色框) 5'处的增强子的可及 性，这在迄今为止研究的所有耗竭或功能失调的小鼠模型中均已被注意到17-19,21,29。标记该 增强子的ATAC-seq峰在Nr4a  TKO中比在WT  CAR  T细胞中减少，而与仅用空载体转导的细胞 相比，在异位表达Nr4a1、Nr4a2或Nr4a3的T细胞中增加。ChIP-qPCR显示全部三个Nr4a家族 成员都在PD-1基因座的该增强子区域结合(图10C，右)。值得注意的是，以前的出版物21支持 61 CN 111601882 A 说　明　书 56/77 页 在Nr4a  TKO  TIL中观察到的PD-1MFI的小幅下降，显示缺失 增强子区域会导致EL-4 胸腺瘤细胞系中PD-1染色的平均荧光强度的小幅下降。 [0325] 工程化的NFAT蛋白CA-RIT-NFAT1用于模拟不能与AP-1(Fos-Jun)形成协同转录复 合物的去磷酸化细胞核NFAT16。与模拟处理的细胞相比，CA-RIT-NFAT1转导的细胞表达更高 水平的Nr4a转录因子以及抑制性受体，并显示出模仿体内耗竭的转录程序，尤其是“功能失 调”的早期阶段16-18。ATAC-seq数据的全基因组分析显示，与Nr4a  TKO  TIL相比在WT中更易 可及的区域，与模拟转导的细胞相比，也在表达CA-RIT-NFAT1的培养细胞中更易可及，并且 与空载体转导的细胞相比也在表达Nr4a的细胞中更易可及(图4E)。因此，对体内NR4A活性 降低敏感的调节元件对组成型NFAT和NR4A活性的体外诱导敏感。相反，与WT  TIL相比在 Nr4a  TKO  TILs中更易可及的区域，与静止细胞相比在PMA/离子霉素刺激的细胞中更易可 及(图10C)。由于PMA/离子霉素刺激参与了bZIP和NFKB家族成员活性，这些数据表明，与WT  TIL相比，Nr4a  TKO  TIL的体内效应子功能和基因表达的增加与这些转录因子的活性增加 有关。 [0326] Nr4a转录因子是NFAT下游CD8 T细胞低反应性程序的重要冗余效应子(图10C)。每 个单独的Nr4a蛋白的异位表达都会抑制细胞因子的功能。相反，缺失所有三种Nr4a蛋白的 TIL表现出效应子功能的基因表达谱特征，包括颗粒酶和细胞因子的表达增加。Nr4a  TKO  TIL在含有bZIP和Rel/NFKB家族转录因子的结合位点的区域也显示出染色质的可及性增 加，这与经典的T细胞活化程序有关。因此，Nr4a的缺失导致产生能够发生T细胞活化的基因 组格局。另外，Nr4aTKO  CAR  TIL表现出更高的TIM3-TCF1-群体频率(图12D，底部)，这可能 表现出增强的效应子功能，并且与TIM3-TCF1 记忆/前体群体39-42不同，后者在PD-1阻滞后 扩增但在Nr4a  TKO  CAR  TIL中的数量少于在WT  CAR  TIL中的数量39。 [0327] 无论是在我们自己的研究还是来自其他实验室先前发表的数据中，PD-1和Nr4a之 间存在明显的关系17-19,21 ,29。在体外任何单个Nr4a家族成员的异位表达都会导致PD-1在蛋 白质和mRNA水平的上调，以及在Pdcd1基因座的-23kb上游增强子区域的可及性增加。与WT  CAR  TIL相比，Nr4a  TKO  CAR  TIL在该增强子上的可及性降低，并且全部三个Nr4a家族成员 都在细胞中结合该增强子。综上所述，这些数据表明三重Nr4a缺失的作用在功能上与PD-1 阻断作用有些相似(图10C)，但由于影响大范围的调控元件，Nr4a缺失作用比单独的PD-1阻 断作用更广泛。换句话说，PD-1可能只是在小鼠和人类T细胞中由NFAT/Nr4a轴调控的许多 基因之一，其他基因编码其他抑制性受体，包括CTLA4、TIM3、LAG3和TIGIT。 [0328] 免疫细胞疗法为癌症的治疗提供了广阔前景43,44。在某些情况下，可以通过阻断抑 制性受体(例如PD-1和CTLA4)的抗体，使不能有效排斥肿瘤的内源性CD8 T细胞发挥功 能45-47。然而，用单独的阻断抗体治疗很少实现完全治愈，因此癌症免疫治疗领域正朝着对 多种抑制性受体的阻断抗体的治疗前进。NFAT/Nr4a轴控制多种抑制性受体的表达，并且在 功能上用缺失所有三种Nr4a转录因子的CAR  T细胞治疗荷瘤小鼠会导致肿瘤消退并延长生 存期。因此，在肿瘤浸润性T细胞中抑制Nr4a家族成员的功能可能是癌症免疫疗法的有前途 的策略。 材料和方法 含有嵌合抗原受体(CAR)的逆转录病毒载体(MSCV-myc-CAR-2A-Thy1.1)的构建。 [0329] 使用克隆的FMC63人类CD19单链可变片段的公开部分22,23以及鼠CD28和CD3ζ序列 62 CN 111601882 A 说　明　书 57/77 页 的公开部分1将嵌合抗原受体组装在一起。N末端上的myc标签的序列获得自已发表的著 作48。然后，将该嵌合抗原构建体代替PGK-puro克隆到MSCV-puro(Clontech)鼠逆转录病毒 载体中。 [0330] CAR构建体的多核苷酸序列在SEQ  ID  NO：1中提供。 [0331] CAR构建体的氨基酸序列在SEQ  ID  NO：2中提供。 含有huCD19的逆转录病毒载体的构建。 [0332] PCR扩增编码huCD19的DNA片段，并将其克隆到MSCV-puro(Clontech)鼠逆转录病 毒载体中。 含有Cre(MSCV-Cre-IRES-NGFR)和Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3(MCSV-HA-Nr4a1-IRES-NGFR、 MCSV-HA-Nr4a2-IRES-NGFR、MCSV-HA-Nr4a3-IRES-NGFR)的逆转录病毒载体的构建。 [0333] PCR扩增编码Cre的DNA片段，并将其克隆到MSCV-IRES-NGFR(Addgene质粒#27489) 中。编码Nr4a1的DNA片段(C .-W .J .Lio馈赠，La  Jolla  Institute  for  Allergy  and  Immunology,La  Jolla,CA)，用5'HA标签进行PCR扩增，并将其克隆到MSCV-IRES-NGFR中。用 5'HA-标签PCR扩增编码Nr4a2(Addgene质粒#3500)的DNA片段，并将其克隆到MSCV-IRES- NGFR中。用5'HA-tag  PCR扩增编码Nr4a3的DNA片段(DNASU质粒#MmCD00080978)，并将其克 隆到MSCV-IRES-NGFR中。 真核细胞系。 [0334] EL4小鼠胸腺瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)：EL4( TIB- 39TM，小家鼠T细胞淋巴瘤)。先前已经描述了表达卵清白蛋白的B16-OVA小鼠黑素瘤细胞 系18(S .Schoenberger馈赠，La  Jolla  Institute  for  Allergy  and  Immunology ,La  Jolla,CA)。293T细胞系购自ATCC：293T( CRL-3216TM)。铂金-E逆转录病毒包装细胞 系、嗜热性(PlatE)细胞系购自Cell  BioLabs，Inc:RV-101。MC-38小鼠结肠腺癌细胞系 (A.W.Goldrath馈赠，UCSD,La  Jolla,CA)，最初购自Kerafast,Inc(ENH204)。 表达huCD19的小鼠肿瘤细胞系的构建。 [0335] 用含有人类CD19(huCD19)的两性病毒转导B16-OVA、EL4和MC-38细胞，然后分选表 达高水平huCD19的细胞。 用于肿瘤接种的B16-OVA-huCD19黑色素瘤细胞的制备。 [0336] 在含有10％(体积/体积)FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的Dulbecco培养 基(DMEM)中培养B16-OVA-huCD19细胞，并在接种前传代3次。在注射时，将细胞用胰蛋白酶 消化，并以每毫升一千万个细胞重悬于不含酚红的Hanks平衡盐溶液中。向C57BL/6J雄性小 鼠(8-12周龄)皮内注射500,000B16-OVA-huCD19细胞(每次注射50μL)。 用于肿瘤接种的MC38-huCD19结肠腺癌细胞的制备。 [0337] 在含有10％(vol/vol)FBS、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM  Hepes、1％L- 谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的Dulbecco培养基(DMEM)中培养MC38-huCD19细胞并在接种 前传代两次。在注射时，将细胞用胰蛋白酶消化，并以每毫升一千万个细胞重悬于不含酚红 的Hanks平衡盐溶液中。C57BL/6J雄性小鼠(8-12周龄)皮内注射500,000个MC38-huCD19细 胞(每次注射50μL)。 小鼠 [0338] C57BL/6J、B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ、Rag  1-/-小鼠购自Jackson  Laboratories。 63 CN 111601882 A 说　明　书 58/77 页 经Pierre  Chambon许可，从Takashi  Sekiya和Akihiko  Yoshimura处获得了Nr4a基因破坏 的品种。雄性和雌性小鼠均用于研究。将小鼠进行年龄匹配，用于实验时在8-12周龄之间， 将荷瘤小鼠首先进行肿瘤大小匹配，然后随机分配到实验组中。所有小鼠均在La  Jolla  Institute  for  Allergy  and  Immunology的动物设施中饲养和/或饲养。所有实验均按照 LJI  Institute  Animal  Care  and  Use  Committee(IACUC)的规定进行。 B16-OVA-huCD19肿瘤模型。 [0339] 对于CAR  CD8 TIL和内源性CD8 TIL的分析：在第0天，8-12周龄C57BL/6J小鼠皮内 注射5x105  B16-OVA-huCD19细胞。在肿瘤变得明显后，每隔一天用手动卡尺记录肿瘤测量 值，并以平方厘米(长x宽)计算肿瘤面积。在第13天，将150万个CAR转导的CD45.1 CD8 T细胞 过继转移到肿瘤大小匹配的荷瘤小鼠中。在第21天，收获小鼠的肿瘤和脾脏。对于缺失Nr4a 家族成员的CAR  CD8 TIL的分析：在第0天，8-12周龄的Rag1-/-小鼠皮内注射5x  105B16- OVA-huCD19细胞，在其变得明显后，每两天测量一次肿瘤。在第13天，150万个CAR-和空载体 pMIN转导的Nr4a1fl/fl  Nr4a2  fl/fl  Nr4a3 / 或CAR-和Cre转导的CD8 Thy1 .1 NGFR Nr4a1fl/fl  Nr4a2  fl/fl  Nr4a3-/-T细胞被过继转移到肿瘤大小匹配的荷瘤小鼠中。在第 21天，收获小鼠的肿瘤和脾脏。为了监测缺失Nr4a家族成员的CAR  T细胞过继转移后的用于 生存研究的肿瘤生长：在第0天，向8-12周龄的Rag1-/-小鼠皮内注射5x  105B16-OVA- huCD19细胞，在其变得明显后，每两天测量一次肿瘤。在第7天，将300万由CAR和空载体pMIN 转导或由CAR和Cre转导的CD8 Thy1 .1 NGFR Nr4a的小鼠T细胞(组合产生如图8所列的 Nr4a1  KO、Nr4a2  KO、Nr4a3  KO、Nr4a  TKO、WT)过继转移到肿瘤大小相当的荷瘤小鼠中。然 后监测肿瘤的生长直至肿瘤接种后第90天的实验终点或IACUC终点。 用于过继转移的细胞的制备。 [0340] 分离CD8 T细胞，并用1ug/mL抗CD3和1ug/mL抗CD28激活1d，然后从激活中移出并 在37℃，2000g下用表达CAR、Cre、pMIN或以上组合的逆转录病毒转导1h。转导后，立即用含 有100U  IL-2/mL的培养基替换细胞。第一次转导后第1d，进行第二次转导，转导后细胞立即 替换含100U  IL-2/mL的培养基。在过继转移的当天(激活后第3天或第5天)，通过流式细胞 仪分析细胞，并使用血细胞计数器获得细胞计数。使用来自血细胞计数器的细胞计数和从 流式细胞仪获得的群体百分比，获得了CAR转导的细胞数量。然后收集细胞，用PBS洗涤，并 以与每200uL  PBS  150万或300万CAR转导的细胞相当的浓度重悬。然后每次200uL眶后静脉 注射剂过继转移小鼠。 用于后续分析的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分离。 [0341] 来自CAR和OT-I实验的TIL流式细胞术的样品制备：在第21天，对小鼠实施安乐死 并用PBS灌注，然后去除肿瘤。收集肿瘤，按组汇总，均质化，然后根据供应商的说明使用 MACS  Miltenyi小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi  Biotec)和具有Octo  Heaters的gentleMAC 解离器(Miltenyi  Biotec)进行解离。然后将肿瘤通过70uM过滤器过滤并离心。吸出上清 液，使用Dynabeads  FlowComp小鼠CD8分离试剂盒(Invitrogen)，将肿瘤重悬成相当于每 5mL  1％FBS/PBS  4-5克的肿瘤，用于CD8阳性分离。在阳性分离后，将细胞分成等量，用流式 细胞仪进行染色和表型鉴定，或将其染色用于细胞分选。来自Nr4a  WT和Nr4a  TKO实验的 TIL的流式细胞术的样品制备见下段。 [0342] 在第21天，对小鼠实施安乐死并用PBS灌注，然后移除肿瘤。收集肿瘤，按组合并， 64 CN 111601882 A 说　明　书 59/77 页 均质化，然后根据制造商的说明使用MACS  Miltenyi小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi  Biotec)和配备Octo  Heaters的gentleMAC解离器(Miltenyi  Biotec)进行解离。然后将肿 瘤通过70uM过滤器过滤并离心。吸出上清液，在15mL锥形管中将肿瘤重悬于40％Percoll/ RPMI中和位于其下的80％Percoll/PBS中，以形成80％/40％Percoll不连续密度梯度。在带 有摇动桶的大型台式离心机中，在室温下以1363g将样品离心30分钟。从80％/40％Percoll 界面收集TIL，并使用CD90.2微珠(Miltenyi  Biotec)和磁力分离技术进一步纯化。阳性分 离后，将细胞分成等量用流式细胞仪进行染色和表型鉴定，或将其染色用于细胞分选。 转染 [0343] 按照制造商关于 -LT1转染试剂(Mirus  Bio  LLC)的说明，使用pCL10A1和 pCL-Eco包装载体(前者用于huCD19病毒，后者用于所有其他生产的病毒)，以10厘米皿形式 进行转染。 逆转录病毒转导。 [0344] 逆转录病毒转导以6孔板形式进行，每孔使用3mL  0.45uM过滤的病毒和8ug/mL的 聚乙烯。使用1.5mL每种病毒进行两次转导，总计3mL。在预热的离心机中，于37℃以2000g离 心细胞1小时。转导后，立即使细胞替换含有100U  IL-2/mL的培养基。第二天进行第二次转 导。 抗体 [0345] 荧光染料偶联的抗体购自Biolegend、BD  Sciences、eBioscience和Cell  Signaling  Technologies。用于染色质免疫沉淀的第一抗体购自Cell  Signaling  Technologies。 表面标记染色 [0346] 离心细胞，并用终浓度为1：200的抗体在50％的2.4G2(Fc阻滞)和50％的FACS缓冲 液(PBS 1％FBS，2mM  EDTA)中染色15分钟。 细胞因子再刺激和染色。 [0347] 染色之前，将细胞在含有10nM  PMA和500nM离子霉素以及1ug/mL  Brefeldin  A的 培养基中于37℃孵育4小时。在再刺激后，如上文的表面标记染色方案中所述，用活/死染料 将细胞表面标记染色。然后将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用1X  BD  Perm/Wash(BD  Biosciences)透化30分钟，然后在1X  BD  Perm/Wash缓冲液中以终浓度1：200染色细胞因 子。根据制造商的说明制备1X  BD  Perm/Wash缓冲液。所有洗涤步骤均使用FACS缓冲液(PBS 1％FBS，2mM  EDTA)进行。 TF染色 [0348] 如上文的表面标记染色方案所述，用活/死染料将细胞表面标记染色。然后按照制 造商的说明，使用Foxp3/转录因子染色试剂盒(eBioscience)将细胞固定、透化并染色。所 有转录因子抗体均以1：200的最终浓度使用。Ki67抗体的最终浓度为1：100。 流式细胞仪分析 [0349] 所有流式细胞仪分析均使用LSRFortessa(BD  Biosciences)或LSR-II(BD  Biosciences)进行。使用FlowJo  v.10(Tree  Star，Inc)分析流量数据。相关的样品设门已 在图中提供。 统计分析。 65 CN 111601882 A 说　明　书 60/77 页 [0350] 使用适当的统计比较，对涉及实验的流式细胞术数据和肿瘤生长数据进行统计分 析，该统计学比较包括根据需要具有Welch校正的成对或不成对的双侧t检验，多重比较检 验(Tukey或Dunnett检验)的单向ANOVA，或普通的双向ANOVA(Prism  7，GraphPad软件)。使 用Log-rank(Mantel-Cox)检验进行生存曲线的统计分析(Prism  7，GraphPad  Software)。p 值<0.05被认为具有统计学意义。 体外杀伤试验。 [0351] 将10,000个B16-OVA-huCD19细胞接种在100uL  T细胞培养基中，同时将靶细胞(或 仅用于背景的培养基)加入到E板96(ACEA  Biosciences  Inc.,San  Diego,CA)中的每个孔 中。30分钟后，将板置于xCELLigence实时细胞分析(RTCA)仪器(ACEA  Biosciences  Inc., San  Diego,CA)中并孵育过夜。第二天，将板从xCELLigence  RTCA机器中移除，并在加入CD8 CAR  T细胞额外的100uL  T细胞培养基作为效应细胞加入30分钟(用于裂解阳性对照，使用 0.2％TritonX；用于裂解阴性对照，仅使用了培养基)。然后将板放回培养箱中，开始数据采 集。5小时后，从每个孔获得细胞指数(CI)。计算每个孔的特异性裂解百分比如下：％特异性 裂解百分比＝100-(CI每孔/(CI阳-CI阴))*100。在第4天接种前3天将B16-OVA-huCD19细胞融化 (通常在接种时出现)；在实验之前制备小鼠CD8 CAR  T细胞，并在激活CD8 T细胞后第5天将 其加入到靶细胞中。 染色质免疫沉淀和定量实时PCR(ChIP-qPCR)。 [0352] 如先前文献所述49进行ChIP。简而言之，如上从C57BL/6J小鼠中分离CD8 T细胞，用 板结合的抗CD3/CD28激活，用空载体对照或表达Nr4a1、Nr4a2或Nr4a3且在N端带有血凝素 (HA)标签的逆转录病毒转导。转导后将细胞培养总共5天。为了固定，将甲醛(16％， ThermoFisher)直接加入到细胞中至终浓度为1％，并在室温下不断搅拌孵育10分钟。加入 甘氨酸(最终125mM)以结束固定，并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。细胞团块用液氮速冻，并保 存在-80℃直至使用。为了分离细胞核，将细胞团块在冰上融化并用补充有1％Halt蛋白酶 抑制剂(ThermoFisher)的裂解液(50mM  HEPES  pH  7.5、140mM  NaCl、1mM  EDTA、10％甘油、 0.5％NP40、0.25％Triton-X100)在4℃下持续旋转裂解10分钟。用洗涤缓冲液(10mM  Tris- HCl  pH  8.0、200mM  NaCl、1mM  EDTA、0.5mM  EGTA、1％Halt蛋白酶抑制剂)洗涤一次，然后用 剪切缓冲液(10mM  Tris-HCl  pH  8.0、1mM  EDTA、0.1％SDS、1％Halt蛋白酶抑制剂))洗涤两 次。将细胞核重悬于1mL剪切缓冲液中，转移至1mL  milliTUBE(Covaris，Woburn，MA)中，并 用Covaris  E220超声处理18分钟(占空比5％，强度140瓦，每次循环200次burst)。超声处理 后，通过在4℃下以20,000x  g离心10分钟来去除不溶性碎片。染色质浓度使用Qubit  DNA  BR分析法(ThermoFisher)进行定量。为了进行免疫沉淀，将25ug的染色质移出并与等体积 的2x转化缓冲液(10mM  Tris-HCl  pH  7.5、280mM  NaCl、1mM  EDTA、1mM  EGTA、0.2％脱氧胆 酸钠、0.2％Triton-X100、1％Halt蛋白酶抑制剂)在2mL低结合试管(Eppendorf)中混合。输 入染色质的5％或6％被保存为对照。染色质使用30uL洗涤过的蛋白A磁珠(ThermoFisher) 在4℃持续旋转下预清洁1h。将预清洁的染色质转移到新试管中，加入10ug兔单克隆抗HA (C29F4，Cell  Signaling  Technology)和30uL洗涤过的蛋白A磁珠，并在4℃下持续旋转孵 育过夜。结合磁珠的染色质用RIPA缓冲液(50mM  Tris-HCl  pH  8.0、250mM  LiCl、1mM  EDTA、 1％脱氧胆酸钠、1％NP-40、0.1％SDS)洗涤两次，用高盐洗涤缓冲液(50mM  Tris-HCl  pH  8.0、500mM  NaCl、1mM  EDTA、1％NP-40、0.1％SDS)洗涤一次，用锂洗涤缓冲液(50mM  Tris- 66 CN 111601882 A 说　明　书 61/77 页 HCl  pH  8 .0，150mM  NaCl，1mM  EDTA，1％的脱氧胆酸钠，1％的NP-40)洗涤一次，并用TE (10mM  Tris-HCl  pH  8.0，1mM  EDTA)洗涤一次。将所有洗涤液在恒定旋转下于4℃孵育5分 钟。在0.5mg/mL  RNaseA(Qiagen)存在下，在室温下与洗脱缓冲液(100mM  NaHCO3，1％SDS) 孵育30分钟，从磁珠上洗脱染色质。为了使蛋白质和DNA解交联，将蛋白酶K(最终0.5mg/mL) 和NaCl(最终200mM)加入到回收的上清液中，并在65℃下在ThermoMixer(Eppendorf)中持 续摇动(1000rpm)孵育过夜。根据制造商的手册，使用Zymo  ChIP  DNA清洁和浓缩试剂盒 (Zymo  Research)纯化DNA。使用Power  SYBR  Green  PCR  Master  Mix(Roche)和StepOne  Real  Time  PCR系统(ThermoFisher)通过qPCR分析洗脱的DNA。将来自ChIP样本的信号归一 化来形成输入的信号，并计算为“输入百分比”。 ChIP  qPCR引物(所有坐标均为mm10)。 [0353] 1)chrX：7584283-7584409  127bp：Fp3-CNS2-qF(正向)CCCAACAGACAGTGCAGGAA， (反向)Fp3-CNS2-qR  TGGTGTGACTGTGTGATGCA。2)chr1：94074907-94075062  156bp：Pd1.4A_ qF1(正向)ACCTTTCCTGTGCCTACGTC，Pd1.4A_qR1(反向)TAAGAGTGGTGGTGGTTGGGGG。3)chr11： 99163437-99163632  196bp：CCR7_E1_F1(正向)GGCTCTACTGCCCTGTTGTC，CCR7_E1_R1(反向) AACACATCATTTTGCCGTGA。4)chr11：99168432-99168614  183bp：CCR7_E2_F1(正向) GGACACAGACGGGTGAGTTT，CCR7_E2_R1(反向)GGCCTGTGTTCAAATGAGGT。5)chr17：8196147- 81 96301  1 55 bp：CCR 6_F1 (正向) GGCAGG ATG TGG CTTTG TAT，CCR 6_R1 (反向) CCTGCATGTAGTGCTGACCA  6)chr10：118460432-118460610  179bp：IfngE_F1(正向) GCGCCTAGAAGTTCAGTGCT，IfngE_R1(反向)TTTGAGATGCAGCAGTTTGG。 细胞分选。 [0354] 使用FACSAria-I、FACSAria-II或FACSAria-Fusion(BD  Biosciences)，由LJI  Flow  Cytometry  Core进行细胞分选。对于ATAC-seq，除OT-I样品外，从分离的CD8 TIL中分 选出50,000个细胞，其中将15,000-30,000个细胞进行分选。在某些情况下，并行准备使用 50,000个额外细胞的第二个ATAC-seq技术重复试验。对于RNA-seq，从分离的CD8 TIL中分 选出10,000个细胞。对于CAR和OT-I实验，被分选出群体如下：CD8 CD45.1 Thy1 .1 PD-1高 TIM3高CAR(群体A)，CD8 CD45.1 Thy1.1 PD-1高TIM3低CAR(群体B)，CD8 CD45.1-Thy1.1-PD-1 高TIM3高内源性细胞(群体C)，CD8 CD45.1-Thy1 .1-PD-1高TIM3低内源性细胞(群体D)和CD8 CD45.1-Thy1.1-PD-1低TIM3低内源性细胞(群体E)和CD8 CD45.1 PD-1高TIM3高OT-I(群体F)。 对于Nr4a实验，被分选出的群体如下：CD8 Thy1.1 NGFR Nr4a  WT  TIL和CD8 Thy1.1 NGFR Nr4a  TKO  TIL。对于在体外异位表达Nr4a的实验，按设定水平的NGFR 表达对种群进行分 类。 ATAC-seq样品和文库制备。 [0355] 按文献25中的描述制备ATAC-seq样品，稍作改动。简而言之，将细胞分选到50％ FBS/PBS中，离心，用PBS洗涤一次，然后裂解。使用Nextera酶(Illumina)进行转座反应，并 使用MinElute试剂盒(Qiagen)进行纯化，然后使用条形码引物进行10-12个循环PCR扩增 (KAPA  Biosystems)和进行2x  50个循环的配对末端测序(Illumina)。 ATAC序列分析。 [0356] FASTQ格式的测序读出序列是从Illumina  Basespace(用于小鼠数据集)生成的， 或者是从已发表的数据19,21生成的。使用bowtie(1.0.0版50，参数“-p  8-m  1-best-strata- 67 CN 111601882 A 说　明　书 62/77 页 X  2000-S-fr--chunkmbs  1024”)将读出序列映射到小鼠(mm10)或人类(hg19)基因组。在尝 试再次使用上述参数映射之前，以trim_galore使用参数“--paired--nextera--length  37--stringency  3-three_prime_clip_R1  1--three_prime_clip_R2  1”处理未映射的读 出序列。将这两个bam文件合并，以删除映射到线粒体基因组的读出序列和重复读出序列 (使用picard  MarkDuplicates)。对于小鼠数据集，此时将技术性重复实验合并为单个生物 重复。对于人类数据集，排除覆盖率低或不符合质量控制指标的样本。对于具有两个技术性 重复实验的一个人类样品，这些重复实验结果非常匹配，因此选择1号进行分析。使用通过 ATAIPS-seq捕获的完整片段，在使用MEDIPS51的10bp窗口上计算单个重复的基因组覆盖率， 并使用Java  Genomics  Toolkit52为每个组生成平均覆盖率。 [0357] 为了鉴定峰，使用“'{if(sqrt(\$9*\$9)<100){print\$0}}'”以samtools和awk处 理包含唯一、非chrM读值的bam文件，以鉴定无核小体的DNA长度小于100nt的片段。这些亚 核小体片段被用于使用参数“--nomodel--keep-dup  all--call-summits”对MACS2的每个 重复进行峰分析。对于峰调用，对于小鼠数据集q截止值为0.0001，以及对于人类数据集q截 止值为0.01。所有重复样本中每个峰的峰均扩展到统一大小为200bp小鼠数据集区域和统 一大小为300bp人类数据集区域。来自所有重复项的这些区域合并为一组全局峰，并进行过 滤以除去Y染色体上或与ENCODE黑名单区域重叠的峰53,54。 [0358] 总结重叠(Summarize  Overlap)用于计算与来自所有重复的每个峰重叠的转座酶 插入数量27。对于差异覆盖，所有样品的所有重复样品的每个峰中的原始ATAC-seq计数均使 用voom进行了标准化55。使用limma进行成对对比，并根据fdr调整的p值小于0.01和估计的 倍数变化至少为4来过滤差异可及区域。每个峰和可及区域的ATAC-seq密度(每百万映射的 读出序列的每千碱基转座酶插入位点数)和可及区域定义为每千碱基均具有5个标准化插 入的平均值。HOMER56用于鉴定富集在不同峰组中的转录因子结合位点的基序。 RNA-seq样品和文库制备。 [0359] 使用RNeasy  Micro  Kit(Qiagen)提取总RNA。如文献24所述制备SMARTseq2文库。简 而言之，将纯化的RNA与polyA杂交以富集mRNA，然后在18个循环的PCR预扩增步骤之前对 mRNA进行逆转录和模板转换。然后使用AMPure  XP珠粒(Beckman  Coulter)进行PCR纯化。使 用Agilent高灵敏度DNA芯片对cDNA文库进行质量检查，并使用Nextera  XT  LibraryPrep试 剂盒(Illumina)将1ng输入的cDNA进一步用于文库制备。带标签的DNA用12个循环的PCR扩 增，然后再次用AMPureXP珠纯化。使用Agilent高灵敏度DNA芯片评估文库大小分布和产量。 以等摩尔比合并文库，并在具有50nt单端循环的HiSEq2500(Illumina)上以快速运行方案 进行测序。 RNA序列分析。 [0360] 使用TrimGalore！v0 .4 .5，以默认参数，保留最小长度为36bp读出序列，在原始 RNA-seq读出序列上进行质量和衔接子修饰(http://www.bioinformatics.babraham.ac. uk/projects/trim_galore/)。使用STAR  v2.5.3a26以比对参数outFilterMismatchNmax  4 将生成的单端读数与小鼠基因组mm10进行比对。合并技术性重复。采用小鼠基因组mm10的 转录注释，在基因水平上进行RNA-seq分析。使用Bioconductor软件包GenomicAlignments  v1.10.1的summaryOverlaps函数(mode＝“Union”)对与注释特征对齐27的读出序列进行计 数。DESeq2软件包v1.14.128用于标准化原始计数并识别差异表达的基因(除非另有说明，否 68 CN 111601882 A 说　明　书 63/77 页 则FDR截止值p<0.1)。在所有比较中，作为起始步骤，预先过滤了总读出序列小于10的基因。 在DESeq2中计算了转换后的值(rlog)，以进行数据可视化。 单细胞RNA序列分析。 [0361] 数据是从先前发表的关于人类黑素瘤肿瘤细胞生态系统的研究中获得的20。简而 言之20，按单细胞RNA-seq(scRNA-seq)恶性和非恶性细胞(包括免疫细胞、基质细胞和内皮 细胞)进行分析。归一化的表达值(Ei ,j＝log2(TPMi ,j/10 1)，其中TPMi ,j指细胞j中基因i的 百万分转录本(TPM))是从Gene  Expression  Omnibus(GSE72056)获得的。为了进行分析，仅 保留了至少10个细胞中具有非零表达值的基因。鉴于与scRNA-seq数据相关的技术噪音和 基因缺失57，将MAGIC算法以扩散参数t＝2用于归一化表达值矩阵的分配。MAGIC方法的R实 现从(https://www.krishnaswamylab.org/magic-project)下载。基于在文献20所述的C推 断细胞类型注释选择肿瘤浸润T细胞。基于CD8A(估算值≥4的细胞)和CD4(估算值≤1.5的 细胞)的表达选择T细胞。估算值用于基因表达可视化。 基因集富集分析(GSEA)。 [0362] 采用GSEA预排序功能进行基因集合富集分析(GSEA)32，根据相关比较按log2倍变 化对基因进行排名，排列数量为10,000，并允许多达2000个基因的基因集合大小。从差异表 达的基因中定义基因集，该差异表达的基因是来自先前公开的研究17中在效应子、记忆和耗 竭的CD8 T细胞之间的成对比较获得的。在这种情况下，采用DESeq2鉴定了差异基因表达， FDR截止值为p<0.01，log2倍数变化截止值为1。 数据报告。 [0363] 没有使用统计方法来确定样本量。在实验和结果评估过程中，研究人员并非盲法 地进行小组分配。 数据可用性。 [0364] 在文中可获得产生的和支持其发现的所有数据。RNA-seq和ATAC-seq数据已保存 在Gene  Expression  Omnibus(GEO)中，论文公开后可获得登录号。其他信息和材料将根据 要求提供。 材料与方法 小鼠。 [0365] C57BL/6N小鼠购自Charles  River实验室。Tox  2基因KO菌株获自Avinash  Bhandool博士(NIH,Baltimore,MD)。Rag  1-/-小鼠获自Jackson  Laboratories。雄性和雌 性小鼠均用于研究。小鼠是年龄相符并在用于实验时在8-12周之间，将荷瘤小鼠首先进行 肿瘤大小匹配，然后随机分配至实验组。所有小鼠均在拉荷亚免疫研究所的动物设施中饲 养并维护。所有实验均按照LJI机构动物护理和使用委员会(IACUC)的规定进行。 制备CAR-T细胞。 [0366] 分离CD8  T细胞并用1ug/ml抗CD3和1ug/m抗CD28激活1d，然后从激活中移出并用 表达CAR、非靶向shRNA、靶向TOX的shRNA或上述组合的逆转录病毒转导1h  2000g37℃。转导 后，立即用含有100U  IL-2/ml的培养基替换细胞。第一次转导后1d，进行第二次转导，转导 后立即用含100U  IL-2/ml的培养基替换细胞。在过继转移的那天，通过流式细胞仪分析细 胞，并使用血细胞计数器获得细胞计数。使用从血细胞计数仪获得的细胞计数和从流式细 胞仪获得的群体百分比，获得了CAR转导的细胞数量。 69 CN 111601882 A 说　明　书 64/77 页 B16-OVA-huCD19肿瘤模型。 [0367] 对于CAR  CD8 TIL的分析：在第0天，8-12周龄的C57BL/6N小鼠皮内注射500K  B16- OVA-huCD19细胞。在肿瘤变得可触知后，每隔一天用手动的卡尺记录肿瘤测量值，并以平方 厘米(长x宽)计算肿瘤面积。在第12天，将300万转导的TOX2 / T细胞或CAR-的CAR-和非靶 向shRNA载体和转导的TOX2-/-T细胞的TOX靶向shRNA载体过继转移至肿瘤大小匹配的荷瘤 小鼠中。在第24天，收获小鼠的肿瘤。为了在缺失TOX家族成员的CAR  T细胞过继转移后监测 生存研究的肿瘤生长：在第0天，8-12周龄的C57BL/6N小鼠皮内注射500K  B16-OVA-huCD19 细胞。在肿瘤变得可触知后，每隔一天用手动的卡尺记录肿瘤测量值，并以平方厘米(长x 宽)计算肿瘤面积。在第12天，将300万转导的TOX2 / T细胞或CAR-的CAR-和非靶向shRNA载 体和转导的TOX2-/-T细胞的TOX靶向shRNA载体过继转移至肿瘤大小匹配的荷瘤小鼠中。然 后监测肿瘤的生长直至肿瘤接种后的实验终点或IACUC终点。 细胞因子再刺激和细胞内染色。 [0368] 对于细胞因子：染色前，将细胞在含有10nM  PMA和500nM离子霉素和1ug/ml布雷菲 德菌素A的培养基中于37度孵育4小时。重新刺激后，然后按照上文的表面标记染色方案中 所述，用活/死染料染将细胞表面标记染色。将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用1XBD  perm/Wash渗透30分钟，然后在1XBDperm/Wash缓冲液中以1：100的终浓度对细胞因子染色。 根据制造商的说明制备1XBD  perm/Wash缓冲液。对于转录因子：如上文的表面标记染色方 案所述，用活/死染料将细胞表面标记染色。然后按照制造商的说明使用Foxp3/转录因子染 色试剂盒(eBioscience)将细胞固定、渗透并染色。 等效物 [0369] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员通常所理解的相同含义。 [0370] 本文说明性地描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素， 一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛 地且不受限制地理解。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且 不打算使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是 它是应当认识到是在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。 [0371] 因此，应当理解是尽管已经通过优选实施方式和可选特征具体地公开了本发明， 但是本领域技术人员可以对这里所公开的本发明进行修改、改进和变化，并且这些修改、改 进和变化被认为在本发明的范围内。这里所提供的材料、方法和例子代表优选实施方式，是 示例性的，并且不意在限制本发明的范围。 [0372] 在此已经广泛和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的较窄的种类和亚类 分组中的每一个也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，无论本文中是否 具体叙述了切除的材料，其附带条件或否定限制从该属中去除了任何主题。 表格1：相对于WT  CAR  TIL，在Nr4a  TKO中差异表达的基因。将差异表达的基因(调整后 的p值<0.1，log2倍数变化≥1或≤-1)突出显示。 70 CN 111601882 A 说　明　书 65/77 页 71 CN 111601882 A 说　明　书 66/77 页 72 CN 111601882 A 说　明　书 67/77 页 73 CN 111601882 A 说　明　书 68/77 页 74 CN 111601882 A 说　明　书 69/77 页 表2：相对于WT  CAR  TIL，在Nr4a  TKO中差异表达的基因。将差异表达的基因(调整后的 p值<0.1，log2倍数变化≥1或≤-1)突出显示。 75 CN 111601882 A 说　明　书 70/77 页 76 CN 111601882 A 说　明　书 71/77 页 77 CN 111601882 A 说　明　书 72/77 页 参考文献 1.Kochenderfer,J.N.,Yu,Z.,Frasheri,D.,Restifo,N.P.&Rosenberg,S.A.Adoptive  transfer  of  syngeneic  T  cells  transduced  with  a  chimeric  antigen  receptor  that  recognizes  murine  CD19  can  eradicate  lymphoma  and  normal  B  cells.Blood  116,3875-3886(2010) . 2 .Milone ,M .C .et  al .Chimeric  receptors  containing  CD137  signal  transduction  domains  mediate  enhanced  survival  of  T  cells  and  increased  antileukemic  efficacy  in  vivo.Mol.Ther.17,1453-1464(2009) . 3.Davila,M.L.et  al.Efficacy  and  toxicity  management  of  19-28z  CAR  T  cell  therapy  in  B  cell  acute  lymphoblastic  leukemia.Sci.Transl.Med.6,(2014) . 4 .Maude ,S .L .et  al .Chimeric  Antigen  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GAATCTGGACCTGGACTCGTTGCCCCTTCCCAATCCCTTAGTGTTACATGCACTGTATCAGGTGTATCCCTCCCTGA TTACGGTGTCTCCTGGATTCGGCAGCCTCCTCGGAAGGGTCTCGAGTGGTTGGGAGTGATTTGGGGGTCTGAAACTA CTTATTATAACAGTGCCCTTAAGAGTAGATTGACTATAATTAAGGATAACAGTAAGTCACAAGTATTCCTCAAAATG AATTCCTTGCAAACAGACGATACAGCAATATATTACTGCGCAAAACACTACTACTATGGCGGTAGTTACGCTATGGA CTATTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACAGTTTCTAGCATTGAGTTCATGTATCCCCCACCTTACTTGGACAATGAAA GGTCTAATGGGACCATCATACACATTAAAGAGAAACACCTGTGTCATACTCAGAGTTCTCCAAAATTGTTCTGGGCC TTGGTTGTCGTTGCCGGCGTACTGTTCTGTTACGGTCTCTTGGTTACCGTGGCACTTTGTGTTATCTGGACTAATTC CCGGCGGAATCGGGGTGGACAGAGCGATTACATGAATATGACCCCAAGAAGACCTGGACTGACCAGGAAACCATATC AACCCTATGCTCCTGCTCGGGACTTTGCTGCTTACCGCCCACGCGCAAAGTTTTCTAGGAGCGCTGAAACCGCTGCC AACCTCCAAGACCCTAATCAGCTTTACAATGAATTGAACTTGGGACGCCGGGAGGAGTATGACGTCCTTGAGAAAAA GCGGGCTCGGGATCCAGAAATGGGCGGAAAGCAACAGAGGCGAAGAAATCCACAAGAGGGGGTCTATAACGCTCTTC AGAAAGATAAAATGGCTGAGGCATATAGCGAAATTGGGACCAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGACATGACGGG CTTTACCAGGGTTTGTCTACCGCAACAAAAGACACCTATGATGCTTTGCACATGCAAACACTGGCTCCTAGAGGATC CGGC SEQ  ID  NO:2CAR构建体的氨基酸序列： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSL TISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVS LPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSY AMDYWGQGTSVTVSSIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIW TNSRRNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVL EKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAP RGSG SEQ  ID  NO:3智人NR4A1多核苷酸序列 >12dna:染色体染色体：GRCh38:12:52022232:52060107:1 GenBank  RefSeq(mRNA)：NM_001202233；NM_001202234；NM_002135；NM_173157；NM_ 173158 GenBank  RefSeq(蛋白质)：NP_001189162；NP_001189163；NP_002126；NP_775180；NP_ 002126.2 SEQ  ID  NO:4智人NR4A2多核苷酸序列 >2dna:染色体染色体：GRCh38:2:156323832:156342948:-1 GenBank  RefSeq(mRNA)：NM_006186；NM_173171；NM_173172；NM_173173 GenBank  RefSeq(蛋白质)：NP_006177；NP_775265；NP_006177.1 SEQ  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RefSeq(mRNA)：NM_021803；NM_001207006 GenBank  RefSeq(蛋白质)：NP_001193935；NP_068575 83 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 1/41 页 图1A-1F 84 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 2/41 页 图2A-2G 85 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 3/41 页 图3A-3G 86 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 4/41 页 图4A–4D 87 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 5/41 页 图4E-4F 88 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 6/41 页 图5A-5B 89 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 7/41 页 图5C 90 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 8/41 页 图5D-5E 91 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 9/41 页 图5F 92 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 10/41 页 图6A-6D 93 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 11/41 页 图6E 图6F 94 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 12/41 页 图7A-7H 95 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 13/41 页 图8A-8C 96 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 14/41 页 图9 97 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 15/41 页 图10A 98 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 16/41 页 图10B 图10C 99 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 17/41 页 图11A-11B 100 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 18/41 页 图12A-12B 图12C 101 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 19/41 页 图13A-13C 102 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 20/41 页 图14A-14B 103 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 21/41 页 图14C-14D 图15A 104 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 22/41 页 图15B 105 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 23/41 页 图15C 106 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 24/41 页 图15D 107 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 25/41 页 图16A-16B 108 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 26/41 页 图17 109 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 27/41 页 图18A-18D 110 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 28/41 页 图19A-19B 图19C 111 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 29/41 页 图20A-20B 112 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 30/41 页 图21 113 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 31/41 页 图22A-22B 114 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 32/41 页 图22C-22D 图23A-23B 115 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 33/41 页 图24 图25 116 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 34/41 页 图26 图27 117 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 35/41 页 图28 图29 118 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 36/41 页 图30 119 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 37/41 页 图31 120 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 38/41 页 图31(续) 121 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 39/41 页 图31(续) 122 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 40/41 页 图31(续) 123 CN 111601882 A 说　明　书　附　图 41/41 页 图31(续) 124